Name: Microscopia a fluorescenza a cellule vive per studiare la localizzazione delle proteine subcellulari e i cambiamenti della morfologia cellulare nei batteri (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 57 s
Description: Impara la microscopia a fluorescenza a cellule vive per studiare la localizzazione proteica subcellulare e i cambiamenti morfologici in Bacillus subtilis e Staphylococcus aureus. Questo metodo consente l'osservazione diretta dei processi cellulari.

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Ringraziamo i nostri membri del laboratorio per i loro commenti su questo articolo. Questo lavoro è stato finanziato da una start-up della University of South Florida (PE).

1. Condizioni generali di crescita
<ol><li>Inoculare 2 mL di mezzo di crescita appropriato integrato con antibiotici (dove richiesto) con una singola colonia del ceppo (s) da immaginare. Incubare queste colture di semi durante la notte a 22 gradi centigradi in un incubatore agitazione. NOTA: Le condizioni specifiche di crescita batterica utilizzate in questo articolo sono fornite nella sezione dei risultati rappresentativi.</li>
	<li>Diluire le colture durante la notte 1:20 in supporti freschi in un flacone da 125 mL, integrare con antibiotici (dove richiesto).</li>
	<li>Coltivare colture a 37 gradi centigradi in un'incubatrice tremante fino alla fase media del logaritmico (OD600 - 0,5). NOTA: L'induttore o l'inibitore potrebbe essere aggiunto direttamente alle colture in crescita nella fase di crescita appropriata.</li>
	<li>Raccogliere le cellule nelle condizioni di coltura desiderate per la preparazione del campione di microscopia, come descritto nella sezione seguente.</li>
</ol>2. Preparazione del campione
<ol><li>Preparare l'1% di agarose combinando 0,25 g di grado di biologia molecolare, basso EEO, agarose con 25 mL di mezzo di crescita integrato con antibiotici appropriati (se necessario) per la microscopia timelapse o acqua sterile. Riscaldare il composto con l'aiuto di un forno a microonde per circa 30 s e versarlo in una sterile parabola Petri da 100 mm x 15 mm e lasciarla solidificare.</li>
	<li>Prendete un 5-50 ll della coltura cellulare a seconda della necessità e macchiare le cellule. Cellule di colorazione appropriate in questa fase (ad esempio, aggiungere colorante fluorescente FM4-64 (macchia di membrana) per un esperimento (Figura 1)).<ol>
<li>Pipetta un 5 - L di campione di coltura o campione colorato da immagini sul fondo di un piatto di coltura del fondo di vetro 35 mm (con diametro del micropo di 14 mm e coverslip n. 1.5 non rivestito; vedere la Tabella dei materiali). AVVISO: Non utilizzare copricapi rivestiti poli-L-lisina soprattutto per la microscopia timelapse in quanto potrebbero indurre diversi modelli di crescita (abbiamo osservato questo anche con poli-D-lysina; dati non mostrati) e/o influenzare la dinamica delle proteine6.</li>
		<li>Per ridurre al minimo l'uso di coloranti, colorare le tinture da 3 a 4 once (raccolte aOD 600 - 0,5; circa 2,7 x 107 e 3,4 x 107 per B. subtilis e S. aureus rispettivamente per 1 mL di coltura) direttamente sul piatto inferiore in vetro.</li>
		<li>Posizionare una lastra di agarose pre-tagliata (11 mm di diametro o di qualsiasi dimensione desiderata per sovrapporre l'area del coperchio; tagliare utilizzando l'estremità aperta di un tubo sterile o di una lama di rasoio) sulla parte superiore del campione e toccare delicatamente per assicurarsi che la lastra di agarosa sia appoggiata contro il coperchio.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dopo l'imaging (vedi sezione seguente), se il numero di cellule nel campo visivo non è auspicabile, regolare la densità cellulare del campione tramite diluizione o concentrazione mediante centrifugazione e modificare il rapporto delle cellule nel campione utilizzando il mezzo di crescita / buffer, se necessario. NOTA: per ridurre al minimo l'autofluorescenza proveniente dal mezzo di coltura, le cellule possono essere lavate nel buffer (ad esempio nella salina buffer di fosfato 1x standard) e risospese nella quantità appropriata di buffer prima dell'imaging. È possibile che in questa fase le cellule più piccole o vesciche non possono essere mantenute dopo la centrifugazione e quindi saranno perse.</li>
	<li>Aggiungete l'acqua usando una pipetta (5 gocce di lgg.l) nello spazio all'interno del piatto di coltura (intorno al coperchio) per evitare che il pad agarose si secchi e per aiutare a mantenere l'umidità durante l'acquisizione dell'immagine, in particolare per gli esperimenti timelapse.</li>
