Name: Analisi del contenuto delle goccioline lipidi in Fissione e lieviti in forati utilizzando lelaborazione automatizzata delle immagini (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: Scopri l'analisi automatizzata delle goccioline lipidiche in lieviti come Schizosaccharomyces pombe e Saccharomyces cerevisiae mediante microscopia a fluorescenza. Questo metodo standardizzato consente quantificazioni rapide e riproducibili per studi metabolici ad alto rendimento.

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Questo lavoro è stato supportato da Charles University sovvenzioni PRIMUS/MED/26, GAUK 1308217 e SVV 260310. Ringraziamo Ond'ej Ebesta per l'aiuto con la microscopia e lo sviluppo della pipeline di analisi delle immagini. Ringraziamo il laboratorio ReGenEx per i ceppi S. cerevisiae e il laboratorio di JapoNet e Hironori Niki per i ceppi S. japonicus. Il ceppo ppc1-88 è stato fornito dal Yeast Genetic Resource Center Japan. La microscopia è stata effettuata nel Laboratorio di microscopia confocale e fluorescenza cofinanziato dal Fondo europeo di sviluppo regionale e dal bilancio statale della Repubblica ceca (Progetto n. 4.1.00/1.00/16.0347 e C.2.16/3.1.00/21515).

1. Preparazione di soluzioni e mezzi di comunicazione
<ol><li>
Preparare la soluzione di colorazione dei lipidi.
	<ol>
<li>Per preparare la soluzione di colorazione dei lipidi di riserva sciogliere 10 mg di BODIPY 493/503 in 10 mL di anhydrous DMSO (concentrazione finale 1 mg/mL). Sciogliere l'intero contenuto di una fiala da 10 mg BODIPY 493/503 per evitare la perdita di materiale durante la pesatura. ATTENZIONE: DMSO può passare attraverso la pelle. Indossare attrezzature protettive personali adeguate.</li>
		<li>Preparare la soluzione di colorazione dei lipidi funzionante mescolando 100 luna della soluzione stock 493/503 BODIPY da 1 mg/mL e 900 -L di Anhydrous DMSO (concentrazione finale 0,1 mg/mL).</li>
		<li>le soluzioni di stock e di lavoro, e conservare a -20 gradi centigradi. NOT: BoDIPY disciolto 493/503 è stabile per diversi anni a -20 gradi centigradi. Tuttavia, la soluzione deve essere protetta dall'umidità e dalla luce.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Per preparare la soluzione stock per la visualizzazione dei confini delle cellule, sciogliere 25 mg di Dextran Cascade Blue (intera fiala) in 2,5 mL di acqua deionizzata (concentrazione finale 10 mg/mL). la soluzione di stock e conservare a -20 gradi centigradi protetti dalla luce.</li>
	<li>Per preparare la soluzione di rivestimento scorrevole del microscopio, sciogliere 5 mg di lectina di soia in 5 mL di acqua deionizzata (concentrazione finale 1 mg/mL). Aliquota la soluzione di lectina e conservare a -80 gradi centigradi. NOT: La soluzione di lectina è stabile per diversi anni a -80 gradi centigradi. Gli aliquote attualmente in uso possono essere immagazzinati a -20 gradi centigradi.</li>
	<li>
Preparare i mezzi di coltivazione.
	<ol>
<li>Per preparare 400 mL di complesso mezzo di coltivazione YES per S. pombe e S. japonicus, sciogliere 2 g di estratto di lievito e 0,1 g di supplementi SP (se necessario per i mutanti auxotrofici) in 340 mL di acqua dionizzata in una bottiglia da 500 mL e autoclave. Aggiungere 60 mL del 20% (w/v) di glucosio autoclaved o sterilizzato a filtro separatamente in condizioni asettiche.</li>
		<li>Per preparare 400 mL di mezzo di coltivazione EMM definito per S. pombe e S. japonicus, sciogliere 4,9 g di brodo EMM senza dextrose in 360 mL di acqua deionizzata in una bottiglia da 500 mL e autoclave. Aggiungere 40 mL del 20% (w/v) di glucosio autoclaved o sterilizzato a filtro separatamente in condizioni asettiche. NOT: Per le linee guida generali sulla coltivazione S. pombe e S. japonicus vedere25 e26, rispettivamente.</li>
		<li>Per preparare 300 mL di complesso YPAD mezzo di coltivazione per Saccharomyces cerevisiae, sciogliere 3 g di estratto di lievito, 6 g di peptone e 30 mg di solfato di adenina in 270 mL di acqua deionizzata in una bottiglia da 500 mL e autoclave. Aggiungere 30 mL del 20% (w/v) di glucosio autoclaved o sterilizzato a filtro separatamente in condizioni asettiche.</li>
		<li>Per preparare 300 mL di mezzo minimo definito per S. cerevisiae, sciogliere 2 g di base di azoto di lievito (senza aminoacidi) in 270 mL di acqua deionizzata in una bottiglia da 500 mL e autoclave. Aggiungere 30 mL del 20% (w/v) di glucosio autoclaved o sterilizzato a filtro separatamente in condizioni asettiche. NOT: Per le linee guida generali sulla coltivazione S. cerevisiae vedere27.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Coltivazione cellulare
<ol><li>
Crescere S. pombe o S. japonicus alla fase esponenziale o iniziale stazionaria.
	<ol>
<li>Al mattino, inoculare 5 mL di si medio con biomassa lievito di fissione fresca. Incubare a 32 gradi centigradi con agitazione (180 giri/min) per diverse ore. NOT: Per tutte le coltivazioni, utilizzare flaconi Erlenmeyer con 10 volte il volume della coltura per garantire una corretta aerazione. Alcuni laboratori preferiscono coltivare lieviti di fissione a 30 gradi centigradi, ma la temperatura di coltivazione di 32 gradi centigradi comporta tempi di raddoppio più brevi senza effetti dannosi per le cellule, riducendo così il tempo totale necessario per eseguire un esperimento25,28 .</li>
