Name: Screening dellinibitore della kinasi in microarray proteici umane auto-assemblati (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 22 s
Description: Scopri lo screening ad alto rendimento di inibitori di chinasi utilizzando microarray proteici NAPPA con espressione umana. Questo metodo consente l'analisi comparativa dell'attività inibitoria su multiple chinasi e varianti cliniche.

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Gli autori desiderano ringraziare tutti nel laboratorio di LaBaer per il loro aiuto e le critiche durante lo sviluppo del progetto. Questo progetto è stato sostenuto dalla sovvenzione NIH U01CA117374, U01AI077883 e Virginia G. Piper Foundation.

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<li>Bian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+the+Antibody+Immunome+in+Type+1+Diabetes+Using+Protein+Arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Tracking the Antibody Immunome in Type 1 Diabetes Using Protein Arrays.</a> Journal of Proteome Research. 16 (1), 195-203 (2017).</li>
<li>Song, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Antibody+Targets+for+Tuberculosis+Serology+using+High-Density+Nucleic+Acid+Programmable+Protein+Arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Identification of Antibody Targets for Tuberculosis Serology using High-Density Nucleic Acid Programmable Protein Arrays.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 16 (4 suppl 1), S277-S289 (2017).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+Study+of+Autoantibody+Responses+between+Lung+Adenocarcinoma+and+Benign+Pulmonary+Nodules%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thoracic+Oncology%22%5BJournal%5D)">Comparative Study of Autoantibody Responses between Lung Adenocarcinoma and Benign Pulmonary Nodules.</a> Journal of Thoracic Oncology. 11 (3), 334-345 (2016).</li>
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<li>Tang, Y., Qiu, J., Machner, M., LaBaer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovering+Protein-Protein+Interactions+Using+Nucleic+Acid+Programmable+Protein+Arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Discovering Protein-Protein Interactions Using Nucleic Acid Programmable Protein Arrays.</a> Current Protocols in Cell Biology. 74, 11-15 (2017).</li>
<li>Yu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Copper-catalyzed+azide-alkyne+cycloaddition+%28click+chemistry%29-based+detection+of+global+pathogen-host+AMPylation+on+self-assembled+human+protein+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Copper-catalyzed azide-alkyne cycloaddition (click chemistry)-based detection of global pathogen-host AMPylation on self-assembled human protein microarrays.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 13 (11), 3164-3176 (2014).</li>
<li>Anderson, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoantibody+signature+for+the+serologic+detection+of+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Autoantibody signature for the serologic detection of ovarian cancer.</a> Journal of Proteome Research. 14 (1), 578-586 (2015).</li>
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<li>Smith, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ibrutinib+in+B+lymphoid+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Pharmacotherapy%22%5BJournal%5D)">Ibrutinib in B lymphoid malignancies.</a> Expert Opinion on Pharmacotherapy. 16 (12), 1879-1887 (2015).</li>
<li>Festa, F., Steel, J., Bian, X., Labaer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+cloning+and+expression+library+creation+for+functional+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">High-throughput cloning and expression library creation for functional proteomics.</a> Proteomics. 13 (9), 1381-1399 (2013).</li>
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</ol>

Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.

