Name: Fluorescently etichettato batteri come un tracciante per rivelare nuovi percorsi di flusso organico di carbonio negli ecosistemi acquatici (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: Scopri un metodo per quantificare i tassi di pascolo nei procarioti acquatici usando prede fluorescenti come traccianti. Questa tecnica consente di visualizzare il flusso di carbonio negli ecosistemi acquatici.

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Questo studio è stato sostenuto dalla Fondazione scientifica ceca nell'ambito della sovvenzione di ricerca 13-00243S e 19-16554S assegnata rispettivamente a K. e D. S. Questo articolo è stato sostenuto anche dal progetto "Biomanipulation as a tool to improving water quality of dim reservoirs" (No C.02.1.01/0.0/0.0/16_025/0007417), finanziato dal Fondo europeo di sviluppo regionale, nel programma operativo Ricerca, Sviluppo e l'istruzione.

1. Raccolta di campioni
<ol><li>
Raccolta del campione di acqua del serbatoio: il primo caso di studio (Exp I; basso ambiente in situ predatore e sistema di abbondanza di prede)<ol>
<li>Raccogliere i campioni d'acqua dalla posizione desiderata ad una profondità adeguata. Conservare i campioni in un dispositivo di raffreddamento a temperatura controllata riempito a temperatura situ (evitando lo shock della temperatura; va notato che i tassi di assorbimento dei protisti sono dipendenti dalla temperatura) durante il trasporto in laboratorio. NOTA: Il nostro campionamento è stato condotto nel serbatoio di zourov a forma di canyon meso-eutrofica (Boemia meridionale, volume 34,5 x 106 m3, profondità massima 43 m, tempo medio di ritenzione 100 giorni, dimictico). Il sito di campionamento era situato ad una profondità di 30 m, vicino alla diga. Un campione misto a una profondità di 0,5 m è stato raccolto da un campionatore Friedinger 2-l.</li>
		<li>Proseguire fino alla sezione 1.2 il prima possibile.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Raccolta di liquidi dalle trappole delle piante carnivore Utricularia reflexa: il secondo caso di studio (Exp II; un sistema con elevata abbondanza di predatori e prede, volume campione estremamente ridotto)<ol>
<li>Scuotere delicatamente le piante sott'acqua, togliere dal contenitore di coltivazione e metterle su materiale assorbente per assorbire l'acqua in eccesso. A seconda della robustezza delle piante e delle dimensioni delle trappole, scegli 8-10 individui vegetali.</li>
		<li>Dividere ogni tiro in parti approssimativamente uguali contando nodi foglia cuscinetto organi intrappolamento. Ogni segmento di tiro servirà a raccogliere campioni misti che rappresentano trappole giovani, di mezza età e vecchie.</li>
		<li>Attaccare una sottile fiala di vetro e una fiala Eppendorf per la raccolta dei campioni in una pompa peristaltica. Procedere per inserire la punta capillare nell'apertura della trappola. Utilizzando la pompa a vuoto, aspirare tutto il fluido da ogni trappola fino a 900 x 100 l di fluido trappola viene raccolto per ogni categoria di età trappola.</li>
		<li>Utilizzare sottocampioni triplicati di 200 gradi l del fluido trappola raggruppato per esperimenti di pascolo protistan. Elaborarli immediatamente come descritto nella sezione 3. Conservare i restanti 300 l. del campione per tutte le altre analisi dei componenti microbici che vivono nel fluido, come descritto di seguito (sezione 2).</li>
		<li>Procedere immediatamente alla sezione 2.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Fissazione dei campioni raccolti
<ol><li>Exp I e II: fissare sottocampioni di acqua/fluido trap per l'enumerazione batterica (sezione 4; circa 20 mL e 0,3 mL, rispettivamente) con formaldeide per almeno 1 h per ottenere una concentrazione di volume:volume finale del 2% in ogni campione. NOTA: Maneggiare la formaldeide esclusivamente nella cappa dei fumi e indossare i guanti in ogni momento manipolando i campioni.</li>
</ol>3. Filtrazione del campione
<ol><li>Diluizione del campione (Exp I): non è necessaria alcuna diluizione per i campioni di acqua del serbatoio. (Exp II): diluire il campione di fluido di trappola 10x-100x con acqua MQ priva di particelle per ottenere una distribuzione adeguata dei microbi bersaglio sulle superfici filtranti prima del conteggio tramite microscopia epifluorescenza.</li>
	<li>Filtrare 1-2 mL (Exp I) dell'acqua del serbatoio o 10-30 -L (Exp II) del sottocampione del fluido trappola per il conteggio batterico su filtri neri da 0,2 m a dimensione dei pori, utilizzando un imbuto di filtrazione (diametro di 25 mm).</li>
	<li>Macchiare i filtri con DAPI (4',6-diamidino-2'-phenylindole dihydrochlor, 0.2% concentrazione finale) per 4 min. NOTA: Evitare la contaminazione della pelle e della superficie di lavoro e indossare guanti.</li>
	<li>Posizionare il filtro con microbi concentrati su una goccia di olio di immersione (per la microscopia fluorescente) su un vetrino del microscopio. Posizionare un'altra goccia d'olio al centro del filtro e coprire con un coperchio, assicurandosi che l'olio sia distribuito uniformemente.</li>
	<li>A questo punto, preferibilmente i campioni di processo immediatamente, o in alternativa, conservarli in freezer (-20 gradi centigradi) per diverse settimane o mesi fino a ulteriori analisi.</li>
</ol>4. Enumerazione dei numeri batterici sui filtri
<ol><li>Posizionare il vetrino al microscopio dell'epifluorescenza (con il filtro impostato corrispondente al DAPI fluorocro). Inserire una griglia di conteggio 10 x 10 in uno degli oculari. Spostare la diapositiva in una posizione casuale.</li>