		<li>Nel tardo pomeriggio dello stesso giorno (dopo almeno 6 ore di coltivazione), diluire la coltura con un nuovo mezzo SI a un volume di coltura finale di 10 mL in modo che raggiunga la densità ottica desiderata (OD) (o numero di cellule/mL) la mattina seguente, e incubare a 32 haking (180 rpm). È vantaggioso conoscere il tempo di raddoppio di ogni ceppo usato per determinare con precisione il fattore di diluizione (utilizzare l'equazione 1). <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/59889/59889eq01v3.jpg"> Se lacultura Vè il volume di precultura necessario per la diluizione, Vfinale è il volume totale della nuova coltura (10 mL per le colture standard), ODfinal è l'OD desiderato da raggiungere la corrente OD è l'OD attualmente misurata della precultura, t è il tempo di crescita cellulare fino alla raccolta, tlag è la durata della fase di ritardo (dipende dalle condizioni di laboratorio, deve essere definito empiricamente) e tDT è il tempo di raddoppio della deformazione. NOT: Quando le cellule di fase esponenziale devono essere analizzate, non lasciare che le preculture raggiungano la fase stazionaria in quanto questo altera drammaticamente la fisiologia cellulare (compreso il contenuto di LD) per diverse generazioni successive.</li>
		<li>Al mattino del giorno dell'imaging, se la coltura raggiungeva OD leggermente superiore a quello richiesto (in caso di cellule di fase esponenziale), diluirlo con nuovi SI e continuare l'incubazione per almeno altri due tempi di raddoppio prima della colorazione degli LD. colorazione (Sezione 3).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Crescere S. cerevisiae in fase esponenziale e stazionaria.
	<ol>
<li>Nel pomeriggio, inoculare 10 mL di YPAD medio con una piccola quantità di biomassa lievito fresco in erba e incubare durante la notte a 30s C con agitazione (180 giri/m).</li>
		<li>La mattina del giorno dell'imaging, diluire la coltura a OD 0.1 in 10 mL di YPAD medio e crescere fino al necessario OD (ad esempio, OD 1 per la fase esponenziale). Eseguire le diluizioni delle impostazioni cultura come descritto nel passaggio 2.1.2. Procedere alla colorazione (Sezione 3).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Colorazione delle goccioglie a ibiadi
<ol><li>Preparare uno slip di copertura al microscopio per ogni campione da immaginare. Stendere 1 - L di rivestimento scorrevole su uno slittamento pulito utilizzando il lato lungo di una punta pipetta posizionata orizzontalmente. Lasciare asciugare completamente la soluzione di rivestimento e conservare gli scivoli di copertura in un ambiente privo di polvere. NOT: I vetrini di vetro e i copriocchiali possono essere puliti prima dell'uso, se necessario. La procedura di pulizia consiste nel lavaggio con detergente lavastoviglie, risciacquo con acqua, immersione durante la notte in acido cloridrico del 3% e lavaggio con acqua distillata. I vetrini puliti e i copricapi vengono conservati in etanolo puro fino all'uso.</li>
	<li>Misurare l'OD della coltura cellulare o il numero di celle/mL, in base alle esigenze. Cercate di raggiungere valori simili tra tutti i ceppi testati per garantire condizioni sperimentali comparabili.</li>
	<li>Pipetta 1 mL di ogni coltura cellulare a un tubo di microcentrifuga da 1,5 mL. Solo per S. cerevisiae, aggiungere 5 le L della soluzione di rivestimento scorrevole, vortice brevemente, e incubare a 30 gradi centigradi con agitazione per 5 min.</li>
	<li>Aggiungere brevemente 1 l della soluzione di colorazione dei lipidi a ciascuna coltura e al vortice. Aggiungere quindi brevemente 10 l della soluzione di visualizzazione dei confini delle celle e del vortice. NOT: Non preparare soluzioni pre-miste di entrambe le macchie in quanto questo porta allo spegnimento della fluorescenza di BODIPY 493/503.</li>
	<li>Raccogliere le cellule mediante centrifugazione (1.000 x g, 3 min, RT) e rimuovere quasi tutti i supernatali (950 dollari l). Risospendere le cellule nel super-nilatante rimanente.</li>
	<li>Pipette 2 - L della sospensione cellulare densa su uno slittamento rivestito in lectin e posto su un vetrino al microscopio pulito. Le cellule dovrebbero formare un monostrato. Procedere alla microscopia (Sezione 4) il più rapidamente possibile per ridurre al minimo i manufatti nell'imaging; elaborazione massima di due campioni alla volta.</li>
</ol>4. Impostazione del microscopio e dell'imaging
<ol><li>
Ottimizzare le condizioni di imaging. NOTA: la configurazione del microscopio richiede lunghe esposizioni a forti sorgenti luminose che potrebbero causare danni ai risultati del campione e dell'inclinazione. Pertanto, impostare le condizioni di imaging utilizzando una diapositiva campione dedicata che non verrà ulteriormente utilizzata per la quantificazione LD.<ol>
<li>Concentrarsi sulle celle utilizzando il contrasto di fase o il contrasto di interferenza differenziale (DIC). NOT: Il contrasto di fase o le immagini DIC possono essere scattate come riferimento, ma non vengono utilizzate durante la fase di analisi automatica delle immagini.</li>
		<li>Impostare le impostazioni dello stack z per coprire l'intero volume della cella. La distanza verticale totale dipende dalle dimensioni della cella; il numero di fette ottiche dipende dall'apertura numerica dell'obiettivo (funzione di diffusione del punto nell'asse z). Impostare lo stato attivo per spostarsi rispetto al piano focale centrale. NOT: Il numero ottimale di fette è spesso impostato dal software di controllo del microscopio e non deve essere calcolato manualmente. La larghezza tipica delle cellule è di 3-5 m per S. pombe, 4-7 m per S. japonicuse 3-7 m per S. cerevisiae.</li>