Modifiche e risoluzione dei problemi Durante la fase di ottimizzazione dello studio dell'attività della chinasi sugli array NAPPA, una delle principali fonti di fondo e bassa gamma dinamica osservata è stata la BSA utilizzata sul mix di stampa. BSA stava fornendo le ammine primarie necessarie per il collegamento incrociato con la superficie dell'ammisornazione e stava intrappolando il DNA e l'anticorpo di cattura sul posto. Tuttavia, BSA è altamente fosforelato, rendendo difficile per il rilevamento del segnale di autoforsfororylation sull'array sopra il rumore di fondo. Per risolvere questo problema, sono state testate diverse alternative per BSA nella miscela di stampa e la poli-lysina è stata identificata come un buon sostituto. La polialisina manca di qualsiasi sito di fosforilio; pertanto, lo sfondo da matrici non espresse è molto minimo. Inoltre, i microarray stampati con polilisina sono riproducibili e mostrano buoni livelli di proteine (Figura 2).
La successiva modifica critica eseguita sul saggio standard NAPPA è stata l'aggiunta di una fase di trattamento Fosfobce/DNase. Il trattamento dei microarray con fosfofasi consente la rimozione di qualsiasi fosforilazione che si è verificato nel mix IVTT durante la sintesi e la cattura delle proteine (Figura 3). La fonte di questa fosforolante potrebbe essere da attività intrinseca di autoforosforelazione o dall'attività delle chinasi presenti nel mix IVTT. La rimozione di tutto il fosforo-espressione ha permesso una facile identificazione delle chinasi che sono attive e possono essere sottoposte all'autoforosfororylation (Figura 3).
Passaggi critici all'interno del protocollo NAPPA è una tecnologia robusta, ma come previsto, ci sono diversi passaggi critici. Il primo è l'acquisizione di DNA di alta qualità nella concentrazione appropriata. L'utilizzo di DNA di scarsa qualità o a basse concentrazioni genererà microarray di scarsa qualità con diverse caratteristiche non espresse e visualizzate nei livelli appropriati, diminuendo il numero di proteine analizzate sull'array. Il secondo passo critico è l'espressione delle proteine sul microarray. L'uso di un sistema IVTT che esprimerà alti livelli di proteine funzionali è fondamentale per studiare l'attività della chinasi sull'array.
Il prossimo passo critico sullo screening TKI è il modo in cui vengono gestiti i microarray. I microarray non devono asciugarsi durante qualsiasi fase del protocollo, e si raccomanda una manipolazione delicata per evitare graffi che possono aumentare il segnale di fondo. Poiché gli array dell'intero esperimento saranno confrontati tra loro, è importante assicurarsi che ogni fase di incubazione sia uniforme in tutte le diapositive. Ad esempio, il tempo necessario per eseguire un passaggio in una singola matrice deve essere preso in considerazione quando un batch di 20 matrici viene elaborato per evitare differenze nella lunghezza dell'incubazione tra le matrici.
Infine, la progettazione dell'esperimento e l'inclusione di controlli positivi e negativi sono fondamentali per il controllo della qualità e l'analisi dei dati. Il primo set di controlli sono quelli stampati in ogni matrice e includono controlli negativi [cioè punti vuoti (senza materiale stampato), acqua o vettore vuoto (esprimere solo il tag)], nonché un controllo positivo (cioè IgG purificato, che viene rilevato dal anticorpo secondario ed è inerte all'alterazione dei livelli di fosforo). Collettivamente, misurano i livelli di fondo del microarray, possibile riporto durante la stampa e l'intensità del segnale del metodo di rilevamento.
La serie successiva di controlli sono i controlli di screening dei farmaci e includono i microarray dephosphorylated e autofosforelazione (in presenza o assenza di DMSO). Come accennato in precedenza, il microarray dephosphorylated misura il livello di fosforo dopo il trattamento con fosfofore e quindi il livello di base per tutti gli altri esperimenti. Più basso è il livello di base, maggiore è la gamma dinamica dei saggi. Gli array autofosforili presentano i livelli massimi di fosforo di tutti gli array e il segnale deve essere forte e chiaro. Viene utilizzato per l'analisi dei dati, ma anche come controllo che tutte le reazioni sono state eseguite correttamente sulla matrice.
Limitazioni della tecnica Al momento, una delle limitazioni dello screening farmacologico qui presentato è la sua capacità di vagliare solo le chinasi proteiche che possono essere autofosfore. Un modo possibile per superare questo è quello di stampare una chinasi e substrato noto nello stesso punto. La co-stampa del DNA per due distinte proteine è stata realizzata con successo15, suggerendo la fattibilità di questo approccio. Inoltre, la proteina visualizzata sull'array potrebbe non essere piegata correttamente causando una proteina inattiva. L'uso del sistema di espressione basato sull'uomo ha fatto un miglioramento significativo dell'attività della chinasi misurata sulla matrice; tuttavia, alcune proteine non possono ancora essere analizzate sull'array a causa della sua inattività.
Una seconda limitazione è la misurazione del fosforilo utilizzando un anticorpo pan anti-phospho-tyr. Nonostante la sua non specificità per quanto riguarda il motivo del sito di fosfororylazione, tutte le fosfororylazioni misurate si sono verificate sui residui di tirosina, lasciando dietro di sé serine e treonine e le rispettive chinasi. Ad oggi, più di 10 anticorpi pan fospho-Ser/Thr sono stati testati senza successo, nonostante diversi tentativi di ottimizzare le condizioni di incubazione e lavaggio. Un nuovo sistema di rilevamento indipendente dagli anticorpi può essere l'opzione migliore per espandere il numero di chinasi proteiche che possono essere sottoposte a screening per l'inibizione dei farmaci. In questo contesto, sono disponibili alcune opzioni, tra cui la radioattività o approcci chimici come la coniugazione dei clic. Una serie di ottimizzazioni sono necessarie per ridurre al minimo il segnale di fondo e fornire una buona gamma dinamica per i saggi.
La terza limitazione è l'acquisizione di cloni cDNA da stampare sull'array. I cloni cDNA possono essere generati utilizzando qualsiasi tecnica di clonazione, inclusi sistemi di ricombinazione specifici del sito, ad esempio Creator o Gateway23. Un'altra opzione è quella di acquistare i cloni dalla libreria DNAsu, trovata all'indirizzo <https://dnasu.org/DNASU/Home.do>, dove più di 17.000 cloni cDNA, tra cui l'intero kino umano, è prontamente disponibile per essere utilizzato per la costruzione di array NAPPA24 .
La quarta limitazione è che non tutti i laboratori sono dotati di attrezzature appropriate per fabbricare e schermare i propri array NAPPA. Questo protocollo fornisce metodi alternativi per generare il DNA da stampare sul microarray, senza la necessità di apparecchiature ad alta velocità, e protocolli per eseguire manualmente tutti i passaggi di ibridazione. Tuttavia, l'accesso a uno scanner arrayer e microarray è ancora necessario. Un'opzione per risolvere questo problema consiste nell'utilizzare il servizio e la struttura di base NAPPA, disponibile all'indirizzo <http://nappaproteinarray.org/>, che distribuisce microarray NAPPA personalizzati a un prezzo accademico senza scopo di lucro. Infine, a partire da qualsiasi metodologia di screening, i dati ottenuti sugli array sono suscettibili di essere artefatti (positivi o negativi) e pertanto devono essere convalidati utilizzando saggi ortogonali.
Significato rispetto ai metodi esistenti Diverse piattaforme sono disponibili in commercio per lo screening delle chinasi proteiche. Un approccio usato di routine è i saggi vincolanti, che possono essere eseguiti con frammenti proteici, dominio chinasi, frammenti proteici più grandi con il dominio della chinasi e alcune regioni regolatorie, e persino proteine a lunghezza intera. Le proteine sono di solito espresse in sistemi batterici a causa del costo e della semplicità nei protocolli di espressione e purificazione. L'interazione tra il farmaco di interesse e la proteina viene quindi misurata con un qualche tipo di saggio di rapporto come la fluorescenza o la presenza di tag, per esempio. La principale limitazione di questo insieme di approcci è il fatto che la proteina non è necessariamente attiva durante l'interazione con il farmaco, il che può comportare l'identificazione di interazioni false positive e false negative. I frammenti proteici sono particolarmente vulnerabili ai cambiamenti nella conformazione e nella mancanza di attività e tutti i dati ottenuti dovrebbero essere convalidati utilizzando proteine attive, preferibilmente nella loro forma completa. Un'altra limitazione di alcune piattaforme è la capacità di schermare solo gli analoghi ATP, limitandone l'uso complessivo.
La maggior parte dei servizi disponibili in commercio per lo screening dei TCI utilizzando approcci basati enzimatici utilizzano solo versioni di tipo selvaggio della chinasi di interesse, e talvolta solo pochi mutanti selezionati. Sapendo che la resistenza ai farmaci è molto comune nei pazienti trattati con TKI, è importante essere in grado di misurare la risposta dei farmaci in diversi mutanti, per la selezione dell'inibitore più appropriato. A causa della natura di NAPPA, lo screening dei mutanti di chinasi è semplice e può essere facilmente realizzato, e l'unico strumento necessario è l'incorporazione della mutante chinasi nella collezione cDNA NAPPA, che può essere eseguita da mutagenesi site-specific, per esempio.
Applicazioni future Una delle forme più comuni di trattamento traslano nella terapia del cancro usando inibitori della chinasi è l'acquisizione di mutazioni nel bersaglio farmacologico durante un ciclo di trattamento. Lo screening di questi mutanti per quanto riguarda la loro risposta agli inibitori della chinasi è di vitale importanza per la selezione di seconda/terza generazione di TCI per ottenere un trattamento personalizzato per ogni paziente. L'approccio allo screening farmacologico qui presentato fornisce una piattaforma di screening imparziale in cui qualsiasi inibitore della chinasi tirosina può essere testato contro un pannello di chinasi tirosina presenti nel genoma umano. Poiché le proteine visualizzate sugli array NAPPA sono espresse in vitro dal cDNA stampato sulla diapositiva, qualsiasi variante mutante può essere facilmente incorporata nella collezione cDNA per essere visualizzata sull'array. La struttura in cui i mutanti chinasi possono essere generati ed espressi sulla matrice, combinata con il potere ad alto consumo della tecnica NAPPA, fornisce un ambiente unico per lo studio dei mutanti di chinasi e la loro risposta alle droghe, rendendo NAPPA adatto per screening farmacologico personalizzato, uno degli obiettivi della medicina di precisione.