	<li>Quantificare le cellule batteriche (fluorescenza blu) nell'area della griglia di conteggio (sotto l'ingrandimento 1000x). Nei conteggi, includere le celle che attraversano i bordi sinistro e superiore della griglia di conteggio, escludendo quelle situate sui bordi destro e inferiore.</li>
	<li>Passare a un'altra posizione casuale e ripetere l'enumerazione su almeno 10-15 griglie di conteggio, pari a 500 celle contate in totale.</li>
	<li>Stabilire un fattore di conversione per un determinato microscopio e ingrandimento, basato sulla conoscenza del rapporto tra l'area di una griglia e l'area di filtrazione effettiva totale del filtro. Quindi, dividere il numero totale di cellule contate per il numero di griglie contate, producendo un numero medio di batteri per griglia.</li>
	<li>Moltiplicare quest'ultimo parametro per il fattore di conversione stabilito e normalizzare il numero risultante per mL di un campione (a seconda del volume del campione filtrato) per ottenere l'abbondanza batterica totale per mL.</li>
</ol>5. Determinazione dell'abbondanza del prozieno
<ol><li>Fissare il campione d'acqua (Exp I) o i sottocampioni del fluido trap (Exp II) con glutaraldeide (1% di concentrazione finale, più adatto per i campioni con presenza di particelle contenenti clorofilla da trattare giorni a settimane dopo la fissazione) o utilizzando il tecnica di decolorazione formol-thiosulfate specificata di seguito. NOTA: Entrambe le tecniche di conservazione impediscono l'egestione del materiale ingerito dai vacuoli alimentari dei protisti8.</li>
	<li>Per quanto riguarda la tecnica di decolorazione formol-thiosulfate, aggiungete 100 l/1 di soluzione di Lugol in 20 mL/200 L del sottocampione del fluido acqua/trappola (rispettivamente Exp I/Exp II).</li>
	<li>Seguire immediatamente con l'aggiunta di 0,5 mL/50 l di formalina con buffer borate, quindi 20 l/2 l del 3% di sodio thiosulphate (rispettivamente Exp I/Exp II). NOTA: Il tiosulfato di sodio decolora il colore giallo di Lugol per consentire l'osservazione delle cellule al microscopio a epifluorescenza8.</li>
	<li>Filtrare un volume noto di campione (a seconda del numero di protisti bersaglio) su filtri in policarbonato nero di dimensioni di pori di 1 m.</li>
	<li>Stimare il numero delle specie protistiche contando almeno 200 cellule sotto ingrandimento 600x utilizzando la griglia di conteggio (vedi sopra).</li>
	<li>Ridurre il volume del campione sotto vuoto nell'imbuto di filtrazione con vuoto basso a circa 2 mL. Quindi, rilasciare la sottopressione e aggiungere il fluorocro DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole dihydrochlor13, 0.2% concentrazione finale) per 2 min.</li>
</ol>6. Determinazione della struttura comunitaria dei ciliati in campioni di plancton
NOTA: le comunità di ciliate in habitat d'acqua dolce sono molto diverse14,15, 16,18, e la loro determinazione microscopica è impegnativo. Ordinare i gruppi di ciliati in gilde funzionali10,14,16,17 consente un'analisi più dettagliata di diversi gruppi di ciliati come batteriativori pelagici.
<ol><li>Valutare la struttura della comunità ciliate combinando quanto segue:<ol>
<li>Campioni macchiati DAPI nella microscopia a epifluorescenza (per localizzare le cellule ciliato con fluorescenza luminosa di macro e micronuclei di diverse dimensioni e morfologia) combinate con l'assorbimento di batteri fluorescenti etichettati (FLB8; per i dettagli, vedere sotto), tracciando la capacità dei ciliati di nutrirsi di batteri.</li>
		<li>Osservazione del campione dal vivo in casi selezionati17,19. Per ulteriori dettagli sugli approcci e sui criteri di cui sopra utilizzati per raggruppare i ciliati in diverse categorie tassonomiche, vedere le pubblicazioni precedenti16,17. NOTA: Studi citati hanno indicato che tra i ciliati, le specie onnivore della Sticofia (generazioni Halteria e Pelagohalteria)e Oligotrichia (vale a dire Rimostrombidium spp.) sono i più importanti consumatori pelagici di batterioplancton in una stragrande maggioranza degli habitat d'acqua dolce10,17,18.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. Stima dei tassi di pascolo delle ciliati
<ol><li>Calcolare i tassi di assorbimento dei ciliati sui batteri in base alle variazioni del numero medio di traccianti [cioè, FLB8 per ciliato relativo al tempo di incubazione (5-15 min)] e alla quantità di tracciante di FLB aggiunto, che rappresenta al massimo il 5%-15% dei batteri totali.</li>
	<li>Per confrontare i tassi di assorbimento tra le diverse specie protivedi, normalizzare i tassi di assorbimento come il numero di batteri per ciliato all'ora, con calcoli basati sul tempo effettivo di incubazione e sulla proporzione del tracciante FLB aggiunto. NOTA: Lo schema generale dell'applicazione del metodo FLB per stimare sia i tassi di bacteridi di bacterivory specifici delle cellule o specie che quelli di bacteridi di massa in campioni naturali è illustrato nella Figura 1.</li>
	<li>Preparazione di FLB da ceppi batterici indigeni in un ambiente d'acqua dolce8<ol>
<li>Selezionare una dimensione adatta (volume medio delle cellule e morfologia dei batteri) e la morfologia dei batteri in modo da imitare efficacemente le dimensioni tipiche delle cellule batterioplancton/batteriche nel sistema acquatico in fase di studio. NOTA: Per Exp I è stata utilizzata una miscela di ceppi isolati dalla posizione di studio del genere Limnohabitans e Polynucleobacter (cioè, tipico, batterioplancton altamente abbondante in laghi e laghetti)20. Per informazioni dettagliate sulla morfologia e sulle dimensioni dei ceppi, vedere le pubblicazioni precedenti3,17,18,21.</li>