		<li>Per immagini di LD, impostare l'intensità della luce e il tempo di esposizione nel canale verde (l'eccitazione e il massimo di emissione di BODIPY sono rispettivamente 493 e 503 nm). NOT: BODIPY 493/503 è un fluorocro molto luminoso; tuttavia, può essere sbiancato rapidamente con intensità di luce eccessivamente forte. Inoltre, gli LD sono mobili nelle celle vive, riducendo così al minimo il tempo di esposizione e catturare l'intero z-stack verde-canale prima (prima di passare al canale blu) per evitare artefatti sfocatura. Inoltre, prendere in considerazione la gamma lineare della fotocamera per l'intensità del segnale per evitare i pixel saturi.</li>
		<li>Per immaginare i limiti delle celle, impostare l'intensità della luce e il tempo di esposizione nel canale blu (l'eccitazione e il massimo di emissione di dextran Cascade Blue sono rispettivamente 400 e 420 nm). NOT: L'intensità del segnale nel canale blu è necessaria per la segmentazione dell'immagine, ma non viene utilizzata per la quantificazione LD stessa. Pertanto, le impostazioni ottimali in questo canale non sono cruciali per l'analisi.</li>
		<li>Se possibile, creare un flusso di lavoro sperimentale automatizzato nel software di controllo del microscopio per facilitare l'imaging di più campioni in condizioni standardizzate.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Una volta che le condizioni di imaging sono state ottimizzate, i campioni di immagine da utilizzare per la quantificazione. Concentrarsi sulle celle e visualizzarle in canali verdi e blu, come descritto nel passaggio 4.1. NOT: Tutte le immagini devono essere acquisite utilizzando le stesse impostazioni per consentire il confronto tra i campioni. Immagine di più campi di visualizzazione per esempio per ottenere dati affidabili e rappresentativi.</li>
	<li>Salvate le immagini dello z stack del canale blu e verde come file TIFF multilivello a 16 bit (ad esempio, due file per campo visivo). Includere le parole "verde" o "blu" nei nomi dei file corrispondenti. Procedere con l'analisi dell'immagine (Sezione 5).</li>
</ol>5. Analisi delle immagini
<ol><li>
Controllare visivamente la qualità delle immagini acquisite.
	<ol>
<li>Aprire immagini microscopiche in ImageJ29,30 o altro software di analisi delle immagini adatto.</li>
		<li>Rimuovere tutte le pile di immagini contenenti un numero considerevole di celle che si sono spostate durante l'acquisizione (e quindi hanno creato artefatti di sfocatura).</li>
		<li>Rimuovere eventuali pile di immagini contenenti particelle non cellulari altamente fluorescenti nel canale blu (ad esempio, sporcizia su vetrino al microscopio o slittamento di copertura, impurità nel mezzo di coltivazione). NOT: Gli oggetti non cellulari molto luminosi nel canale blu possono creare artefatti di rilevamento delle cellule o interferire con il rilevamento delle cellule nelle loro vicinanze.</li>
		<li>Rimuovere tutte le pile di immagini contenenti una grande percentuale di cellule morte (cioè cellule con maggiore fluorescenza blu rispetto alle cellule vive). NOT: Mentre la presenza di una piccola percentuale di cellule morte nel campione non è in genere un problema e queste cellule vengono automaticamente scartate durante l'analisi, alcune cellule morte o morenti possono occasionalmente essere riconosciute come cellule vive dall'algoritmo di segmentazione e quindi inclinare i risultati riportati.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Analizzare le immagini nel software MATLAB.
	<ol>
<li>Creare una cartella principale e copiare tutti gli script MATLAB in questa posizione.</li>
		<li>Creare una sottocartella ("pombe", "cerevisiaee" o "japonicus") e copiare i file di immagine TIFF di input in questa posizione.</li>
		<li>Avviare MATLAB, aprire lo script MAIN.m ed eseguirlo. Nel menu selezionare le specie di lievito da analizzare e avviare l'elaborazione delle immagini. NOT: Alcuni dei parametri necessari per il rilevamento delle cellule e l'LD sono preimpostati per la particolare specie, altri vengono determinati automaticamente durante l'elaborazione delle immagini. I valori preimpostati sono stati determinati empiricamente e dipendono da diversi fattori come l'ingrandimento oggettivo, il tipo e la sensibilità della fotocamera e le impostazioni di imaging. Se necessario, gli utenti possono modificare i file di script per modificare i preset specifici dell'organismo per riflettere meglio la loro configurazione sperimentale. Vale a dire, durante il riconoscimento delle celle le dimensioni accettabili degli oggetti sono date dai parametri "minArea" e "maxArea" e la frazione minima del volume riempito all'interno dei limiti dell'oggetto è data dal parametro "Solidity". Per il riconoscimento LD, la soglia di luminosità è data dal parametro "th" (il suo valore è influenzato principalmente dalla profondità del bit dell'immagine e dall'intensità del segnale di fluorescenza) e la dimensione Massima Accettabile LD è data dal parametro "MaxArea".</li>
		<li>Ispezionare ed elaborare i file di output come richiesto utilizzando un editor di fogli di calcolo o un pacchetto statistico; il flusso di lavoro produce file CSV separati da punto e virgola e file TIFF segmentati con oggetti cella e LD rilevati. NOT: Il flusso di lavoro segmenta le immagini in oggetti di sfondo e di cella, in cui ogni oggetto cella può essere composto da più celle adiacenti. Pertanto, l'output nei file "xxxx_cells.csv" non rappresenta dati a cella singola e deve essere utilizzato solo per calcolare le metriche per unità di volume.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