	<li>Lasciare che i piatti della coltura eclichino alla temperatura all'interno della camera di incubazione, un vano opaco incorporato fornito dal produttore, del microscopio per 15-20 min. NOTA: Accendere l'elemento riscaldante e impostare la camera di incubazione alla temperatura desiderata diverse ore prima dell'imaging. Ciò garantirà che l'hardware si stabilizzi alla nuova temperatura. Per l'imaging timelapse prolungato, posizionare un becher o un pallone con acqua all'interno della camera del microscopio, lontano dall'area di lavoro, per mantenere l'umidità.</li>
</ol>3. Imaging
<ol><li>Il giorno dell'esperimento, accendere il sistema di microscopio. Avviare il software di imaging (vedere Tabella dei materiali) facendo clic sull'icona appropriata sul desktop. Inizializzare il microscopio facendo clic sull'opzione Inizializza microscopio (pulsante raffigurato con un microscopio) nella finestra di dialogo di avvio del software. Assicurarsi che l'obiettivo sia completamente abbassato utilizzando la regolazione grossolana del microscopio prima dell'inizializzazione. NOTA: dopo l'inizializzazione dovrebbero essere visualizzate tre finestre di dialogo aggiuntive oltre al menu di avvio: resolve3D, raccolta dati e monitoraggio dei filtri.</li>
	<li>Posizionare una goccia di 1,517 (indice di rifrazione) sull'obiettivo di immersione dell'olio 100x fornito dal produttore (Apertura numerica : 1,4, Distanza di lavoro : 0,12 mm; vedere Tabella dei materiali). NOTA: È importante scegliere l'olio di immersione appropriato per la temperatura alla quale viene condotta l'imaging.</li>
	<li>Caricare la teglia inferiore in vetro contenente il campione nell'alloggiamento metallico (bara) e far scorrere delicatamente nel morsetto del palco.</li>
	<li>Utilizzare la manopola di regolazione grossolana per sollevare l'obiettivo fino a quando l'olio entra in contatto con il fondo di vetro del piatto. Utilizzare il pezzo dell'occhio e la manopola di regolazione fine per mettere a fuoco il campione. Una volta che le cellule sono a fuoco girare la manopola dal pezzo dell'occhio alla modalità fotocamera spostando l'interruttore selettore situato sulla parte anteriore del corpo del microscopio a sinistra.</li>
	<li>Iniziare l'esperimento utilizzando il software di imaging. Nella finestra resolve3D, selezionare l'icona Progetta/esegui esperimento raffigurata da un pallone. Verrà visualizzata una nuova finestra di dialogo denominata design/run experiment.<ol>
<li>Impostare il numero di stack di z e lo spessore del campione utilizzando la scheda di progettazione e quindi sezionamento nella finestra di dialogo dell'esperimento di progettazione/esecuzione. NOTA: per gli esperimenti nella sezione dei risultati rappresentativi, sono stati utilizzati 17 stack di z a intervalli di 200 nm per immagini fisse e quattro stack a intervalli di 200 nm per la microscopia timelapse.</li>
		<li>Per misurare lo spessore delle celle nel campione, regolare manualmente il piano z in modo incrementale utilizzando le frecce su e giù nella finestra di dialogo resolve3D. Contrassegnare il punto in cui le celle non vengono a fuoco come limite superiore e inferiore per l'acquisizione dell'immagine. Importare queste informazioni prima di eseguire l'esperimento.</li>
		<li>Per ridurre al minimo la fototossicità e il fotobleaching durante l'imaging timelapse, ridurre il numero di stack di z e scegliere il piano intermedio delle celle per l'acquisizione dell'immagine.</li>
	</ol></li>
	<li>Selezionare il set di filtri appropriato per l'esperimento utilizzando la scheda Progettazione, quindi canali nella finestra di dialogo Progetta/Esegui esperimento (TRITC: EX 542/27; EM 597/45; FITC/GFP: EX 475/28; EM 525/48; mCherry: EX 575/25; EM 632/60; Cy5: EX 632/22; EM 676/34).<ol>
<li>Inoltre, selezionare un riferimento per la raccolta di informazioni POL/DIC. Regolare la trasmissione percentuale (intensità luminosa) e la durata dell'esposizione per i singoli canali selezionati prima dell'imaging selezionando le opzioni appropriate nella finestra di dialogo resolve3D. NOTA: in un campo visivo di prova che non viene considerato per l'esperimento testa queste impostazioni per identificare se i parametri selezionati ottengono dati di fluorescenza significativi senza perdere il segnale debole o sovrasaturarlo. Quindi importare questi parametri per l'impostazione sperimentale.</li>
	</ol></li>
