Rilevamento oncogenico della fusione genica utilizzando la reazione della catena di polimerasi multiplex ancorata seguita dal sequenziamento di nuova generazione

Questo protocollo viene utilizzato per il rilevamento di fusioni geniche informativo critico per campioni di tumore del paziente. Lo stato di fusione di dozzine di geni viene valutato simultaneamente in un unico saggio. Il vantaggio di questa tecnica è che posso identificare le fusioni geniche indipendentemente dall'identità del partner di fusione da campioni di tumore che sono stati elaborati per fissazione formulativa.

L'individuazione di una certa fusione genica nel campione di tumore clinico informa direttamente la diagnosi, la prognosi e la selezione del trattamento in molti tipi di cancro. È fondamentale capire che molte fusioni chiamate dall'algoritmo di analisi sono artefatti. Il compito più difficile quando si analizzano i dati è distinguere tra chiamate artefatto e fusione reale.

Inizia diluire l'acido nucleico totale per ottenere la concentrazione desiderata di RNA. Per ogni campione, trasferire 20 microlitri della diluizione nei tubi casuali del reagente di adescamento in un blocco di alluminio pre-refrigerato e mescolare tubazione su e giù da sei a otto volte. Far girare brevemente i campioni, trasferire l'intero volume su una piastra PCR da 96 po 'e sigillare con pellicola di sigillare a piastre.

Inserire la piastra in un termociclo, coprire con il pad di compressione e chiudere il coperchio. Incubare a 65 gradi Celsius per cinque minuti. Dopo l'incubazione, trasferire l'intero volume del prodotto di adescamento casuale nei primi tubi del nastro del reagente del filo.

Mescolare pipettando su e giù e girare brevemente verso il basso. Trasferire l'intero volume su una piastra PCR da 96 po' e sigillare con pellicola RT. Inserire la lastra nel termociclo e eseguire la reazione in base alle indicazioni del manoscritto.

Eseguire la sintesi del cDNA del secondo filamento, la riparazione e la legatura passo uno in base alle direzioni del manoscritto e procedere alla seconda fase di legazione. Per numerare il codice a barre molecolare o i tubi a nastro adattatore MBC, posizionare i tubi orizzontalmente con cerniere sul retro e utilizzare un marcatore permanente. Prendere la piastra di purificazione del tallone dal primo passaggio di legatura e trasferire 40 microlitri di ciascun campione nei tubi del nastro adattatore MBC, facendo attenzione a non disturbare il pellet di perline.

Mescolare i reagenti pipettando, far girare i tubi e trasferire l'intero volume al passaggio di legatura due tubi a nastro reagente. Mescolare i campioni, farli girare verso il basso e posizionarli in un blocco termociclo. Lasciare il coperchio riscaldato spento e eseguire il termociclo a 22 gradi Celsius per cinque minuti, seguito da 4 gradi Celsius tenere.

Successivamente, preparare le perline di pulizia della legatura vortice e aggiungendo 50 microlitri a un nuovo set di tubi a strisce PCR. Incubare sul magnete per un minuto e scartare il supernatante. Rimuovere i tubi del nastro dal magnete e riprestare le perline in 50 microlitri di tampone di pulizia della legatura pipettando su e giù.

Trasferire l'intero volume del campione dalla seconda fase di legatura nella striscia di perline di pulizia della legatura. Vortice i campioni da mescolare e lasciarli a temperatura ambiente per 10 minuti. Vortice il campione una volta a metà dell'incubazione.

Successivamente, vortice i campioni, farli girare verso il basso e incubare sul magnete per un minuto. Scartare il supernatante e aggiungere 200 microlitri di tampone di pulizia della legatura fresca. Vortice per rimorsi, girare verso il basso e posizionare sul magnete per un minuto.

Dopo i due lavaggi, eseguire un terzo lavaggio utilizzando acqua ultrapura al posto del tampone. Rimostrare le perline in 20 microlitri di idrossido di sodio da 5 millimetri e trasferire i campioni su una piastra PCR da 96 po '. Posizionare la piastra in un termociclo con un pad di compressione e eseguirla a 75 gradi Celsius per 10 minuti, seguita da una tenuta di 4 gradi Celsius.

Una volta che i campioni si sono raffreddati a 4 gradi Celsius, posizionare la piastra su un magnete per almeno tre minuti e procedere con la prima PCR. Preparare le reazioni PCR aggiungendo due microlitri di primer GSP1 a ciascun pozzo della prima striscia di reagente PCR. Trasferire 18 microlitri del secondo prodotto di pulizia della legatura sui primi tubi a nastro reagente PCR e mescolare tubazione su e giù.