		<li>Raccogliere le cellule batteriche dalla coltura per centrifugazione (5.000 x g) per 15 min nella prima fase stazionaria e mescolarle ad un rapporto numerico che produce MCV - SD delle cellule nella miscela corrispondente al tipico MCV dei batteri nella posizione scelta.</li>
		<li>Sospendere i pellet in 10 mL di salina con buffer fosfato (PBS; pH - 9).</li>
		<li>Aggiungere 2 mg del colorante fluorescing giallo-verde 5-(4,6-dichlorotriazin-2-yl) aminofluoresceina (DTAF, si lega alle proteine) alla sospensione cellulare nel tamponamento fosfato-salina, e incubare in un bagno d'acqua di 60 gradi centigradi per 2 h.</li>
		<li>Dopo l'incubazione, centrificare le cellule verso il basso, denegare la soluzione DTAF e lavare e centrifugare 3x con PBS.</li>
		<li>Dopo il lavaggio finale, sospendere nuovamente le cellulein 20 mL del tampone PP i-saline.</li>
		<li>Vorticare le sospensioni FLB e pipetta 1,5 mL aliquote in 2 mL crio-flacone, quindi mantenere congelati (a -20 ) in PPi-saline buffer fino all'uso.</li>
		<li>Pre-filtro PPi-saline buffer attraverso un filtro in policarbonato da 0,2 m da utilizzare nella fase successiva.</li>
		<li>Per determinare la concentrazione di FLB, trasferire un piccolo aliquota (di solito 20-40 L) a 2 mL di buffer PPi-saline privo di particelle, sonicare a 30 W per diversi 2 s raffiche e filtrare su uno 0,2 m di filtro nero policarbonato per l'enumerazione tramite epifluorescenza microscopia (ingrandimento 1.000X) con le impostazioni del filtro ottico per DTAF (448 nm/520-540 nm).</li>
	</ol></li>
	<li>Tecnica di tracciamento per la stima del bacterivory di ciliato<ol>
<li>Per gli esperimenti di pascolo in habitat planctonici naturali, erogare campioni da 300 mL in flaconi da 1 L ben risciacquati e incubare a temperatura in situ per 15 min (per consentire ai protisti di riprendersi dallo shock di movimentazione).</li>
		<li>Aggiungere i traccianti FLB per costituire il 5%-15% dei batteri totali, con le quantità aggiunte a seconda della stagione e della temperatura dell'acqua. NOTA: C'è uno spettro molto ampio, dipendente dalla stagione nei tassi di assorbimento specifici delle specie di ciliato che coprono diversi ordini di grandezza (cioè, da 101-104 batteri ciliati-1 all'ora)10,16, 17,18,22,23,24.</li>
		<li>Nei periodi di maggiore occorrenza di ciliati con alti tassi di assorbimento (di solito durante l'estate), eseguire anche un'incubazione parallela con aggiunte FLB molto basse, costituendo solo il 2%-4% dei batteri totali per evitare un carico eccessivo di vacuoli di ciliato da parte del tracciante FLB (vedi esempi nella Figura 2).</li>
		<li>Incubare campioni di ciliato/plancton con FLB per 5-15 min.</li>
		<li>Ci sono due possibilità per la fissazione del campione per prevenire l'egestione del materiale ingerito da vacuoli alimentari dei protisti8. Terminare le incubazioni con l'aggiunta dell'1% di glutaraldeide (concentrazione finale che è più adatta per campioni con particelle contenenti clorofilla, come le alghe). In alternativa, utilizzare 100 l/10 l della soluzione di Lugol in un sottocampione di 20 mL/200 L di acqua/fluido trap, seguito immediatamente dall'aggiunta di 0,5 mL/10 l di formalina con tampone di borate, quindi 200 l/2 l del 3% di sodio thiosulphate (Exp I/Exp II).</li>
	</ol></li>
	<li>Dopo aver aggiunto il fissativo, lasciare riposare i campioni per almeno 1 h al buio a 4 gradi centigradi per garantire una conservazione accurata delle cellule ciliate.</li>
	<li>Prendiamo i sottocampioni naturali del plancton da 4-30 mL/10-30 -L (rispettivamente Exp I/Exp II; il volume dipende dall'abbondanza di ciliati) e macchia con DAPI (concentrazione finale dello 0,2% wt/vol; per i dettagli, vedi il passo 3.2 sopra).</li>
	<li>Passare attraverso 1 filtri neri m e ispezionare tramite microscopia epifluorescenza per contare ciliati (ingrandimento 600x) ed enumerare il numero di traccianti FLB ingeriti (per lo più a ingrandimento 1000x) come descritto nelle pubblicazioni precedenti2,17 . Ispezionare i campioni entro 7 giorni dalla conservazione.</li>
	<li>Per stimare il pascolo totale protozoo/specie specifico, moltiplicare i tassi medi di assorbimento di tutti i ciliati, o solo delle specie di ciliati rilevate dall'abbondanza in situ.</li>
	<li>L'esempio del calcolo dei tassi di assorbimento per cellula da dati in situ provenienti dal serbatoio dell'acqua di zmov è descritto come segue:<ol>
<li>Si supponga che la concentrazione batterica sia 3,55 x 106 batteri/mL e il tracciante FLB aggiunto sia 0,25 x 106 FLB/mL, che produce una somma di 3,8 x 106 batteri/mL delle particelle batteriche totali (batteri naturali - FLB - 100% di particelle di preda) disponibile per i protisti fagotrofi nel campione naturale. NOTA: I traccianti FLB aggiunti rappresentano quindi il 6,58% (un progetto di 0,25/0,038) di particelle batteriche totali. Il numero medio di FLB per Halteria sp. è di 6,2 FLB in incubazioni di 5 min.</li>
		<li>Per normalizzare l'assorbimento all'ora, utilizzare il seguente calcolo: (6,2 x 12)/(6,58/100) - 1131 batteri per cellula Halteria/h. NOTA: per ulteriori esempi di distribuzioni dei singoli tassi di assorbimento di Halteria sp. rilevati sotto temperature variabili dell'acqua, quantità (come percentuali) di tracciante FLB aggiunto e diversi tempi di incubazione con FLB, vedere figura 3.</li>
	</ol></li>
</ol>