Le chinasi proteiche sono responsabili della fosforilazione dei loro bersagli e possono modulare vie molecolari complesse che controllano molte funzioni cellulari (cioè la proliferazione cellulare, la differenziazione, la morte cellulare e la sopravvivenza). La deregolazione dell'attività della chinasi è associata a più di 400 malattie, rendendo gli inibitori della chinasi una delle principali classi di farmaci disponibili per il trattamento di diverse malattie, tra cui il cancro, i disturbi cardiovascolari e neurologici, nonché i disturbi infiammatori e malattie autoimmuni1,2,3.
Con l'avvento della medicina di precisione, l'identificazione di nuove terapie, in particolare gli inibitori della chinasi, ha un grande fascino farmaceutico e clinico. Diversi approcci possono essere utilizzati per l'identificazione di possibili nuove coppie di inibitori della chinasi/ellissi, tra cui la progettazione de novo di inibitori della chinasi e l'identificazione di nuovi bersagli per i farmaci esistenti approvati dalla FDA. Quest'ultimo è particolarmente attraente, dal momento che il tempo e il denaro necessari per implementare questi farmaci nelle cliniche sono drasticamente ridotti a causa della disponibilità di precedenti dati di sperimentazione clinica. Un esempio canonico del riutilizzo di un inibitore della chinasi è l'imatinib, inizialmente progettato per il trattamento della leucemia mieloziana cronica (CML) attraverso l'inibizione di BCR-Abl, che può anche essere utilizzata con successo per il trattamento di tumori stromali gastrointestinali (GIIST)4,5,6,7.
Lo screening degli inibitori della chinasi può essere eseguito in saggi vincolanti o saggi enzimatici. La prima classe di analisi si concentra sulle interazioni proteina-farmaco e può fornire informazioni come il sito di ligazione e l'affinità. Poiché l'attività della chinasi al momento di questi saggi è sconosciuta, una serie di interazioni può essere persa o erroneamente identificata a causa di cambiamenti conformazionali nella proteina. D'altra parte, i saggi a base enzimatica richiedono che le chinasi proteiche siano attive e forniscano informazioni preziose sull'effetto dell'inibitore sull'attività enzimatica, tuttavia, questo tipo di screening è generalmente più dispendioso in termini di tempo e denaro. Attualmente, entrambi i tipi di saggi sono disponibili in commercio da diverse fonti. Essi rappresentano un'opzione affidabile per lo screening degli inibitori della chinasi con alcune limitazioni, tra cui: I) la maggior parte dei metodi comporta la sperimentazione di più chinasi individualmente, che può rendere costoso lo screening di un ampio insieme di proteine; II) l'insieme delle chinasi da testare è limitato a un elenco di chinasi preselezionate e wild-type e diverse versioni mutate ben note di alcune chinasi, ostacolando il test di molte nuove isoforme mutate.
In questo contesto, i microarray proteici sono una potente piattaforma in grado di superare alcune delle limitazioni presentate dalle tecniche disponibili in commercio. È adatto per eseguire saggi a base enzimatica nello screening ad alto rendimento utilizzando proteine attive a lunghezza intera di qualsiasi sequenza di interesse. I microarray possono essere generati da un approccio auto-assemblato come NAPPA (nucleic acid programmable protein array), in cui le proteine sono espresse appena in tempo per i test, aumentando la probabilità che quelli visualizzati sulla matrice siano effettivamente attivi. Le proteine visualizzate su NAPPA sono prodotte utilizzando ribosomi derivati dall'uomo e proteine chaperone al fine di migliorare la probabilità di piegamento naturale e attività.
Le proteine sono inizialmente programmate stampando cDNA codificando per geni di interesse fusi con un tag di cattura, insieme a un agente di cattura, sulla superficie del microarray. Le proteine vengono quindi prodotte sui microarray utilizzando un sistema di trascrizione e traduzione in vitro (IVTT) e le proteine appena espresse vengono immobilizzate sulla superficie del microarray dall'agente di cattura. Gli array NAPPA espressi possono essere utilizzati per lo studio delle proteine visualizzate sull'array in modo imparziale e ad alto contenuto di velocitàeffettiva 8,9.
In precedenza, è stato dimostrato che le proteine visualizzate sugli array NAPPA sono piegate correttamente per interagire con partner noti10; inoltre, la loro attività enzimatica è stata sfruttata per la prima volta nel 2018, quando è stato dimostrato che le chinasi proteiche visualizzate sul microarray autofosforetale11. Ad oggi, la metodologia NAPPA è stata utilizzata per molte applicazioni distinte, tra cui la scoperta di biomarcatori12,13,14,15,16,17, interazioni proteina-proteina10,18, identificazione del substrato19e screening farmacologico11. La sua flessibilità è una delle caratteristiche chiave della piattaforma che consente l'adattamento a ogni applicazione.
Qui, viene presentato un protocollo per lo screening degli inibitori della tirosina della chinasi in array NAPPA auto-assemblati. La piattaforma è ottimizzata per la visualizzazione delle chinasi delle proteine umane attive e per l'analisi dell'attività della chinasi proteica, con basso background e alta gamma dinamica. Tra le modifiche implementate per utilizzare NAPPA per lo screening degli inibitori della chinasi includono: I) cambiamenti nella chimica della stampa, II) de-phophorylation del microarray proteico prima dello screening dell'inibitore della chinasi, e III) ottimizzazione del rilevamento del proteine fosforolate sulla matrice. Questo protocollo è il primo nel suo genere e fornisce informazioni uniche sullo studio della chinasi nei microarray NAPPA.