	<li>Aprire l'elenco dei punti selezionando il pulsante Elenco punti nella finestra di dialogo resolve3D. Verrà visualizzata una nuova finestra di dialogo denominata elenco di punti. Contrassegnare diversi campi visivi da utilizzare nell'esperimento trovando campi di visualizzazione appropriati utilizzando i controlli della fase del microscopio e selezionando l'opzione del punto di contrassegno nella finestra di dialogo elenco punti. NOTA: Un punto di sostituzione dovrà essere selezionato ogni volta che il microscopio viene rifocalizzato su un punto nell'elenco dei punti. Questo può essere fatto concentrando il microscopio sul punto appropriato nell'elenco e quindi selezionando il pulsante del punto di sostituzione. È importante non toccare la manopola di regolazione analogica grossolana/fine durante la messa a fuoco; utilizzare solo il software per regolare la messa a fuoco.</li>
	<li>Impostare i parametri timelapse selezionando prima il progetto e quindi la scheda timelapse nella finestra di dialogo di progettazione/esecuzione dell'esperimento. Selezionare la casella di controllo timelapse. Immettere i parametri timelapse appropriati in termini di immagini timelapse/tempo totale.</li>
	<li>Impostare i punti da visualizzare dall'elenco dei punti selezionando prima il progetto e quindi la scheda Punti nella finestra di dialogo dell'esperimento di progettazione/esecuzione. Selezionare l'opzione dell'elenco dei punti di visita e immettere i punti da visualizzare nella casella di testo separati da virgole o trattini se si tratta di una sequenza completa.</li>
	<li>Prima di iniziare un esperimento, modificare i nomi e i percorsi dei file utilizzando la scheda Esegui nella finestra di dialogo Progettazione/esecuzione. La posizione del file può essere modificata selezionando il pulsante delle impostazioni, selezionando la cartella dati e quindi selezionando la cartella appropriata o creandone una nuova. Modificare i nomi dei file immettendo il nuovo nome del file nella casella di testo Nome file immagine.</li>
	<li>Inizia l'esperimento selezionando il pulsante di riproduzione nella finestra di dialogo Inizia esperimento. NOTA: per il timelapse, controllare continuamente lo stato attivo in ogni campo visivo durante l'esperimento utilizzando l'impostazione DIC (per evitare fotosblandi) e rifocalizzare e aggiornare le informazioni nell'elenco dei punti in quanto le celle tendono a perdere lo stato attivo nel tempo.</li>
</ol>4. Elaborazione delle immagini
<ol><li>Aprire i file di immagine raw (R3D) desiderati per la generazione di figure. NOTA: i file salvati di recente possono essere individuati utilizzando il pulsante della cartella dati nella finestra di dialogo di avvio del software di imaging.</li>
	<li>Eseguire il programma di deconvoluzione per rimuovere la luce di fluorescenza fuori fuoco7,8, al fine di produrre un file di immagine D3D deconvolved. Selezionare la scheda Processo nella finestra di dialogo di avvio, quindi selezionare deconvolve. Verrà visualizzata una nuova finestra di dialogo denominata deconvolve.<ol>
<li>Impostare i parametri di deconvoluzione trascinando il numero di immagine appropriato (situato nell'angolo superiore sinistro di ogni file di immagine) all'input nella finestra di dialogo di deconvoluzione. Nella finestra di dialogo di deconvoluzione, selezionare il pulsante Altre opzioni e deselezionare la casella di controllo di rolloff del bordo del ritaglio dopo l'elaborazione (altrimenti le immagini non possono essere sovrapposte al file DIC corrispondente). </li>
		<li>Fare clic sul pulsante Fai clic nella finestra di dialogo di deconvoluzione per deconvolve file di immagine raw. NOTA: i parametri di deconvoluzione potrebbero essere regolati come indicato dal manuale di orientamento del produttore del software per i risultati desiderati.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Se necessario, eseguite la sottrazione manuale del disturbo di fondo e la regolazione luminosità/contrasto in uno o tutti i canali di lunghezza d'onda (colore). A tale scopo, selezionare il pulsante di regolazione del contrasto nel file di immagine deconvolved.</li>
	<li>Salvare l'immagine come file TIFF selezionando prima l'opzione del file nella parte superiore della finestra di dialogo D3D. Quindi selezionare Salva come TIFF, identificare e selezionare gli stack di z appropriati (che sono allo stato attivo), selezionare o deselezionare i set di filtri desiderati.</li>
	<li>Eseguire la quantificazione dei dati utilizzando qualsiasi software fornito dal produttore o programmi liberamente disponibili come ImageJ5.<ol>
<li>Per la quantificazione delle dimensioni delle celle, fare clic sulla scheda degli strumenti nel file di immagine D3D appropriato, quindi selezionare l'opzione delle distanze di misurazione. Misurare le distanze selezionando i punti iniziale e finale sul file di immagine desiderato utilizzando il mouse con i clic con i pulsanti sinistro del mouse. NOTA: È consigliabile ingrandire l'immagine durante la quantificazione delle dimensioni delle celle.</li>