La comprensione del metabolismo dei lipidi e della sua regolazione è importante sia per la biologia di base che per le applicazioni cliniche e biotecnologiche. Il contenuto di LD rappresenta una comoda lettura dello stato del metabolismo dei lipidi della cellula, con la microscopia a fluorescenza uno dei principali metodi utilizzati per la determinazione del contenuto LD. Il protocollo presentato consente il rilevamento automatico e la descrizione quantitativa di singoli LD in tre specie di lievito diverse e morfologicam...

I lipidi svolgono un ruolo cruciale nel metabolismo dell'energia cellulare e del carbonio, nella sintesi dei componenti della membrana e nella produzione di sostanze bioattive. Il metabolismo dei lipidi viene messo a punto in base alle condizioni ambientali, alla disponibilità di nutrienti e alla fase del ciclo cellulare1. Nell'uomo, il metabolismo dei lipidi è stato collegato a malattie, come l'obesità, il diabete di tipo II e il cancro2. Nell'industria, i lipidi prodotti da microrganismi, come i lieviti, rappresentano una fonte promettente di combustibili diesel rinnovabili3 . Le cellule immagazzinano lipidi neutri nelle cosiddette goccioline di lipidi (LD). Questi corpi evolutivamente conservati sono composti da triacylglycerols, steryl esters, un monostrato esterno di fosfolipidi e proteine associate1. Gli LD hanno origine nel reticolo endoplasmico, esercitano dinamiche del ciclo cellulare o della fase di crescita e sono importanti per l'omeostasi dei lipidi cellulari1. Il numero LD e la morfologia possono essere utilizzati come un comodo proxy quando si analizza il metabolismo dei lipidi in varie condizioni di crescita o durante lo screening di un gruppo di mutanti. Data la loro natura dinamica, tecniche in grado di analizzare le proprietà dei singoli LD sono di particolare interesse negli studi sul metabolismo dei lipidi.
Varie specie di lievito sono state utilizzate per descrivere le vie metaboliche legate ai lipidi e la loro regolazione, o utilizzate nella biotecnologia per produrre composti o combustibili interessanti1. Inoltre, per i lieviti modello, come il lievito in erba Saccharomyces cerevisiae o il lievito di fissione lontano correlato Schizosaccharomyces pombe, sono disponibili librerie di deformazione di delezione a livello di genoma che possono essere utilizzati per schermi4,5. Recentemente la composizione e la dinamica LD sono state descritte in S. pombe6,7,8,9, e mutanti legati al metabolismo dei lipidi sono stati isolati nel lievito modello emergente Schizosaccharomyces japonicus10.
Sono disponibili numerose tecniche per studiare contenuti e dinamiche LD. La maggior parte impiega nodi di colorazione di LD con coloranti lipofili come Nile Red o BODIPY 493/503. Quest'ultimo mostra spettri di eccitazione ed emissione più stretti, e una maggiore specificità verso i lipidi neutri (LD) rispetto ai fosfolipidi (membrane)11. I metodi fluorimetrici e di citometria di flusso sono stati utilizzati con successo in varie specie fungine per scoprire geni e condizioni di crescita che influenzano il contenuto lipidico di immagazzinamento12,13,14,15. Sebbene questi metodi siano adatti per applicazioni ad alta produttività, non possono misurare i numeri e la morfologia dei singoli LD nelle cellule, che possono differire notevolmente tra le condizioni di crescita e i genotipi. La dispersione coerente Raman o la microscopia olografica digitale sono metodi privi di etichette che producono dati a livello di LD, ma richiedono attrezzature costose specializzate16,17,18. La microscopia a fluorescenza, d'altra parte, può fornire dati dettagliati sul contenuto LD, utilizzando al contempo strumenti di analisi delle immagini e strumenti software di analisi delle immagini comunemente disponibili. Esistono diversi flussi di lavoro di analisi che presentano vari gradi di sofisticazione e automazione nel rilevamento di celle/LD dai dati immagine e sono ottimizzati per diversi tipi di cellule, come le celle metazoiconiche con LD di grandi dimensioni19,20 , 21, o lieviti in erba17,22,23. Alcuni di questi approcci funzionano solo in 2D (ad esempio, su immagini di proiezione massima), che potrebbero non riuscire a descrivere in modo affidabile il contenuto LD cellulare. A nostra conoscenza, non esistono strumenti per la determinazione del contenuto di LD e la morfologia da dati microscopici di lievito di fissione. Lo sviluppo di analisi automatizzate e robuste a livello di LD porterebbe una maggiore sensibilità e una maggiore potenza statistica e fornirebbe informazioni dettagliate sul contenuto di lipidi neutri, idealmente in più specie di lieviti.
Abbiamo sviluppato un flusso di lavoro per l'analisi dei contenuti LD da immagini di microscopia a fluorescenza 3D di cellule di lievito. Le celle vive sono colorate con BODIPY 493/503 e dextran Cascade Blue per visualizzare gli LD e determinare i limiti delle celle, rispettivamente. Le cellule sono immobilizzate su vetrini di vetro e sottoposte a imaging z-stack utilizzando un microscopio a epifluorescenza standard. Le immagini vengono poi elaborate da una pipeline automatizzata implementata in MATLAB, un pacchetto (commerciale) ampiamente utilizzato per le analisi statistiche. La pipeline esegue la pre-elaborazione delle immagini, la segmentazione (celle e sfondo, la rimozione delle celle morte) e l'identificazione LD. I dati avanzati a livello Di LD, come le dimensioni LD e l'intensità della fluorescenza, vengono quindi forniti in un formato tabulare compatibile con i principali strumenti software per fogli di calcolo. Il flusso di lavoro è stato utilizzato con successo per determinare l'impatto della disponibilità della fonte di azoto sul metabolismo dei lipidi in S. pombe24. Ora dimostriamo la funzionalità del flusso di lavoro in S. pombe, S. japonicus e S. cerevisiae, utilizzando condizioni di crescita o mutanti che influenzano il contenuto lD cellulare.