<table><tbody><tr><td>Reagent/Material</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Piastre a 364 pozzetti (per arraying)</td><td>Genetix</td><td>x7020</td><td></td></tr><tr><td>800 &micro; Piastra di raccolta a 96 pozzetti</td><td>L Abgene</td><td>AB-0859</td><td></td></tr><tr><td>Dispositivo a 96 pin</td><td>Boekel</td><td>140500</td><td></td></tr><tr><td>Acido acetico</td><td>Millipore-Sigma</td><td>1.00066</td><td></td></tr><tr><td>Acetone 99,9%</td><td>Millipore Sigma</td><td>650501</td><td></td></tr><tr><td>Guarnizione in alluminio per piastre a 96 pozzetti</td><td>VWR</td><td>76004-236</td><td></td></tr><tr><td>Aminosilano (3-amminopropiltrietossisilano)</td><td>Pierce</td><td>80370</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo M2 ANTI-FLAG prodotto nel topo</td><td>Millipore Sigma</td><td>F3165</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-Flag rabbit (policlonale)</td><td>Millipore Sigma</td><td>F7425</td><td></td></tr><tr><td>ATP 10 mM</td><td>Cell Signaling</td><td>9804S</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Glicerofosfato sale disodico idrato</td><td>Millipore-Sigma</td><td>G9422</td><td></td></tr><tr><td>agar batteriologico</td><td>VWR</td><td>97064-336</td><td></td></tr><tr><td>Tampone di blocco</td><td>ThermoFisher/Pierce</td><td>37535</td><td></td></tr><tr><td>Brij 35</td><td>ThermoFisher/Pierce</td><td>BP345-500</td><td></td></tr><tr><td>BS3 (bis-sulfosuccinimidyl)</td><td>ThermoFisher/Pierce</td><td>21580</td><td></td></tr><tr><td>BSA (albumina sierica bovina)</td><td>Millipore Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Vetrino coprioggetti 24 x 60 mm</td><td>VWR</td><td>48393-106</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-165-150</td><td></td></tr><tr><td>DeepWell Block, confezione da 50</td><td>ThermoFisher/AbGene</td><td>AB-0661</td><td></td></tr><tr><td>DEPC acqua</td><td>Ambion</td><td>9906</td><td></td></tr><tr><td>DMSO (dimetilsolfossido)</td><td>Millipore-Sigma</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Colorante intercalante del DNA</td><td>Invitrogen</td><td>P11495</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Millipore-Sigma</td><td>AMPD1-1KT</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Millipore-Sigma</td><td>43816</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Millipore-Sigma</td><td>EDS</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo 200 proof</td><td>Millipore-Sigma</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Piastre filtranti</td><td>Millipore-Sigma</td><td>WHA77002804</td><td></td></tr><tr><td>Guarnizioni permeabili ai gas, scatola da 50</td><td>ThermoFisher/AbGene</td><td>AB-0718</td><td></td></tr><tr><td>Scatola di vetro</td><td>Wheaton</td><td>900201</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini</td><td>VWR</td><td>48300-047</td><td></td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td>Millipore-Sigma</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>HCl (acido cloridrico)</td><td>Millipore-Sigma</td><td>H1758</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione tampone HEPES</td><td>Millipore-Sigma</td><td>83264</td><td></td></tr><tr><td>Sistema IVTT a base umana</td><td>Thermo Scientific</td><td>88882</td><td></td></tr><tr><td>ImmunoPure Mouse IgG intera molecola</td><td>ThermoFisher/Pierce</td><td>31202</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanolo</td><td>Millipore-Sigma</td><td>I9516</td><td></td></tr><tr><td>KCl (Cloruro di potassio)</td><td>Millipore-Sigma</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4(Potassio fosfato monobasico)</td><td>Millipore-Sigma</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>Tampone chinasico</td><td>Segnalazione cellulare</td><td>9802</td><td></td></tr><tr><td>KOAc (acetato di potassio)</td><td>Millipore-Sigma</td><td>P1190</td><td></td></tr><tr><td>Lambda Protein Phosphatase</td><td>new england biolabs</td><td>P0753</td><td></td></tr><tr><td>Lifterslips, 24 x 60 mm</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25X60I24789001LS</td><td></td></tr><tr><td>Rack in metallo a 30 vetrini senza maniglie</td><td>Wheaton</td><td>900234</td><td></td></tr><tr><td>MgCL2 (Cloruro di magnesio)</td><td>Millipore-Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Na3VO4 (Ortovanadato di sodio)</td><td>Millipore-Sigma</td><td>S6508</td><td></td></tr><tr><td>NaCl (Cloruro di sodio)</td><td>Millipore-Sigma</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>NaOAc (Acetato di sodio)</td><td>Millipore-Sigma</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>NaOH (Idrossido di sodio)</td><td>Millipore-Sigma</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>NucleoBond Xtra Midi / Maxi</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740410.10 / 740414.10</td><td></td></tr><tr><td>Nucleoprep Anion II</td><td>Macherey Nagel</td><td>740503.1</td><td></td></tr><tr><td>Acido fosforico</td><td>Millipore-Sigma</td><td>79617</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di poli-L-lisina (0,01%)</td><td>Millipore-Sigma</td><td>A-005-C</td><td></td></tr><tr><td>Proteina Fosfatasi (Lambda)</td><td>New England Biolabs</td><td>P0753</td><td></td></tr><tr><td>RNAse</td><td>Invitrogen</td><td>12091021</td><td></td></tr><tr><td>SDS (Sodio dodecil solfato)</td><td>Millipore-Sigma</td><td>L6026</td><td></td></tr><tr><td>SDS (Sodio dodecil solfato)</td><td>Millipore-Sigma</td><td>05030</td><td></td></tr><tr><td>Guarnizione di tenuta</td><td>Grace Bio-Labs, Inc</td><td>44904</td><td></td></tr><tr><td>Pacchetti di silice</td><td>VWR</td><td>100489-246</td><td></td></tr><tr><td>Piastra a pozzetto singolo</td><td>ThermoFisher/Nalge Nunc</td><td>242811</td><td></td></tr><tr><td>Acetato di sodio (3M, pH 5,5)</td><td>Millipore-Sigma</td><td>71196</td><td></td></tr><tr><td>TB media (Terrific Broth)</td><td>Millipore-Sigma</td><td>T0918</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>IBI scientific</td><td>IB70144</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Millipore-Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Millipore-Sigma</td><td>T7293</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Millipore-Sigma</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>Estratto di lievito</td><td>Millipore-Sigma</td><td>Y1625</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Equipments</td><td>Maker/ modello</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubatore di raffreddamento programmabile</td><td>Torrey Pines IN30 Incubatore con agitatore di raffreddamento</td><td></td><td></td></tr><tr><td>per la crescita batterica</td><td>Agitatore</td><td></td><td></td>ATR Multitron</tr><tr><td>Collettore per vuoto con trappola per rifiuti liquidi</td><td>MultiScreenCollettore per vuoto a 96 pozzetti</td> Autopippetor/gestore di liquidi a 96 pozzetti <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Genmate o Biomek FX</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dosatore di liquidi</td><td>Microarrayer di DNA Wellmate</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Genetix QArray2</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stazione di ibridazione automatica</td><td>Stazione di ibridazione</td><td></td><td></td>Tecan HS4800 Pro</tr><tr><td>Scanner di microarray</td><td>Tecan PowerScanner</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Quantificazione dei dati di microarray</td><td>Tecan Array-ProAnalyzer 6.3</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

screening dell'inibitore della kinasi in microarray proteici umane auto-assemblati

Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays

Lo screening degli inibitori della chinasi è fondamentale per comprendere meglio le proprietà di un farmaco e per l'identificazione di potenziali nuovi obiettivi con implicazioni cliniche. Diverse metodologie sono state segnalate per realizzare tale screening. Tuttavia, ciascuno ha i suoi limiti (ad esempio, lo screening di solo analoghi ATP, la restrizione all'uso di domini di chinasi purificati, costi significativi associati al test più di un paio di chinasi alla volta e la mancanza di flessibilità nello screening delle parentesi proteiche con nuove mutazioni). Qui, viene presentato un nuovo protocollo che supera alcuni di questi limiti e può essere utilizzato per lo screening imparziale degli inibitori della chinasi. Un punto di forza di questo metodo è la sua capacità di confrontare l'attività degli inibitori della chinasi su più proteine, tra diverse chinasi o varianti diverse della stessa chinasi. Vengono impiegati microarray proteici autoassemblati generati attraverso l'espressione di chinasi proteiche da un sistema umano di trascrizione e traduzione in vitro (IVTT). Le proteine visualizzate sul microarray sono attive, consentendo la misurazione degli effetti degli inibitori della chinasi. La procedura seguente descrive in dettaglio i passaggi del protocollo, dalla generazione e lo screening di microarray all'analisi dei dati.