		<li>Per la quantificazione del segnale di fluorescenza utilizzare l'opzione Data Inspector nella scheda utensile del file di immagine D3D appropriato. NOTA: È meglio ingrandire l'immagine e selezionare solo i filtri pertinenti al completamento della quantificazione del segnale di fluorescenza.</li>
		<li>Per quantificare il segnale di fluorescenza, disegnare una casella con l'opzione colonna/riga impostata su una dimensione specifica. Selezionare un'area con segnale da quantificare e registrare il valore. Misurare il segnale di sfondo utilizzando la stessa casella di dimensioni per selezionare un'area immediatamente al di fuori delle celle. Sottrarre il valore di sfondo dal valore registrato dal segnale di fluorescenza ottenuto all'interno della cella.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Coltharp, C., Xiao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superresolution+microscopy+for+microbiology%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Superresolution microscopy for microbiology.</a> Cellular Microbiology. 14 (12), 1808-1818 (2012).</li>
<li>Holden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+mechanistic+principles+of+bacterial+cell+division+with+super-resolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Probing the mechanistic principles of bacterial cell division with super-resolution microscopy.</a> Current Opinion in Microbiology. 43, 84-91 (2018).</li>
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<li>Haeusser, D. P., Margolin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Splitsville%3A+structural+and+functional+insights+into+the+dynamic+bacterial+Z+ring%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Splitsville: structural and functional insights into the dynamic bacterial Z ring.</a> Nature Reviews Microbiology. 14 (5), 305-319 (2016).</li>
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<li>Ni, Q., Mehta, S., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+imaging+of+cell+signaling+using+genetically+encoded+fluorescent+reporters%5BTitle%5D)+AND+%22Federation+of+European+Biochemical+Societies+Journal%22%5BJournal%5D)">Live-cell imaging of cell signaling using genetically encoded fluorescent reporters.</a> Federation of European Biochemical Societies Journal. 285 (2), 203-219 (2018).</li>
<li>Weiss, C. A., Hoberg, J. A., Liu, K., Tu, B. P., Winkler, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Cell+Microscopy+Reveals+That+Levels+of+Cyclic+di-GMP+Vary+among+Bacillus+subtilis+Subpopulations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Single-Cell Microscopy Reveals That Levels of Cyclic di-GMP Vary among Bacillus subtilis Subpopulations.</a> Journal of Bacteriology. 201 (16), (2019).</li>
<li>Schneider, J. P., Basler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shedding+light+on+biology+of+bacterial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+of+London.+Series+B%2C+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Shedding light on biology of bacterial cells.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 371 (1707), (2016).</li>
<li>Yao, Z., Carballido-Lopez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+imaging+for+bacterial+cell+biology%3A+from+localization+to+dynamics%2C+from+ensembles+to+single+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+microbiology%22%5BJournal%5D)">Fluorescence imaging for bacterial cell biology: from localization to dynamics, from ensembles to single molecules.</a> Annual review of microbiology. 68, 459-476 (2014).</li>
<li>Ettinger, A., Wittmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+live+cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Fluorescence live cell imaging.</a> Methods in Cell Biology. 123, 77-94 (2014).</li>
<li>Fredborg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+image+analysis+for+quantification+of+filamentous+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Central+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Automated image analysis for quantification of filamentous bacteria.</a> BioMed Central Microbiology. 15, 255(2015).</li>
<li>Ursell, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((precise+quantification+of+bacterial+cellular+dimensions+across+a+genomic-scale+knockout+library%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Central+Biology%22%5BJournal%5D)">precise quantification of bacterial cellular dimensions across a genomic-scale knockout library.</a> BioMed Central Biology. 15 (1), 17(2017).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