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<li>Stabell, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ciliate+bacterivory+in+epilimnetic+waters%5BTitle%5D)+AND+%22Aquatic+Microbial+Ecology%22%5BJournal%5D)">Ciliate bacterivory in epilimnetic waters.</a> Aquatic Microbial Ecology. 10, 265-272 (1996).</li>
<li>Zingel, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ciliates+are+the+dominant+grazers+on+pico-+and+nanoplankton+in+a+shallow%2C+naturally+highly+eutrophic+lake%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Ecology%22%5BJournal%5D)">Ciliates are the dominant grazers on pico- and nanoplankton in a shallow, naturally highly eutrophic lake.</a> Microbial Ecology. 53, 134-142 (2007).</li>
<li>Bickel, S. L., Tang, K. W., Grossart, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ciliate+epibionts+associated+with+crustacean+zooplankton+in+german+lakes%3A+distribution%2C+motility%2C+and+bacterivory%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Ciliate epibionts associated with crustacean zooplankton in german lakes: distribution, motility, and bacterivory.</a> Frontiers in Microbiology. 3 (243), (2012).</li>
<li>Sirová, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hunters+or+gardeners%3F+Linking+community+structure+and+function+of+trap-associated+microbes+to+the+nutrient+acquisition+strategy+of+a+carnivorous+plant%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiome%22%5BJournal%5D)">Hunters or gardeners? Linking community structure and function of trap-associated microbes to the nutrient acquisition strategy of a carnivorous plant.</a> Microbiome. 6, 225(2018).</li>
<li>Šimek, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ecological+traits+of+a+zoochlorellae-bearing+Tetrahymena+sp.+%28Ciliophora%29+living+in+traps+of+the+carnivorous+aquatic+plant+Utricularia+reflexa%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Eukaryotic+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Ecological traits of a zoochlorellae-bearing Tetrahymena sp. (Ciliophora) living in traps of the carnivorous aquatic plant Utricularia reflexa.</a> Journal of Eukaryotic Microbiology. 64, 336-348 (2017).</li>
<li>Pitsch, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+green+Tetrahymena+utriculariae+n.+sp.+%28Ciliophora%2C+Oligohymenophorea%29+with+its+endosymbiotic+algae+%28Micractinium+sp.%29%2C+living+in+the+feeding+traps+of+a+carnivorous+aquatic+plant%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Eukaryotic+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The green Tetrahymena utriculariae n. sp. (Ciliophora, Oligohymenophorea) with its endosymbiotic algae (Micractinium sp.), living in the feeding traps of a carnivorous aquatic plant.</a> Journal of Eukaryotic Microbiology. 64, 322-335 (2017).</li>
<li>Nielsen, J. M., Clare, E. L., Hayden, B., Brett, M. T., Kratina, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diet+tracing+in+ecology%3A+Method+comparison+and+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Ecology+and+Evaluation%22%5BJournal%5D)">Diet tracing in ecology: Method comparison and selection.</a> Methods in Ecology and Evaluation. 9, 278-291 (2018).</li>
<li>Beisner, B. E., Grossart, H. P., Gasol, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+methods+for+estimating+phago-mixotrophy+in+nanophytoplankton%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Plankton+Research%22%5BJournal%5D)">A guide to methods for estimating phago-mixotrophy in nanophytoplankton.</a> Journal of Plankton Research. , 1-13 (2019).</li>
<li>Dolan, J. D., Šimek, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processing+of+ingested+matter+in+Strombidium+sulcatum%2C+a+marine+ciliate+%28Oligotrichida%29%5BTitle%5D)+AND+%22Limnology+and+Oceanography%22%5BJournal%5D)">Processing of ingested matter in Strombidium sulcatum, a marine ciliate (Oligotrichida).</a> Limnology and Oceanography. 42, 393-397 (1997).</li>
<li>Massana, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Grazing+rates+and+functional+diversity+of+uncultured+heterotrophic+flagellates%5BTitle%5D)+AND+%22The+ISME+Journal%22%5BJournal%5D)">Grazing rates and functional diversity of uncultured heterotrophic flagellates.</a> The ISME Journal. 3, 588-596 (2009).</li>
<li>Grujčić, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryptophyta+as+major+freshwater+bacterivores+in+experiments+with+manipulated+bacterial+prey%5BTitle%5D)+AND+%22The+ISME+Journal%22%5BJournal%5D)">Cryptophyta as major freshwater bacterivores in experiments with manipulated bacterial prey.</a> The ISME Journal. 12, 1668-1681 (2018).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Decifrare l'interazione trofica nei sistemi acquatici è sempre impegnativo28, soprattutto nelle scale nano-plancton che coinvolgono protisti e le loro prede, batteri. Quando si tratta di percorsi di assorbimento dei nutrienti e quantificazione, l'applicazione di metodi utilizzati con successo a livelli trofici più elevati è meno possibile, a causa dell'elevata complessità delle interazioni biotiche. Questi includono, ad esempio, approcci stabili di etichettatura degli isotopi. Questo protocollo mo...