I microarray NAPPA auto-assemblati forniscono una solida piattaforma che può essere utilizzata per molte applicazioni distinte, tra cui la scoperta di biomarcatori, le interazioni proteina-proteina, l'identificazione del substrato e lo screening farmacologico10,11 ,12,13,14,15,16,17,18,19,20.
La metodologia complessiva adottata per lo studio dell'attività della chinasi e lo screening degli inibitori della chinasi tirosina sui microarray NAPPA è schematicamente rappresentata nella Figura 1. In primo luogo, i microarray NAPPA sono generati dall'immobilizzazione del cDNA e dell'agente di cattura sui microarray rivestiti. I cDNA vengono quindi utilizzati come modello per la trascrizione e la traduzione delle proteine, utilizzando un sistema IVTT basato sull'uomo, e le proteine appena sintetizzate vengono immobilizzate dall'agente di cattura9. La qualità del microarray stampato può essere monitorata misurando i livelli di DNA (confermando una stampa coerente) o di proteina visualizzati sull'array (confermando l'espressione e la cattura delle proteine; Figura 1). Per diminuire il segnale di fondo e aumentare la gamma dinamica dell'esperimento, i microarray sono trattati con 1) fosfosasi lambda per rimuovere il fosforo dai residui di Ser/Thr/Tyr, quindi con 2) DNase per semplificare la chimica sul posto e diminuire sfondo (Figura 1).
Il passo successivo è la reazione dell'autofosfororylazione, in cui i microarray vengono incubati con tampone di chinasi in assenza di ATP (matrice di controllo negativo, definita microarray dephosphorylated), e il buffer di chinasi è integrato con ATP (controllo positivo, come array autofosforolilati) o ATP - DMSO (controllo del veicolo). Va sottolineato che durante questo passaggio non viene aggiunta alcuna chinasi; pertanto, l'attività intrinseca di ogni chinasi visualizzata sul microarray viene quantificata attraverso la misurazione dei suoi livelli di fosforolalazione utilizzando un anticorpo anti-fosforo-tirosina seguito da un anticorpo secondario ci3-labbeled (Figura 1).
Il controllo di qualità degli array NAPPA-kinase che visualizzano un pannello di chinasi proteiche umane stampate in quadruplicato è illustrato nella Figura 2. I livelli di DNA immobilizzato sono stati misurati dalla colorazione del DNA e hanno mostrato un segnale uniforme attraverso il microarray, suggerendo che la quantità di DNA stampato sull'array era uniforme. È anche possibile osservare diverse caratteristiche senza alcuna colorazione del DNA. Queste caratteristiche corrispondono ad alcuni controlli in cui il DNA è stato omesso dal mix di stampa [cioè, macchie vuote (niente è stato stampato), macchie d'acqua, spot IgG purificato (poli-lysina, crosslinker e IgG purificato), solo mix di stampa (mix di stampa completo: poli-lisina più crosslinker e anticorpo anti-bandiera, senza DNA)]. I livelli di proteine visualizzati sui microarray NAPPA-kinase sono stati valutati dopo la reazione IVTT usando anticorpi antitag.
Per lo screening della chinasi, Flag è stato utilizzato come tag di scelta e il livello di proteina visualizzato sul microarray è stato misurato utilizzando un anticorpo anti-bandiera. Come mostrato, la maggior parte dei punti contenenti cDNA ha mostrato con successo livelli rilevabili di proteine. Alcuni dei punti di controllo senza cDNA hanno anche rivelato il segnale con l'anticorpo anti-bandiera: spot IgG (utilizzato per rilevare l'attività dell'anticorpo secondario) e macchie vettoriali vuote (codici cDNA solo per il tag) (Figura 2). I microarray NAPPA-kinase hanno mostrato una buona riproducibilità tra i vetrini, con la correlazione dei livelli di visualizzazione delle proteine tra lotti di stampa distinti superiori a 0,88 (Figura 2). All'interno dello stesso batch la correlazione era ancora più alta, vicina a 0,92 (dati non mostrati).
Successivamente, l'attività di autofosforilazione della chinasi delle proteine visualizzate sull'array è stata misurata utilizzando anticorpi anti-fosforo-tirosina (Figura 3). Le proteine visualizzate sull'array hanno mostrato alti livelli di fosforo lamierelazione delle proteine dopo l'espressione (Figura 3, a sinistra), che possono essere causati dall'attività intrinseca della chinasi della proteina visualizzata sull'array o dalle chinasi attive presenti nel mix IVTT. Questa fosforolalazione è stata completamente rimossa con il trattamento con fosfofasi lambda e questi microarray sono stati utilizzati per i test della chinasi. Dopo la depfororylazione, le reazioni di autofosfororylazione eseguite senza ATP non hanno mostrato livelli significativi di fosfororylazione, come previsto, mentre i microarray incubati con buffer di chinasi in presenza di ATP hanno mostrato la fosfororylazione proteica a partire da 15 min ( Figura 3). Per lo screening farmacologico, l'attività della chinasi è stata misurata dopo 60 min di reazione all'autoforsfororylazione per massimizzare il numero di chinasi testate.
Il confronto tra microarray in cui i livelli di fosforiliato sono stati misurati subito dopo l'espressione proteica (Figura 3, sinistra) e dopo 60 minuti di reazione all'autoforforosforilazione (Figura 3,destra) ha mostrato: i) proteine fosforelate solo dopo l'espressione, suggerendo che possono essere esogenamente fosforilati dalle proteine presenti sul mix IVTT, ma non possono essere autoforsinfolilate; ii) il fosforilato proteico solo dopo la reazione dell'autofosfororylazione, suggerendo che queste proteine non erano attive dopo l'espressione della proteina e richiedevano l'attività di co-fattori presenti nel tampone della chinasi; o iii) fosforalato proteico su entrambi gli array, suggerendo che fossero attivi in entrambe le impostazioni (Figura 3).
Come esempio dei risultati ottenuti per lo screening degli inibitori della tirosina della chinasi sugli array NAPPA-kinase sono stati utilizzati tre inibitori delle chinasi con distinta selettività tra le chinasi proteiche: staurosporina, imatinib e ibrutinib. Per tutti gli screening, microarray NAPPA dephosforrylati sono stati incubati con crescenti concentrazioni di TKI (che vanno da 100 nM a 10 uM) durante la reazione di autofosfororylazione. Il primo TKI testato è stata la staurosporina, un inibitore della chinasi proteica globale, che ha mostrato una potente inibizione della chinasi sul microarray in quasi tutte le chinasi testate11.