Far girare i campioni e trasferirli su una piastra PCR da 96 po'. Posizionarli nel termociclo e far funzionare la PCR secondo le indicazioni del manoscritto. Procedere con la purificazione delle perline aggiungendo 20 microlitri del prodotto PCR a una piastra inferiore a U riempita con 24 microlitri di perline di purificazione per pozzo.

Pipettare su e giù per mescolare e lasciare la piastra a temperatura ambiente per cinque minuti, quindi incubare la piastra sul magnete per due minuti. Scartare il supernantante dalle perline e lavarlo due volte con 200 microlitri di 70% di etanolo. Dopo il lavaggio finale, rimuovere tutto l'etanolo e lasciare asciugare l'aria del campione per due minuti.

Rimuovere la piastra dal magnete e rimescolare le perline in 24 microlitri di Tris-HCl da 10 millimetri e pH 8.0. Incubare il magnete per tre minuti e quindi riposizionare la piastra sul magnete per due minuti. Inizia la quantificazione della libreria preparando da una a cinque diluizioni del secondo prodotto PCR in Tris-HCl da 10 millimetri.

Segui questo con una diluizione seriale di 1:199, 1:199 e 20:80 in Tris-HCl da 10 millimetri con 05% di polisorbato. Impostare la PCR chiave aggiungendo sei microlitri di master mix a ciascun pozzo di una piastra ottica da 96 poggia, seguiti da quattro microlitri della diluizione o dello standard appropriato. Ruotare la piastra e caricarla nello strumento qPCR.

Eseguire qPCR secondo le indicazioni del manoscritto. Al termine della quantificazione della libreria, diluire tutte le librerie in due nanomolari con Tris-HCl da 10 millimetri. Crea un pool di biblioteche combinando 10 microlitri di ogni libreria normalizzata in un tubo di microcentrifugo da 1,5 millilitri.

Successivamente, preparare la libreria di amplicon denaturati, o piscina DAL, combinando 10 microlitri della piscina della biblioteca con 10 microlitri di idrossido di sodio normale 0,2 e incubando la miscela per cinque minuti a temperatura ambiente. Dopo l'incubazione, aggiungere 10 microlitri di Tris-HCl da 200 millimetri a pH 7.0, seguiti da 970 microlitri di HT1 Hybridization Buffer. Crea il tubo di carico finale combinando 300 microlitri di HT1, 25 microlitri di PhiX picomolare e 675 microlitri della piscina DAL.

Aggiungere l'intero volume del tubo di carico al pozzo campione della cartuccia del reagente del sequencer e caricare la cartuccia nel sequencer. Iniziare selezionando il campione di controllo positivo e assicurarsi che tutte le fusioni previste e le isoforme oncogeniche siano state rilevate e siano elencate nella scheda prove forti. Per ogni campione, esaminare il valore di controllo medio univoco dei siti di avvio per GSP2, quindi visualizzare le letture di supporto per ogni potenziale fusione facendo clic sul collegamento Visualizza che porta l'utente a una visualizzazione JBrowse basata sul Web di pileup di singole letture di supporto per la fusione.

Conferma che le letture sono per lo più libere da disallineamenti, ma più di 30 basi delle letture si allineano con il partner di fusione, e che le sequenze adiacenti al punto di rottura tra i geni e i siti di legame primer sono libere da inserimenti o eliminazioni. È fondamentale garantire che ogni fusione di chiamata sia generalmente priva di disallineamento e che una parte significativa delle letture si allinei al partner di fusione. Questo protocollo è stato utilizzato per studiare lo stato di fusione genica in un campione di adenocarcinoma polmonare.

Il riepilogo mostra forti fusioni di prove e la pagina Leggi statistiche mostra le metriche dell'esempio. Questo campione mostra una buona qualità dell'RNA, quindi i risultati negativi sarebbero riportati se non fossero state trovate fusioni. Una chiamata di fusione legittima ha un numero elevato di letture di supporto, un'alta percentuale di letture dal primer che supporta la fusione e un numero elevato di siti di avvio.

La visualizzazione delle letture dimostra un buon allineamento alle grandi aree del partner di fusione. Al contrario, una chiamata di fusione artefatto ha metriche di supporto inferiori e un alto tasso di errore durante il mapping al partner. Le chiamate di fusione artefatto effettuate dall'algoritmo di analisi sono comuni.

È fondamentale ispezionare manualmente ogni chiamata per assicurarsi che rappresenti una vera fusione genica nel campione del paziente.