I prokaryote eterotrofici sono una componente biologica chiave nei sistemi acquatici e rappresentano una frazione significativa di plancton biomassa1,2,3. I fattori che controllano la loro abbondanza, diversità e attività sono cruciali per comprendere il loro ruolo nel ciclismo biogeochimico (cioè il destino del carbonio organico e di altri nutrienti e il flusso di energia dai procarioti ai livelli più alti del trofico). Il pascolo protozoo è uno di questi fattori importanti. Bacterivoryo di nanoflagellati e ciliati eterotrofici impone un forte controllo dall'alto verso il basso sull'abbondanza procaritmica, funzione della comunità, struttura, diversità, e anche morfologia cellulare e tasso di crescita di particolari gruppi batterici4, 5,6. In alcuni sistemi, i protisti servono come la principale causa di mortalità batterica6,7.
L'approccio standard utilizzato per valutare il batterio protozoo, che è stato utilizzato da qualche tempo, prevede l'uso di batteri etichettati fluorescentmente (FLB) come analoghi prede e microscopia epifluorescenza. I tassi di assorbimento specifici delle cellule possono essere determinati quantificando il numero di particelle di prede etichettate nei vacuoli alimentari del Prozistan in un corso temporale selezionato8. Questo approccio presenta diversi vantaggi. Tracer viene aggiunto a campioni naturali con assemblaggi di predatori naturali e prede. C'è una manipolazione minima del campione prima dell'incubazione, un'alterazione minima del campione da parte del tracciante FLB aggiunto e i tempi di incubazione sono brevi per garantire risultati sonori ottenuti in condizioni vicine alle condizioni in situ. In alternativa, in ambienti con un basso numero di protisti batteriosi o zooplancton (ad esempio, sistemi marini offshore), i tassi di scomparsa di FLB aggiunti a campioni in quantità basse (2%-3% tracciante) possono essere rilevati tramite citometria di flusso a lungo termine (12-24 h) esperimenti di incubazione. Quindi, i numeri di FLB all'inizio e all'estremità (integrando l'impatto di tutti i batteri) sono quantificati dalla citometria di flusso (per i dettagli, vedi la precedente pubblicazione9). Tuttavia, tale parametro rappresenta solo i tassi totali di bacterivory aggregati che non possono essere direttamente attribuiti a particolari gruppi di pascoli o specie di protistan e zooplancton.
Nel complesso, quantificare con precisione e con significato ecologico i tassi di mortalità batterica specifici delle specie di prozie o del morfotipo nell'ambiente acquatico può essere difficile. Alcuni protisti sono pascoli selettivi, e la dimensione e la forma cellulare del tracciante FLB aggiunto può distorcere i tassi naturali di ingestione delle prede10,11. Inoltre, l'attività e il metabolismo del prozistan sono altamente sensibili alla temperatura12; pertanto, la quantità di tracciante FLB aggiunto deve essere attentamente manipolata per ogni singolo tipo di campione (non solo in base all'abbondanza naturale, alle dimensioni e alla morfologia dei batteri e ai tipi prevalenti di batteri, ma anche sulla temperatura). La maggior parte degli studi si concentrano sull'attività di pascolo del protistan di massa; tuttavia, il batterio di specifiche specie protivazie spesso ha un valore informativo molto più elevato e può essere preferibile. In questo caso, è necessaria la conoscenza tassonomica delle specie protistiche presenti in un campione e la comprensione del loro comportamento. Di conseguenza, sono necessarie notevoli quantità di tempo e manodopera per ottenere risultati sonori su tassi specifici di batterio attribuibili a un particolare gruppo o specie di protistan.
Nonostante queste difficoltà, questo approccio rimane lo strumento più adatto attualmente disponibile per valutare il protivo in ambienti naturali. Presentato qui è un metodo completo e facile da seguire per l'utilizzo di FLB come tracciante negli studi di ecologia microbica acquatica. Tutti gli aspetti problematici menzionati dell'approccio sono presi in considerazione e viene descritto un flusso di lavoro migliorato, con due esperimenti da ambienti contrastanti e specie di ciliato a contrasto come esempi.
Il primo caso di studio è stato condotto in un ambiente epiliminico dal serbatoio di acqua mesotrofica di zmov nella Repubblica Ceca, che mostra abbondanze di pascolo e batteri comparabili alla maggior parte dei corpi d'acqua dolce di superficie (cfr5,7). Il secondo caso di studio è stato condotto nell'ambiente altamente specifico all'interno di trappole della pianta carnivora acquatica Utricularia reflexa, che ospita un numero estremamente elevato di entrambi i ciliati mixotrofici al pascolo (Tetrahymena utriculariae) cellule batteriche. Vengono mostrati i calcoli dei tassi di pascolo specifici delle cellule e delle scorte permanenti batteriche in entrambi i tipi di campione. Viene quindi discussa una serie di interpretazioni ecologiche dei risultati e vengono infine suggeriti esempi di possibili studi di follow-up.