La microscopia è rimasta un pilastro negli studi relativi agli organismi microbici. Data la loro dimensione cellulare su scala micron, gli studi a livello di cellula singola si sono tradizionalmente basati sulla microscopia elettronica (EM). Sebbene EM sia diventata una tecnica piuttosto potente negli ultimi anni, ha i suoi limiti intrinseci oltre al limitato accesso degli utenti16. I miglioramenti nelle tecniche di microscopia a fluorescenza e lo sviluppo di diverse sonde fluorescenti, come FDAA<...

Il campo della biologia cellulare batterica è stato notevolmente migliorato dai recenti progressi nelle tecniche di microscopia1,2. Tra gli altri strumenti, i microscopi in grado di condurre esperimenti di microscopia a fluorescenza timelapse rimangono uno strumento prezioso. I ricercatori possono monitorare vari eventi fisiologici in tempo reale utilizzando proteine fluorescenti come le proteine fluorescenti verdi (GFP) e le fusioni di reporter traslazionali, gli amminoacidi D-aminoacidi fluorescenti (FDAA)3o utilizzare altre macchie per etichettare la parete cellulare, la membrana e il DNA. Non sorprende quindi che la microscopia a fluorescenza rimanga popolare tra i biologi delle cellule microbiche. Oltre a mostrare semplicemente i fenotipi finali, fornire informazioni su come i fenotipi osservati nascono utilizzando la microscopia timelapse potrebbe aggiungere un valore significativo ai risultati e potenzialmente offrire indizi su quali processi cellulari sono presi di mira da potenziali candidati alla droga4.
I protocolli per condurre l'imaging ad alta risoluzione utilizzando un microscopio a fluorescenza a campo largo completamente motorizzato, invertito e a campo largo (vedi tabella dei materiali)sono forniti in questo articolo. Questi protocolli potrebbero essere adattati alle esigenze di altri microscopi a fluorescenza in grado di condurre la microscopia timelapse. Anche se il software qui discusso corrisponde allo specifico software fornito dal produttore come indicato nella Tabella dei Materiali, il software comunemente fornito da altri produttori di microscopi o il ModelloImmagineJ 5liberamente disponibile, dispone di strumenti equivalenti per l'analisi dei dati di microscopia. Per le condizioni in cui il timelapse non è favorevole, gli esperimenti di ciclo temporale potrebbero essere condotti come descritto in questo articolo. I protocolli qui descritti forniscono una guida dettagliata per studiare i cambiamenti fenotipici in due diverse specie batteriche: B. subtilis e S. aureus. Vedere la Tabella 1 per i ceppi utilizzati.