<table><tbody><tr><td>Telecamera CCD monocromatica a 12 bit Hamamatsu ORCA C4742-80-12AG</td><td>Hamamatsu</td><td>&nbsp;</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>Sale di adenina emisolfato, &ge; 99%</td><td>Merck</td><td>A9126-25G</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>BODIPY 493/503 (4,4-Difluoro-1,3,5,7,8-Pentametil-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D3922</td><td>per colorazione lipidica neutra</td></tr><tr><td>D-(+) - Glucosio, &ge; 99,5%</td><td>Merck</td><td>G7021</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Dextran, Cascade Blue, 10.000 MW, Anionico, Lisina Fissabile Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>D1976</td><td>per la colorazione negativa delle cellule</td></tr><tr><td>Dimetilsolfossido, &ge; 99,5%</td> <td>Merck</td><td>D4540</td><td>o superiore purezza, mantenere anidro su setacci molecolari</td></tr><tr><td>Brodo EMM senza destrosio</td><td>Formedium</td><td>PMD0405</td><td>mezzo può anche essere preparato da singoli componenti</td></tr><tr><td>Fiji/ImageJ software NIH</td><td></td><td>&nbsp;</td><td>o equivalente; per l'ispezione visiva di dati microscopici</td></tr><tr><td>Occhiali di copertura ad alta precisione, 22 mm x 22 mm, n. 1.5</td><td>VWR</td><td>630-2186</td><td>utilizzare qualsiasi vetro di copertura # 1.5</td></tr><tr><td>Image Processing Toolbox per MATLAB, versione 10.0</td><td>Mathworks</td><td>&nbsp;</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Lectina da Glicina max (soia)</td><td>Merck</td><td>L1395</td><td>per l'immobilizzazione cellulare su vetrini</td></tr><tr><td>Software MATLAB, versione 9.2</td><td>Mathworks</td><td>&nbsp;</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Vetrino per microscopio, 26 mm x 76 mm, spessore 1 mm</td><td>Knittel Glass</td><td>L762601.2</td><td>utilizzare qualsiasi vetrino per microscopio adatto al tavolino del microscopio, pulire accuratamente prima di caricare le celle</td></tr><tr><td>Microscopio Olympus CellR con movimento automatico dell'obiettivo dell'asse z</td><td>Olympus</td><td>&nbsp;</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>Il set di filtri Pentaband</td><td>Semrock</td><td>F66-985</td><td>in campo chiaro, i canali verdi e blu sono sufficienti</td></tr><tr><td>Signal Processing Toolbox per MATLAB, versione 7.4</td><td>Mathworks</td><td>&nbsp;</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Integratori SP</td><td>per PSU0101 medio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Computer da ufficio standard in grado di eseguire MATLAB</td><td>&nbsp;</td><td>&nbsp;</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Statistics and Machine Learning Toolbox per MATLAB, versione 11.1</td><td>Mathworks</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Peptone universale M66 per microbiologia</td><td>Merck</td><td>1070431000</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Obiettivo UPLSAPO 60XO</td><td>Olympus</td><td>&nbsp;</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>Estratto di lievito</td><td>Formedium</td><td>YEA03</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Lievito base azotata senza aminoacidi</td><td>Formedium</td><td>CYN0405</td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

analisi del contenuto delle goccioline lipidi in fissione e lieviti in forati utilizzando l'elaborazione automatizzata delle immagini

Analysis of Lipid Droplet Content in Fission and Budding Yeasts using Automated Image Processing