Successivamente, è stato testato l'imatinib, un inibitore ABL e c-Kit utilizzato per il trattamento della leucemia mielocericronica cronica e dei tumori stromali gastrointestinali4,5,6,7. Sugli array NAPPA-kinase imatinib ha mostrato una significativa riduzione dell'attività Abl1 e BCR-Abl1, mentre altre chinasi sono rimaste per lo più inalterate (Figura 4A). La quantificazione dei dati per l'attività della chinasi è stata normalizzata rispetto all'array dephosphorylated e rappresentata come percentuale del microarray di controllo positivo (solo veicolo). I dati per TNK2 (chinasi non rilevante), Abl1 e BCR-Abl1 sono illustrati nella figura 4B. Come previsto, imatinib ha mostrato un'inibizione selettiva nei confronti di Abl1 e BCR-ABl1. I dati per c-Kit erano inconcludenti a causa della mancanza di attività sugli array di controllo positivi.
Infine, ibrutinib, un inibitore covalente approvato dalla FDA della chinasi di tirosina di Bruton (BTK), è stato testato. Ibrutinib è attualmente utilizzato nel trattamento di diversi tumori correlati al sangue con BTK iperattivo, tra cui leucemia linfocitica cronica (CLL), linfoma delle cellule del mantello e macroglobulinemia21diWaldenstr'm,22. Figura 4C, è rappresentativo dei risultati tipici ottenuti per lo screening ibrutinib. L'attività della chinasi di ABL1 (chinasi non rilevante) e BTK (bersaglio canonico) ed ERBB4 (potenziale nuovo obiettivo) è illustrata nella figura 4D. I dati suggeriscono che ERBB4 può essere inibito da ibrutinib in modo specifico della dose. Questa inibizione è stata confermata in vitro e nei saggi a base cellulare11, dimostrando la potenza di questa piattaforma.
Nel loro insieme, i dati suggeriscono che la piattaforma di microarray NAPPA-kinase potrebbe essere utilizzata per lo screening imparziale degli inibitori del TK. Inoltre, lo screening è veloce e può essere facilmente personalizzato per includere qualsiasi variazione delle chinasi proteiche di interesse.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59886/59886fig1.jpg"> Figura 1: Rappresentazione schematica del controllo di qualità e screening degli inibitori della cinesi nelle matrici NAPPA. Gli array NAPPA sono stampati con codifica cDNA per la proteina di interesse fusa con un tag e un anticorpo di cattura. Durante la trascrizione in vitro e la reazione di traduzione (IVTT) le proteine sintetizzate vengono catturate sulla superficie del microarray attraverso il tag dall'anticorpo di cattura. Il controllo qualità (QC) degli array viene eseguito dalla misurazione dei livelli di DNA stampati sul vetrino, utilizzando un colorante fluorescente di intercalazione del DNA e i livelli di proteine visualizzati sull'array utilizzando anticorpi specifici del tag. Per lo screening della chinasi, i microarray vengono trattati con DNase e fosfosi, dopo la reazione IVTT, per rimuovere il DNA stampato e tutta la fosforolalazione che potrebbe essersi verificata durante la sintesi proteica. Gli array sforphorylated sono ora pronti per essere utilizzati per lo schermo della droga. Per ogni analisi, vengono regolarmente utilizzati tre set di controlli: (I) array dephosphorylated, in cui la reazione di autofosfororylazione viene eseguita senza ATP; (II) microarray autofosforolati, in cui la reazione all'autofosfororylazione viene eseguita in presenza di ATP; e (III) Matrice trattata DMSO (veicolo), in cui la reazione all'autofosfororylazione viene eseguita con ATP e DMSO. I vetrini trattati con una diversa concentrazione di inibitori della chinasi seguono esattamente lo stesso protocollo utilizzato per gli array trattati con DMSO. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59886/59886fig1large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59886/59886fig2.jpg"> Figura 2: Risultati rappresentativi del controllo qualità per gli array NAPPA-kinase auto-assemblati. Vengono mostrati il contenuto di DNA misurato da un colorante fluorescente che intercalazione del DNA (a sinistra) e i livelli di proteine visualizzati sul microarray misurati dall'anticorpo anti-Bandiera (al centro). Sul lato destro c'è un grafico di correlazione dei livelli di proteine visualizzati su due array NAPPA-kinase stampati in lotti separati. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59886/59886fig2large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59886/59886fig3.jpg"> Figura 3: Risultati rappresentativi dell'attività della chinasi negli array NAPPA-kinase. I microarray che mostrano chinasi proteiche in quadruplicato sono stati utilizzati per studiare l'attività della chinasi proteica sull'array attraverso la misurazione della fosforolante delle proteine utilizzando anticorpi anti-pTyr, seguiti da anticorpi antito-topolino con etichetta ci3. Gli array di controllo senza trattamento fosfopobce/DNase e senza ATP durante la reazione all'autoforosforo piano sono stati utilizzati per misurare la fosforilazione di fondo dopo l'espressione proteica (post-espressione). I microarray rimanenti sono stati trattati con fosfoculoe/DNA, e la reazione di autofosfororylazione è stata eseguita senza ATP (microarray dephosphorylated, controllo negativo) o con ATP (microarray autofosforillati). Per i microarray autofosforiliati la reazione dell'autoforsfororylazione è stata eseguita per 15 min, 30 min, 45 min o 60 min, come mostrato. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59886/59886fig3large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59886/59886fig4.jpg"> Figura 4: Dati rappresentativi dalla schermata della chinasi della tirosina sugli array NAPPA-kinase. (A) Gli array NAPPA-kinase trattati con fosfofosi sono stati incubati in crescenti concentrazioni di imatinib durante la reazione all'autofosfororylazione e l'attività della chinasi è stata misurata con anti-phospho-anticorpi. (B) Quantificazione dell'attività della chinasi osservata sugli array NAPPA-kinasi esposti all'imatinib. I dati sono stati normalizzati contro il segnale degli array di controllo negativo (dephosphorylated) ed è mostrato come percentuale degli array di controllo positivi (reazione di autofosporylazione eseguita in presenza di DMSO). Dati simili vengono visualizzati per lo screening di ibrutinib (C,D). Questa cifra è stata modificata da Rauf et al.11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59886/59886fig4large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
File supplementare 1. Protocollo alternativo per lo screening degli inibitori della chinasi della tirosina negli array NAPPA utilizzando una stazione di ibridazione automatizzata. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59886/Supplementary_File_1_Festa_and_Labaer.docx">Fare clic qui per scaricare questo file.</a>