<table><tbody><tr><td>Agarosio</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP160-100</td><td>Grado di biologia molecolare - Basso EEO</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D3571</td><td>Microscopia</td></tr><tr><td>FM4-64</td><td>Invitrogen</td><td>T3166</td><td></td></tr><tr><td>Microscopia Piatto inferiore in vetro</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Microscopia IPTG</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP1755-10</td><td>Senza</td></tr> <tr>diossano<td>Microscopio</td><td>GE</td><td>DeltaVision Elite</td><td>Personalizzato Olympus IX-71 Supporto per Microscopio Invertito; Torre di illuminazione personalizzata e modulo illuminatore a luce trasmessa. Obiettivi: PLAPON 60X (N.A. 1.42, WD 0.15 mm); OLY 100X OLIO (N.A. 1.4, WD 0.12 mm); Prisma DIC Nomarski per obiettivo 100X; Fotocamera CoolSnap HQ2; Assemblaggio SSI a 7 colori; Camera di controllo ambientale - opaca.</td></tr><tr><td>PC190723</td><td>MilliporeSigma</td><td>3445805MG</td><td>FtsZ inibitore</td></tr><tr><td>SoftWorx</td><td>GE</td><td></td><td>Software di imaging fornito dal produttore</td></tr></tbody></table>