<table><tbody><tr><td>0.2-&micro; m filtri delle dimensioni dei pori&nbsp;</td><td>SPI fornisce, https://www.2spi.com/</td> <td>B0225-MB</td><td>Nero, filtri a membrana in policarbonato track etch, diametro approprite per apparecchi di filtraggio utilizzati</td></tr><tr><td>5-(4,6-diclorotriazin-2-il) amminofluoresceina (DTAF)</td><td>Pipette</td> automatiche di qualsiasi marca <td></td><td></td></tr><tr><td>con volumi regolabili&nbsp;</td><td>Qualsiasi marca, varie dimensioni</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>22 000 x g</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cryovials</td><td>Qualsiasi marca, 2 mL formato</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4&acuto;,6-Diamidino-2&acuto;-fenilindolo dicloridrato)</td><td>Qualsiasi marca&nbsp;</td><td></td><td>1 mg di ml-1</td></tr><tr><td>Microscopio per epiflorescenza</td><td>Ingrandimento da 400 x fino a 1000 x</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Filtri appropriati per la visualizzazione nell'intervallo</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td> DAPI e DTAF <td>Griglia di conteggio in uno degli oculari</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Apparato filtrante</td><td>Solitamente con un diametro di 25 mm&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Formaldeide</td><td>Una marca per microscopia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldeide</td><td>Una marca per microscopia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Olio da immersione per microscopia</td><td>Olio specifico a bassa fluorescenza</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lugol&acute; Soluzione di</td><td>qualsiasi marca o vedere commento</td><td></td><td>Preparare una soluzione alcalina di Lugol' come segue: Soluzione 1 - sciogliere 10 g di ioduro di potassio in 20 ml in acqua MQ, quindi aggiungere 5 g di iodio. Soluzione 2 - aggiungere 5 g di acetato di sodio&nbsp; a 50 ml di acqua MQ. Aggiungere la soluzione 2 alla soluzione 1 e mescolare accuratamente</td></tr><tr><td>Formalina stabilizzata con metanolo</td><td>Qualsiasi marca disponibile per scopi</td><td></td><td></td>di microscopia</tr><tr><td>Vetrini per microscopio e vetrini coprioggetti</td><td>Qualsiasi marca prodotta per scopi di microscopia&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MQ acqua per diluire campioni</td><td>Qualsiasi marca &nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS; pH = 9)</td><td>Qualsiasi marca</td><td></td><td>0,05 M Soluzione di Na2HPO4-NaCl, regolata a pH 9</td></tr><tr><td>PPi-soluzione salina</td><td>Qualsiasi marca</td><td></td><td>0,02 M Soluzione di Na4P2O7-NaCl. Aggiungere 0,53 g di Na4P2O7 a 100 ml di acqua MQ più 0,85 g di NaCl&nbsp;</td></tr><tr><td>Dispositivo di campionamento&nbsp;</td><td>Adatto per ottenere un campione rappresentativo&nbsp;</td><td></td><td>ad es. campionatore Friedinger per plancton lacustre</td></tr><tr><td>Soluzione di tiosolfato di sodio</td><td>Qualsiasi marca</td><td></td> La <td>soluzione al 3% viene utilizzata nel protocollo</td></tr><tr><td>Sonicatore</td><td>Qualsiasi marca</td><td></td><td>30 W</td></tr><tr><td>Vortice</td><td>Qualsiasi marca che consenta una miscelazione accurata dei soluti e dei campioni</td><td></td><td></td>Bagno d'acqua</tr><tr><td></td><td>Qualsiasi marca che consenta di mantenere la temperatura a 60 gradi E</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