Viene presentato un protocollo dettagliato per la generazione di microarray proteici umani auto-assemblati per lo screening degli inibitori della chinasi.

Screening dell'inibitore della kinasi in microarray proteici umane auto-assemblati

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with ...

NAPPA è una potente piattaforma di microarray proteico che può essere utilizzata per lo studio dell'attività e della funzione proteica in modo imparziale ad alta produttività. Le proteine esposte sul NAPPA sono prodotte in un sistema di espressione a base umana utilizzando ribosomi e chaperones derivati dall'uomo al fine di migliorare la probabilità di piegatura e attività naturali. L'uso di array NAPPA per lo screening degli inibitori della chinasi fornisce una nuova piattaforma per il test di nuovi farmaci e mutazioni della chinasi clinicamente rilevanti.I microarray proteici generati dalla metodologia NAPPA possono essere utilizzati per molte applicazioni distinte, tra cui la scoperta di biomarcatori, interazioni proteina-proteina, identificazione del substrato e screening farmacologico. Eseguire passaggi di controllo qualità lungo il percorso. Prova la qualità della preparazione del DNA, il microarray di DNA e il microarray proteico.Se in qualche passo la qualità non è buona, ricominciare da capo. A dimostrare la procedura sarà Lisa Miller, un tecnico del mio laboratorio. Per preparare la crescita batterica per la mini-preparazione ad alta produttività in casa, inoculare prima i batteri nella piastra della coclea in un formato di pozzo 96 e lasciarla crescere per 16 ore.Il giorno dopo, riempire ogni pozzo della piastra del pozzo profondo con 1,5 millilitri di formidabile mezzo brodo, integrato con ampicillina anticorpale. L'anticorpo dipende dal marcatore di selezione sul plasmide. Quindi, sterilizzare un dispositivo a 96 pin con 80% di etanolo e fiamma.Utilizzare il dispositivo sterile a 96 pin per raccogliere le colonie dalla piastra di agar incubata durante la notte e immergersi nei pozzi della piastra del pozzo profondo per inoculare la coltura. Coprire il blocco con una guarnizione permeabile al gas e incubare su uno shaker per 22-24 ore a 37 gradi Celsius e da 300 a 800 giri/min. Successivamente, le colture di pellet e rimovano le colture secondo il manoscritto.Batteri lyse aggiungendo 200 microlitri di soluzione due in ogni pozzo, sigillare la piastra con una guarnizione in alluminio e invertire cinque volte. Incubare le cellule per esattamente cinque minuti. Per neutralizzare la soluzione, aggiungere 200 microlitri della soluzione tre, sigillare la piastra con una guarnizione in alluminio e invertire cinque volte.Quindi, ruotare la piastra a 3800 G, quattro gradi Celsius, per 30 minuti per cancellare il supernatante lisato. Per preparare le lastre di resina a scambio di anione, in primo luogo, mescolare il liquame di scambio di anione e versare il liquame in un trogolo di vetro. Impilare le piastre filtranti sopra una piastra profonda per fungere da recipiente per la raccolta dei rifiuti.Quindi, utilizzando punte P1000 a scheda larga, mescolare il liquame e trasferire 450 microlitri del liquame in ogni pozzo delle piastre filtranti. Centrifugare e scartare il flusso. Ora, trasferire i supernatanti di lysate nella pila di piastra di resina e nel blocco profondo del pozzo.Ruotare le piastre impilate per cinque minuti a 30 volte G con la velocità di rampa più lenta e scartare il flusso. Per lavare la colonna, aggiungere 400 microlitri della soluzione N3 tampone di lavaggio ad ogni pozzo. Trasferire la piastra di resina nel collettore sottovuoto per rimuovere il tampone di lavaggio.Ripetere la fase di lavaggio tre volte e quindi rimuovere il tampone della lavatrice rimanente con un breve giro di cinque minuti a 30 volte G.To elute il DNA, posizionare la piastra di resina su una piastra di raccolta pulita di 800 microlitri. Aggiungere 300 microlitri di soluzione N5 ad ogni pozzo e lasciarlo riposare a temperatura ambiente per dieci minuti. Quindi, ruotare le piastre impilate per cinque minuti a 20 volte G con una velocità di rampa lenta fino a 233 volte G per un minuto.Conservare le lastre a -20 gradi Celsius prima dell'uso. In primo luogo, posizionare gli scivoli su un rack e immergere gli scivoli in un serbatoio di vetro contenente la soluzione di rivestimento del reagente al 2%amminosilano in acetone. Dondolare gli scivoli per 15 minuti.Quindi, sciacquare gli scivoli in acetone seguito da un risciacquo finale in acqua. Quindi, asciugare i vetrini utilizzando aria sotto pressione. Soffiare su di loro da tutte le angolazioni per circa tre minuti fino a quando tutte le goccioline d'acqua sono state rimosse.Conservare gli scivoli rivestiti a temperatura ambiente su un rack metallico all'interno di una scatola ben sigillata. Ora, procedete a far precipitare il DNA come descritto nel manoscritto. Quindi, rimescolare il pellet di DNA in 20 microlitri di acqua ultrapura e agitare a 1000 giri/min per due ore.Per preparare il campione di array, aggiungere 10 microlitri di miscela di stampa appena preparata che contiene l'anticorpo, il reticolo e la polilisina a ciascun campione di DNA. Sigillare le piastre con un foglio di alluminio e agitare a temperatura ambiente per 90 minuti a 1000 giri/min. Conservare i piatti durante la notte a quattro gradi Celsius.Il giorno della stampa, vortice brevemente e girare le piastre. Trasferire 28 microlitri di ciascun campione su una piastra da 384 pozza. Posizionare le diapositive rivestite con amminosilano e la piastra del pozzo 384, sul ponte dell'arrayer, e avviare il programma di stampa microarray.Al termine della stampa, etichettare i microarray. I microarray possono essere conservati per mesi fino a un ulteriore utilizzo. Per misurare i livelli di DNA, posizionare le diapositive in una scatola di pipetta e bloccarle con 50 millilitri di tampone di blocco.Incubare gli scivoli su uno shaker a dondolo a temperatura ambiente per un'ora. Quindi, scartare la soluzione e aggiungere 20 millilitri di tampone di blocco e 33 microlitri di colorante intercalante fluorescente del DNA. Incubare per 15 minuti con agitazione.Al termine dell'incubazione, sciacquare rapidamente gli scivoli con acqua ultra pura e asciugare con aria a pressione. I microarray sono pronti per essere scansionati. Per esprimere i microarray, bloccare le diapositive come mostrato in precedenza e quindi risciacquarle con acqua ultra pura e asciugare con aria compressa