microscopia a fluorescenza a cellule vive per studiare la localizzazione delle proteine subcellulari e i cambiamenti della morfologia cellulare nei batteri

Live-Cell Fluorescence Microscopy to Investigate Subcellular Protein Localization and Cell Morphology Changes in Bacteria

Le indagini sui fattori che influenzano la divisione cellulare e la forma cellulare nei batteri sono comunemente eseguite in combinazione con la microscopia a fluorescenza ad alta risoluzione, poiché le osservazioni fatte a livello di popolazione potrebbero non riflettere realmente ciò che si verifica a livello di singola cellula. La microscopia a tempo variabile a cellule vive consente agli sperimentatori di monitorare i cambiamenti nella divisione cellulare o nella morfologia cellulare che forniscono preziose informazioni sulla localizzazione subcellulare delle proteine e sulla tempistica dell'espressione genica, come accade, per aiutare potenzialmente a rispondere a importanti domande biologiche. Qui, descriviamo il nostro protocollo per monitorare i cambiamenti fenotipici in Bacillus subtilis e Staphylococcus aureus utilizzando un microscopio di deconvoluzione ad alta risoluzione. L'obiettivo di questa relazione è quello di fornire un protocollo semplice e chiaro che può essere adottato da altri ricercatori interessati a condurre esperimenti di microscopia a fluorescenza per studiare diversi processi biologici nei batteri e in altri organismi.