Il metabolismo dei lipidi e la sua regolamentazione sono di interesse sia per le scienze della vita di base che per le biotecnologie applicate. A questo proposito, varie specie di lievito sono utilizzate come modelli nella ricerca metabolica dei lipidi o per la produzione industriale di lipidi. Le goccioline di lipidi sono corpi di archiviazione altamente dinamici e il loro contenuto cellulare rappresenta una comoda lettura dello stato metabolico lipidico. La microscopia a fluorescenza è un metodo di scelta per l'analisi quantitativa delle goccioline lipidiche cellulari, in quanto si basa su apparecchiature ampiamente disponibili e consente l'analisi delle singole goccioline lipidiche. Inoltre, l'analisi microscopica delle immagini può essere automatizzata, aumentando notevolmente la produttività complessiva dell'analisi. Qui descriviamo un flusso di lavoro sperimentale e analitico per il rilevamento automatizzato e la descrizione quantitativa delle singole goccioline di lipidi in tre diverse specie di lievito modello: i lieviti di fissione Schizosaccharomyces pombe e Schizosaccharomyces japonicus, e il lievito in erba Saccharomyces cerevisiae. Le goccioline di lipidi vengono visualizzate con BODIPY 493/503 e il dextran fluorescente delle cellule viene aggiunto ai mezzi di coltura per aiutare a identificare i confini delle cellule. Le cellule sono sottoposte a microscopia dell'epiorescenza 3D nei canali verde e blu e le immagini z-stack risultanti vengono elaborate automaticamente da una pipeline MATLAB. La procedura emette dati quantitativi dettagliati sul contenuto di gocciolinie di lipidi cellulari e sulle caratteristiche delle singole gocce di lipidi in un formato tabulare adatto per analisi a valle in grandi fogli di calcolo o pacchetti statistici. Forniamo analisi di esempio del contenuto di goccioline lipidiche in varie condizioni che influenzano il metabolismo dei lipidi cellulari.

L'intera procedura è riassunta nella Figura 1 per i lieviti di fissione (il flusso di lavoro del lievito in erba è analogo), e di seguito forniamo esempi di come il flusso di lavoro può essere utilizzato per studiare il contenuto di LD in tre diverse specie di lievito in varie condizioni note per influire sul contenuto LD cellulare. Ogni esempio rappresenta un singolo esperimento biologico.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="...

Qui, presentiamo un'implementazione MATLAB di rilevamento automatico e descrizione quantitativa delle goccioline lipidiche nelle immagini di microscopia a fluorescenza di fissione e cellule di lievito in erba.

Analisi del contenuto delle goccioline lipidi in Fissione e lieviti in forati utilizzando l'elaborazione automatizzata delle immagini

Lipid metabolism and its regulation are of interest to both basic and applied life sciences and biotechnology. In this regard, various yeast species are ...