filtrata.Attaccare una guarnizione di tenuta a ogni diapositiva. Aggiungere 130 millilitri di trascrizione e traduzione in vitro mescolare sulle diapositive e massaggiare delicatamente le guarnizioni di tenuta in modo che il mix di trascrizione e traduzione in vitro si diffonda e copra l'intera area dell'array senza bolle. Applicare le piccole guarnizioni rotonde delle porte su entrambe le porte.Incubare per 90 minuti a 30 gradi Celsius per l'espressione proteica, seguita da 30 minuti a 15 gradi Celsius per l'immobilizzazione della proteina di query. Quindi, rimuovere la guarnizione, lavare gli scivoli tre volte per cinque minuti ciascuno in 15 millilitri TBST con latte e bloccare nella stessa soluzione per un'ora. Per il rilevamento delle proteine sull'array, rimuovere il TBST con il latte, posizionare le diapositive su una piastra della griglia e applicare 600 microlitri di anticorpo primario, mouse anti-Flag, diluito da uno a duecento e 1x TBST integrato con il 5% di latte.Incubare per un'ora a temperatura ambiente. Lavare gli scivoli con 50 millilitri di 1 tbst e 5% di latte sullo shaker a dondolo tre volte per cinque minuti ciascuno. Ripetere la procedura per l'anticorpo secondario.Al termine dell'incubazione di un'ora, lavare gli scivoli con 1 TBST sullo shaker a dondolo tre volte per cinque minuti ciascuno. Quindi, sciacquare rapidamente gli scivoli con acqua ultra pura e asciugare con aria a pressione. Le diapositive sono pronte per essere scansionate.Per eseguire il trattamento con fosfatasi e DNasi, lavare e bloccare le diapositive espresse con TBST integrate con il 3%BSA come descritto nel manoscritto. Quindi, posizionare le diapositive su una piastra a griglia e applicare 200 microlitri di soluzione di DNasi fosfatasi. Posizionare un coperchio del microarray in cima per evitare l'evaporazione.Incubare a 30 gradi Celsius per un'ora e 30 minuti in forno. Quindi, lavare gli scivoli con 1 TBST e 0,2 cloruro di sodio molare sullo shaker a dondolo tre volte per cinque minuti ciascuno. Per eseguire il trattamento farmacologico e la reazione chinasi, posizionare le diapositive sulla piastra della griglia e applicare 200 microlitri di soluzione di chinasi farmacologica.Posizionare un coperchio in cima per evitare l'evaporazione. Incubare per un'ora a 30 gradi Celsius nel forno. La chiave per i dati riproducibili è il tempo di incubazione coerente tra le diapositive.Questo è particolarmente importante durante la reazione della chinasi. Il tempo necessario per elaborare ogni diapositiva deve essere tenuto in considerazione. Successivamente, lavare gli scivoli con 1 TBST e 0,2 cloruro di sodio molare sullo shaker a dondolo tre volte per cinque minuti ciascuno.Ripetere il rilevamento delle proteine utilizzando come anticorpo fosfotirosina anticorpale primario diluito da uno a 100 in TBST, integrato con albumina siere bovina al 3%. Utilizzare 1x TBST e 3% di albumina di siero bovino per il lavaggio dopo l'incubazione con anticorpo primario e TBST per lavaggi dopo incubazioni con anticorpi secondari. Lavare e asciugare come in precedenza.Per l'acquisizione di immagini, caricare i microarray nel caricatore porta diapositiva. Caricare il caricatore nello scanner microarray. Scansiona tutti i microarray con le impostazioni ottimizzate e ricorda di disattivare il guadagno automatico quando confronti le immagini tra gli esperimenti.Trasferire le immagini in un software di quantificazione, allineare la griglia con i punti e quantificare l'intensità del segnale di ogni feature sul microarray. Procedere con l'analisi statistica. In questo studio, il microarray ha mostrato che la maggior parte delle macchie contenenti DNA complementare mostravano con successo livelli rilevabili di proteine.I microarray di nappa chinasi hanno mostrato una buona riproducibilità tra le diapositive, con la correlazione dei livelli di esposizione proteica tra lotti di stampa distinti superiori a 0,88. Risultati rappresentativi dell'attività della chinasi negli array di NAPPA chinasi hanno mostrato alti livelli di fosforilazione proteica dopo l'espressione. Il confronto tra microarray in cui i livelli di fosforilazione sono stati misurati subito dopo il trattamento con fosfatasi, e dopo 60 minuti di reazione di autofosforilazione, suggerisce la presenza di chinasi proteiche attive sull'array.Sugli array di nappa chinasi, l'imatinib ha mostrato una significativa riduzione dell'attività ABL1 e BCR-ABL1, mentre altre chinasi sono rimaste per lo più inaltenate. L'attività della chinasi normalizzata rispetto all'array defosforilato e rappresentata come percentuale del microarray di controllo positivo mostrò un'inibizione selettiva dell'imatinib verso ABL1 e BCR-ABL1. I risultati tipici ottenuti per lo screening ibrutinib hanno mostrato che l'attività della chinasi ABL1 non rilevante non è influenzata.BTK obiettivo canonico, e ERBB4 potenziale nuovo obiettivo, Ha mostrato un'attività ridotta in presenza di ibrutinib. I dati suggeriscono che l'ERBB4 può essere inibito da ibrutinib in modo specifico per la dose. Il successo degli screening del microarray proteico dipende fortemente dalla qualità del microarray stesso.Per consentire un'adeguata analisi dei dati, è necessario utilizzare diverse funzioni di controllo positive e negative. Il test della NAPPA chinasi è una piattaforma di screening e, in quanto tale, i dati ottenuti devono essere convalidati in saggi di follow-up, che possono includere saggi di chinasi in vitro o saggi basati su cellule. Poiché il nostro protocollo inizia con cDNA, qualsiasi mutazione o variazione della chinasi può essere facilmente incorporata nel microarray e studiata ad alta produttività.Durante la preparazione del liquame e delle piastre in resina a scambio di anione, si raccomanda l'uso di maschere per prevenire la possibile inalazione delle particelle di resina.

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In questo video, dimostriamo il saggio omogeneo di prossimità luminescente amplificato, un saggio di prossimità basato su microsfere. Utilizza perline accettori e donatrici di dimensioni omogenee, immobilizzate con due proteine che tendono a interagire per schermare potenziali piccole molecole che inibiscono le interazioni proteiche.

Saggio omogeneo di prossimità luminescente amplificato: un saggio di prossimità basato su perline per lo screening di piccole molecole che inibiscono le interazioni proteina-proteina

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