fluorescently etichettato batteri come un tracciante per rivelare nuovi percorsi di flusso organico di carbonio negli ecosistemi acquatici

Fluorescently Labeled Bacteria as a Tracer to Reveal Novel Pathways of Organic Carbon Flow in Aquatic Ecosystems

Chiarire le interazioni trofiche, come la predazione e i suoi effetti, è un compito frequente per molti ricercatori in ecologia. Lo studio delle comunità microbiche ha molte limitazioni, e determinare un predatore, preda, e tassi predatori è spesso difficile. Presentato qui è un metodo ottimizzato basato sull'aggiunta di prede fluorescenti etichettate come tracciante, che consente una quantificazione affidabile dei tassi di pascolo negli eucarioti predatori acquatici e la stima del trasferimento di nutrienti a livelli trofici più elevati.

Esempio di esperimento che ho eseguito nel bacino idrico di Omov (Boemia meridionale, in C), che è un sito naturale con un predatore in situ in situ inferiore e abbondanza di prede. I dati rappresentativi sono riportati per la specie onnivora di ciliato Halteria grandinella, che è un pascolo abbondante ed efficiente di picoplancton (&lt;2 zm) particelle10,16,17,18 <su...

Presentato qui è un protocollo per una tecnica a singola cellula, basata sulla microscopia a epifluorescenza per quantificare i tassi di pascolo negli eucarioti predatori acquatici con alta precisione e risoluzione tassonomica.

Fluorescently etichettato batteri come un tracciante per rivelare nuovi percorsi di flusso organico di carbonio negli ecosistemi acquatici

Elucidating trophic interactions, such as predation and its effects, is a frequent task for many researchers in ecology. The study of microbial ...

Questo approccio è significativo perché ci permette di visualizzare e stimare i flussi di carbonio ed energia dai procarioti a livelli trotrofi più elevati nelle reti alimentari microbiche ad altissima risoluzione. Questa è l'unica tecnica attualmente disponibile per determinare quali specie protist consumano batteri in situ e allo stesso tempo quantificare il tasso di questo processo a livello di una singola cellula. Poiché i batteri sono gli unici microbi significativi che cambiano il carbonio organico disciolto in carbonio organico particolato, la conoscenza degli attori coinvolti e dei tassi a cui ciò accade costituisce la base per comprendere gli ecosistemi acquatici in generale. Consigliamo vivamente ai ricercatori di familiarizzare con il loro sistema di studio prima di condurre qualsiasi esperimento di pascolo. Ciò comporta la luce e l'epifluorescenza dell'ispezione microscopia dei campioni, e la conoscenza del principale taxon presente e delle loro dinamiche stagionali. A dimostrare la procedura sarà Jitka Jezberov

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Batterioplancton ambientali vengono incubate con un modello di carbonio organico disciolto (DOC) e un reattivo composto di etichettatura del DNA, bromodeossiuridina (BrdU). In seguito, DOC-degradante celle sono separate dalla comunità di massa in base alla loro elevata incorporazione di BrdU usando fluorescenza separazione delle cellule attivate (FACS). Queste cellule vengono poi identificati da successive analisi molecolari.

Bromodeossiuridina (BrdU) Etichettatura e successive ordinamento fluorescenza cellulare attivo per la cultura indipendente Identificazione di carbonio organico disciolto-degradanti batterioplancton

Fonte: Pioli, R., et al., Patterning di microrganismi e microparticelle attraverso l'assemblaggio sequenziale assistito da capillarità. J. Vis. Exp. (2021)Questo video mostra il metodo di cattura di singole cellule di Escherichia coli (E. coli) marcate in fluorescenza in trappole microfluidiche utilizzando una sospensione priva di carbonio e un flusso controllato, seguito dall'aggiunta di nutrienti per innescare la crescita e l'imaging a fluorescenza delle microcolonie.