Questo protocollo facilita analisi quantitative su piccola o grande scala del contenuto lipidico di stoccaggio cellulare in una varietà di specie di lievito e lo fa in modo imparziale e standardizzato. La tecnica consente la rapida elaborazione di immagini microscopiche e fornisce output quantitativi dettagliati per confrontare facilmente campioni come vari mutanti e cellule coltivati in diverse condizioni. Per iniziare, seguire il protocollo di testo di accompagnamento per preparare le soluzioni di colorazione, i supporti di coltura e le celle.Assicurarsi che le cellule siano sane e nella fase di crescita desiderata prima di eseguire l'esperimento. Preparare quindi un coperchio del microscopio per ogni campione da imaged. Stendere un microlitro di soluzione di rivestimento scorrevole su un coverslip pulito utilizzando il lato lungo di una punta di pipetta posizionata orizzontalmente.Lasciare asciugare completamente la soluzione di rivestimento, quindi conservare i copricapo in un ambiente privo di polvere. Successivamente, misurare le densità ottiche delle colture cellulari e, affinché le colture vengano analizzate nella stessa fase di crescita, cercare di raggiungere valori simili tra tutte le colture testate per garantire condizioni sperimentali comparabili. Quindi, pipettare un millilitro della coltura cellulare in un tubo di microcentrifugo da 1,5 millilitri.Solo per le celle S.cerevisiae, aggiungere cinque microlitri della soluzione di rivestimento scorrevole anche al tubo. Quindi, vortice brevemente tutti i tubi di microcentrifugo e incubarli a 30 gradi Celsius con tremori per cinque minuti. Quindi, aggiungere un microlitro della soluzione di colorazione lipidica ad ogni aliquota di coltura e vortice brevemente.Quindi, aggiungere 10 microlitri della soluzione di visualizzazione dei limiti delle celle e vortice brevemente una seconda volta. Raccogliere le cellule centrifugandole a 1.000 volte la gravità per tre minuti a temperatura ambiente. Al termine della rotazione, rimuovere 950 microlitri dal supernatante e rimescolare le celle nel supernatante rimanente utilizzando una pipetta.Successivamente, pipettare due microlitri della sospensione cellulare densa su un coverslip rivestito di letta. Quindi, posizionare il coverslip su una diapositiva del microscopio pulito per formare un monostrato cellulare e procedere alla microscopia il più rapidamente possibile per ridurre al minimo gli artefatti nell'imaging. La configurazione del microscopio richiede lunghe esposizioni a forti sorgenti luminose che potrebbero causare danni al campione e risultati di inclinazione.Pertanto, impostare le condizioni di imaging utilizzando una diapositiva campione dedicata che non verrà ulteriormente utilizzata per la quantificazione delle goccioline lipidiche. Posizionare il campione dedicato sullo stadio di una configurazione del microscopio a contrasto di fase o di interferenza differenziale e concentrarsi sulle celle. Nel software del microscopio, impostare le impostazioni dello stack Z in modo che si esclaccino sull'intero volume cellulare.La distanza verticale totale dipende dalla dimensione della cella e il numero di fette ottiche dipende dall'apertura numerica dell'obiettivo. Quindi, impostare lo stato attivo per spostarsi rispetto al piano focale centrale. Per immagini le goccioline lipidiche, impostare sperimentalmente l'intensità della luce e il tempo di esposizione nel canale verde.Sii cauto durante l'imaging, poiché BODIPY è un fluorocromo molto luminoso che può essere rapidamente fotoliciato. Inoltre, ridurre al minimo il tempo di esposizione per evitare la sovrasaturazione. Cattura prima di passare al canale blu lo Z-stack a canale verde completo per evitare di sfocare le goccioline lipidiche mobili.Per i limiti delle celle dell'immagine, impostare sperimentalmente l'intensità della luce e il tempo di esposizione nel canale blu. Se possibile, impostare e utilizzare un flusso di lavoro sperimentale automatizzato nel software di controllo del microscopio per facilitare l'imaging di più campioni in condizioni standardizzate. È importante sottolineare che tutte le immagini devono essere acquisite utilizzando le stesse impostazioni per consentire un confronto appropriato tra i campioni.Una volta ottimizzate le condizioni di imaging, concentrati sulle celle e immaginile sia nei canali verde che in quello blu. Immagine di più campi di visualizzazione per esempio per ottenere dati robusti e rappresentativi. Salvare le immagini Z-stack del canale blu e verde come file TIFF multilivello a 16 bit.Assicurati di includere le parole verde o blu nei nomi di file corrispondenti. Apri immagini microscopiche in ImageJ e rimuovi tutti gli stack di immagini contenenti un numero considerevole di celle che si sono spostate durante l'acquisizione. Questi appaiono in diverse posizioni nelle singole sezioni Z.Quindi, rimuovere eventuali pile di immagini contenenti particelle non cellulari altamente fluorescenti nel canale blu. Ciò è spesso causato da sporcizia sulla superficie di imaging o impurità nel mezzo di coltivazione e può interferire con il rilevamento di cellule nelle loro vicinanze. Inoltre, rimuovere eventuali pile di immagini contenenti una grande percentuale di celle morte.Queste immagini mostrerà cellule con aumento della fluorescenza blu rispetto alle cellule vive. Mentre la presenza di alcune cellule morte nel campione in genere non è un problema e queste cellule vengono automaticamente scartate durante l'analisi, alcune cellule morte o morenti possono occasionalmente essere riconosciute come cellule vive dall'algoritmo di segmentazione e quindi distorcere i risultati riportati. Per iniziare l'analisi in MATLAB, create innanzitutto una cartella principale e copiate tutti gli script MATLAB in questa posizione.Creare quindi sottocartelle con i nomi delle varie specie di lievito e copiare le rispettive immagini TIFF in queste posizioni. Avviare MATLAB, aprire lo script MAIN. m, ed eseguire lo script.Nel menu, selezionare le specie di lievito da analizzare e iniziare l'elaborazione delle immagini. Ispezionare ed elaborare i file di output come richiesto utilizzando un editor di fogli di calcolo o un pacchetto statistico. Il flusso di lavoro produce file CSV separati da punto e virgola e file TIFF segmentati con oggetti cellulari rilevati e goccioline lipidiche.Di seguito sono riportate le cellule S.pombe di tipo selvatico coltivate nel complesso mezzo YES o nel mezzo EMM definito. Rispetto alle cellule coltivate nel mezzo SI, nel mezzo EMM sono state rilevate meno goccioline lipidiche e una maggiore intensità di colorazione per unità di volume cellulare. Inoltre, le singole goccioline lipidiche formate nel mezzo EMM erano più grandi e mostravano una maggiore intensità di colorazione totale.Ciò è in accordo con i precedenti risultati dell'aumento del contenuto lipidico immagazzinato nelle cellule coltivate in EMM. Successivamente, queste immagini mostrano cellule S.japonicus di colture esponenziali e stazionarie cresciute in mezzo SI. Le cellule che entrano in fase stazionaria hanno mostrato un numero marcatamente diminuito di goccioline lipidiche per unità di volume cellulare, mentre l'intensità della fluorescenza delle goccioline lipidiche normalizzata in volume è leggermente diminuita tra le due condizioni.Le prime goccioline lipidiche in fase stazionaria erano tipicamente di dimensioni moderatamente più grandi e avevano un'intensità di fluorescenza totale moderatamente più elevata rispetto alle goccioline provenienti da cellule in crescita esponenziale. Nelle cellule di S.cerevisiae cresciute fino alla fase esponenziale rispetto a quella stazionaria, le cellule stazionarie contenevano un po 'meno goccioline lipidiche per unità di volume rispetto alle cellule in crescita esponenziale. Tuttavia, la loro intensità di fluorescenza delle goccioline normalizzata in volume è quasi raddoppiata.Questo forte aumento del contenuto complessivo di goccioline lipidiche è dovuto all'intensità di fluorescenza molto più elevata e al volume delle singole goccioline lipidiche in fase stazionaria. Seguendo questa procedura, i dati di output possono essere aggregati in un pacchetto statistico come R per creare grafici di risultati riassunti ed eseguire test statistici su eventuali differenze osservate nel contenuto di goccioline lipidiche. In linea di principio, la pipeline di elaborazione delle immagini può essere utilizzata per l'analisi del contenuto di goccioline lipidiche in altri microrganismi o per analizzare altre strutture subcellulari simili a punti.