Patterning microfluidico e tracciamento basato sulla fluorescenza della crescita batterica di singole cellule

Fonte: Chetrit, D., et al. Applicazione di imaging a cellule vive e tomografia crioelettronica per risolvere le caratteristiche spaziotemporali del sistema di secrezione dot/ icm di Legionella pneumophila . J. Vis. Esp. (2020).Questo video mostra la preparazione e l'imaging di batteri patogeni marcati con fluorescenza. I cuscinetti di agarosio vengono prima preparati e posizionati all'interno di una cornice adesiva. Una sospensione di batteri geneticamente modificati che esprimono una proteina...

Preparazione del campione e imaging di batteri marcati con fluorescenza

Viene descritto un metodo basato su proteine fluorescenti su cellule vive per illuminare i vacuoli cellulari (inclusioni) contenenti clamidia. Questa strategia consente una determinazione rapida e automatizzata dell'infettività della clamidia nei campioni e può essere utilizzata per studiare quantitativamente le dinamiche di crescita delle inclusioni.

Utilizzo di proteine ​​fluorescenti per visualizzare e Quantificazione<em&gt; Chlamydia</em&gt; Vacuolo crescita dinamica in cellule viventi

Gli studi sulle biomolecole in vivo sono fondamentali per comprendere la funzione molecolare in un contesto biologico. Qui descriviamo un nuovo metodo che consente l'internalizzazione di biomolecole fluorescenti, come il DNA o le proteine, in microrganismi viventi. Viene inoltre presentata e discussa l'analisi dei dati in vivo registrati mediante microscopia a fluorescenza.

Internalizzazione e di osservazione di Fluorescent Biomolecole in Living microrganismi via elettroporazione

Un intero test marcatura già cella con Burkholderia sartisoli RP037-Mche è stato sviluppato per rilevare frazioni di un contaminante organico (cioè, fluorene) disponibile per la degradazione batterica dopo trasporto attivo da miceli ponte pori pieni d'aria in un sistema modello insaturo acqua.

A Whole marcatura già cellulare approccio per valutare i trasporti e la biodisponibilità di contaminanti organici in acqua insaturi Sistemi

Il ruolo di assortimento (segregazione spaziale) in scenari evolutivi può essere esaminato utilizzando semplici sistemi microbici in laboratorio che permettono la regolazione della distribuzione spaziale controllato. Modificando la densità cellulare fondatore, vari livelli di assortimento possono essere visualizzati utilizzando ceppi batterici fluorescente nei biofilm colonie di Bacillus subtilis.

Il monitoraggio spaziale segregazione in superficie Colonizzare microbiche Popolazioni

Capire la funzione dei processi essenziali nei batteri è complesso. Microscopia a fluorescenza con target-specifici coloranti possa fornire spunti preziosi per progressione di crescita e ciclo cellulare delle cellule microbiche. Qui, Agrobacterium tumefaciens è usato come un batterio modello per evidenziare i metodi per l'imaging di cellule vive per la caratterizzazione dei processi essenziali.

Vivere la microscopia di fluorescenza delle cellule per osservare i processi essenziali durante la crescita delle cellule microbiche

Questo manoscritto descrive un metodo per l'etichettatura individuale RNA messaggero (mRNA) trascrizioni con sonde di DNA fluorescente etichettati, per l'uso in singola molecola fluorescenza in situ (smFISH) gli esperimenti di ibridazione in Escherichia coli. smFISH è un metodo di visualizzazione che permette la rilevazione simultanea, la localizzazione e quantificazione delle singole molecole di mRNA in singole celle fisse.

Metodo per l'etichettatura di trascrizioni in cellule individuali Escherichia coli per singola molecola di fluorescenza In Situ gli esperimenti di ibridazione

Questo protocollo di imaging cellulare vivo-batterico consente di vedere le interazioni tra più specie batteriche a livello di singola cellula nel tempo. L'imaging time-lapse consente l'osservazione di ogni specie batterica in monocultura o cocoltura per interrogare le interazioni interspecie in comunità batteriche multispecie, tra cui la motilità e la vitalità delle singole cellule.

Visualizzazione cinetica delle interazioni batteriche interspecie a uni cell

In questo articolo, descriviamo una procedura che consente il rilevamento a livello di organo di batteri patogeni durante l'infezione e la quantificazione delle attività del reporter fluorescente.

Tomografia tridimensionale tridimensionale ad alta risoluzione di infezioni microbiche

Scopri un metodo per quantificare i tassi di pascolo nei procarioti acquatici usando prede fluorescenti come traccianti. Questa tecnica consente di visualizzare il flusso di carbonio negli ecosistemi acquatici.

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Fluorescently etichettato batteri come un tracciante per rivelare nuovi percorsi di flusso organico di carbonio negli ecosistemi acquatici

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