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Descriviamo un nuovo metodo quantitativo per l'identificazione lipidomica numerose specie lipidico nel lievito con sondaggio-scan ionizzazione elettrospray spettrometria di massa (ESI / MS). Questo metodo supera attualmente i metodi disponibili per l'identificazione e la quantificazione dei lipidi nella capacità di risolvere le varie forme molecolari dei lipidi, la sensibilità e la velocità.

Una valutazione quantitativa del Lipidome lievito con ionizzazione Electrospray Spettrometria di massa

Due tecniche per isolare gocce lipidiche cellulari da 1) cellule di lievito e 2) placente umane sono presentati. Il fulcro di entrambe le procedure è la densità centrifugazione in gradiente, dove lo strato risultante galleggiante contenente le goccioline può essere facilmente visualizzato occhio, estratto, e quantificato mediante analisi Western Blot per la purezza.

Isolamento dei lipidi cellulari Goccioline: due tecniche di purificazione partire da cellule di lievito e placente umane

Qui, descriviamo un protocollo per ottenere l'indice di gocciolina del lipido (indice di LD) per studiare la dinamica dei triacilgliceroli in cellule coltivate in esperimenti di alto-rendimento. Il dosaggio di indice di LD è un metodo facile e affidabile che utilizza BODIPY 493/503. Questo test non necessita di estrazione lipidica dispendious o analisi di microscopia.

Determinazione indice del lipido di recupero liquido di fluorescenza nel agente patogeno fungoso Ustilago Maydis

Questo protocollo descrive l'analisi dei compartimenti intracellulari etichettati fluorescentmente in lievito in erba utilizzando la microscopia confocale 4D (time-lapse 3D). I parametri di imaging vengono scelti per catturare segnali adeguati limitando i fotodanni. I plug-in Custom ImageJ consentono di tenere traccia delle strutture etichettate e di analizzarle quantitativamente.

Microscopia 4D del lievito

Qui, presentiamo l'imaging a cellule vive che è un metodo di microscopia non tossico che consente ai ricercatori di studiare il comportamento delle proteine e la dinamica nucleare nelle cellule di lievito di fissione viventi durante la mitosi e la meiosi.

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Vi presentiamo un protocollo che utilizza la cromatografia liquida accoppiata con la spettrometria di massa tandem per identificare e quantificare i principali lipidi cellulari in Saccharomyces cerevisiae. Il metodo descritto per una valutazione quantitativa delle principali classi lipidiche all'interno di una cellula di lievito è versatile, robusto e sensibile.

Analisi quantitativa del Lipidome cellulare di Saccharomyces Cerevisiae Utilizzando la cromatografia Liquida Accoppiata con la Spettrometria di Massa Tandem

Qui, dimostriamo un protocollo ottimizzato basato sulla fluorescenza BODIPY 493/503 per la caratterizzazione delle goccioline lipidiche nel tessuto epatico. Attraverso l'uso di proiezioni ortogonali e ricostruzioni 3D, il fluoroforo consente una discriminazione di successo tra steatosi microvescicolare e macrovescicolare e può rappresentare un approccio complementare ai protocolli istologici classici per la valutazione della steatosi epatica.

Analisi di goccioline lipidiche colorate con fluorescenza con ricostruzione 3D per la valutazione della steatosi epatica

Il presente studio descrive metodologie basate sulla decellularizzazione per la visualizzazione e la quantificazione della deposizione di tessuto adiposo intramuscolare (IMAT) attraverso il volume muscolare intatto, nonché la quantificazione delle metriche dei singoli adipociti che compongono l'IMAT.

Quantificazione basata sulla decellularizzazione dell'infiltrazione grassa del muscolo scheletrico

Il lievito di fissione viene utilizzato qui come ospite eterologo per esprimere proteine citoscheletriche batteriche come FtsZ e MreB come proteine di fusione traduzionali con GFP per visualizzare la loro polimerizzazione. Inoltre, i composti che influenzano la polimerizzazione vengono identificati mediante imaging utilizzando un microscopio a fluorescenza.

Il lievito di fissione come piattaforma per lo screening di farmaci antibatterici mirati alle proteine del citoscheletro batterico

La lipofagia è una forma selettiva di autofagia che comporta la degradazione delle goccioline lipidiche. Le disfunzioni in questo processo sono associate allo sviluppo del cancro. Tuttavia, i meccanismi precisi non sono ancora del tutto compresi. Questo protocollo descrive approcci di imaging quantitativo per comprendere meglio l'interazione tra autofagia, metabolismo lipidico e progressione del cancro.

Esplorare la regolazione del catabolismo delle goccioline lipidiche attraverso la lipofagia

Questo protocollo descrive in dettaglio due metodi di arresto del ciclo cellulare di lievito e rilascio opzionale, ed elabora l'uso della microscopia a fluorescenza per studiare i processi dipendenti dal ciclo cellulare in S. cerevisiae.

Manipolazione e analisi dei processi dipendenti dal ciclo cellulare nel lievito in gemmazione

Scopri l'analisi automatizzata delle goccioline lipidiche in lieviti come Schizosaccharomyces pombe e Saccharomyces cerevisiae mediante microscopia a fluorescenza. Questo metodo standardizzato consente quantificazioni rapide e riproducibili per studi metabolici ad alto rendimento.

Analisi del contenuto delle goccioline lipidi in Fissione e lieviti in forati utilizzando lelaborazione automatizzata delle immagini (Video) | JoVE Journal

Analisi del contenuto delle goccioline lipidi in Fissione e lieviti in forati utilizzando l'elaborazione automatizzata delle immagini

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