Fenotipi GpsB In precedenza abbiamo dimostrato che Sa-GpsB è una proteina essenziale come esaurimento di GpsB utilizzando un RNA antisenso risultati in lisi cellulare9. Qui descriviamo come l'emergere di vari fenotipi della divisione cellulare e i cambiamenti nella localizzazione delle proteine potrebbero essere catturati utilizzando il protocollo di microscopia timelapse descritto in questo articolo. A questo scopo, S. aureus sforza RB143 [SH1000 che ospita pEPSA5 (ve...

Questo articolo fornisce una guida passo-passo per studiare le dinamiche di localizzazione subcellulare delle proteine e per monitorare i cambiamenti morfologici utilizzando la microscopia a fluorescenza ad alta risoluzione in Bacillus subtilis e Staphylococcus aureus.

Microscopia a fluorescenza a cellule vive per studiare la localizzazione delle proteine subcellulari e i cambiamenti della morfologia cellulare nei batteri

Investigations of factors influencing cell division and cell shape in bacteria are commonly performed in conjunction with high-resolution fluorescence ...

Questo protocollo facilita l'osservazione diretta di vari cambiamenti fenotipiche a livello di singola cellula e consente il monitoraggio continuo della localizzazione proteica e dei tempi di espressione genica. Il principale vantaggio della microscopia a fluorescenza è che è un metodo semplice per monitorare vari processi biologici, come la divisione cellulare e i cambiamenti della morfologia cellulare nelle cellule vive. Assicurati di prestare particolare attenzione al protocollo di preparazione del campione e di esplorare il software del microscopio per essere in grado di individuare le impostazioni e le opzioni elencate in questo protocollo.Una rappresentazione visiva di questo protocollo è fondamentale perché consente agli utenti di guardare e apprendere i passaggi significativi della tecnica mentre impostano i propri esperimenti. Inizia etichettando un'aliquota da cinque a 50 microlitri della coltura cellulare di interesse con un colorante di colorazione a membrana appropriato e aggiungendo cinque microlitri delle cellule batteriche macchiate su un foglietto di copertura sul fondo di un piatto di coltura inferiore in vetro da 35 millilitri. Posizionare una lastra di agarosio di 11 millimetri di diametro sul campione e toccare delicatamente per assicurarsi che la lastra sia piatta contro lo scivolamento del coperchio.Quindi aggiungere circa cinque microlitri d'acqua intorno allo scivolo di copertura per evitare che il tampone di agarosio si asciughi e lasciare che il piatto di coltura equilibra alla temperatura all'interno della camera di incubazione di un microscopio a deconvoluzione ad alta risoluzione per 15-20 minuti. Per immaginere il campione, utilizzare la manopola di messa a fuoco di regolazione grossolana per assicurarsi che l'obiettivo sia completamente abbassato prima di inizializzare il microscopio all'interno del software del microscopio. Inserire una goccia di 1.517 olio indice di rifrazione nell'obiettivo di immersione dell'olio 100x e trasferire il piatto inferiore di vetro contenente il campione nella bara dell'alloggiamento in metallo.Far scorrere delicatamente il piatto nel morsetto del palco e utilizzare la manopola di regolazione grossolana per alzare l'obiettivo fino a quando l'olio non entra in contatto con il fondo di vetro del piatto. Utilizzare l'oculare e la manopola di regolazione fine per mettere a fuoco il campione e passare alla modalità Fotocamera. Nel software di imaging della finestra Risolvi 3D selezionare l'icona Progettazione/Esecuzione esperimento.Verrà visualizzata una nuova finestra di dialogo intitolata Esperimento progettazione/esecuzione. Aprite le schede Progettazione (Design) e Se sezione (Sectioning) nella finestra di dialogo per impostare il numero di pile Z e lo spessore del campione. Per misurare lo spessore delle celle del campione, regolate in modo incrementale il piano Z utilizzando le frecce su e giù nella finestra di dialogo Risolvi 3D, rendendo il punto in cui le celle escono dallo stato attivo come limiti superiore e inferiore per l'acquisizione di immagini.Dopo aver regolato la trasmissione percentuale dell'intensità della luce e la durata dell'esposizione per i singoli canali selezionati nella finestra di dialogo Risolvi 3D, fate clic su Elenco punti (Point List) per aprire l'elenco dei punti. Nelle schede Progettazione e Time Lapse selezionare la casella di controllo Time Lapse e immettere i parametri time lapse. Selezionare l'opzione Dell'elenco Punto di visita e immettere i punti da inserire nella casella di testo, separando i punti da virgole o trattini per sequenze complete.Quindi modificare i nomi dei file e i percorsi dei file nella scheda Esegui e selezionare Riproduci nella finestra di dialogo Inizia esperimento per avviare l'esperimento. Al termine dell'analisi, aprite i file di immagine RAW di interesse in un programma di deconvoluzione appropriato e selezionate la scheda Processo (Process) e Deconvolve (Deconvolve). Eseguire qualsiasi sottrazione manuale di rumore di fondo e regolazione del contrasto della luminosità in uno o tutti i canali di lunghezza d'onda, se necessario, prima di salvare l'immagine come file TIFF.Per la quantificazione della lunghezza delle celle, aprire i file di immagine deconvoluti nel software fornito dal produttore o nel software di imaging libero, ad esempio ImageJ, e aprire la scheda Strumento. Quindi selezionate Misura distanze (Measure Distances) e fate clic con il pulsante sinistro del mouse sui punti iniziale e finale del file di immagine desiderato per misurare la lunghezza della cella. Per la quantificazione del segnale fluorescente, selezionare Ispezione dati.Disegnare una casella con l'opzione Colonna/Riga impostata sulla dimensione specifica di interesse e selezionare l'area con il segnale da quantificare. L'aggiunta di xilosio per indurre un ceppo GGS 8 si traduce in un fenotipo a sei cellule. Mentre i controlli vettoriali vuoti appaiono simili alle celle di controllo coltivate in assenza di induttore.La sovrapproduzione di staph aureus gpsB interrompe la divisione cellulare in B.subtilis misurata dalla microscopia time lapse e dalla quantificazione della lunghezza cellulare. Inoltre, i modelli di localizzazione di FtsZ o di una delle proteine associate a questa proteina possono essere usati da un reporter per studiare e /o identificare nuovi composti antimicrobici attraverso l'imaging time lapse e la quantificazione della lunghezza cellulare. Assicurarsi di utilizzare un olio con l'indice di rifrazione appropriato in quanto l'indice di rifrazione può cambiare a seconda della temperatura utilizzata per l'imaging.La deconvoluzione può essere eseguita se l'utente desidera rimuovere il rumore fuori fuoco e può anche essere eseguita l'analisi dei dati che coinvolge la quantificazione del segnale fluorescente e le misurazioni della lunghezza e della larghezza delle celle.

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Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Qui mostriamo i protocolli per l'esecuzione di singola molecola microscopia a fluorescenza a vivere cellule batteriche per permettere funzionali complessi molecolari per essere rilevati, monitorati e quantificati.

Visualizzazione singola complessi molecolari In Vivo Utilizzo avanzato microscopia a fluorescenza

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Biofilm microbici sono generalmente costituiti da distinti sottopopolazioni di cellule specializzate. Cella singola analisi di queste sottopopolazioni richiede l'uso di reporter fluorescenti. Qui descriviamo un protocollo di visualizzare e monitorare diversi...

Singola cella Analisi Bacillus subtilis I biofilm usando la microscopia a fluorescenza e citometria a flusso

Fonte: Brzozowski, R. S. et al. Microscopia a fluorescenza a cellule vive per indagare la localizzazione delle proteine subcellulari e i cambiamenti morfologici cellulari nei batteri. J. Vis. Esp. (2019)Questo video dimostra la microscopia a fluorescenza a cellule vive per visualizzare cambiamenti morfologici in tempo reale nei batteri. Descrive i passaggi coinvolti nell'imaging, nell'acquisizione del time-lapse e nella deconvoluzione per ottenere immagini ad alta risoluzione in tempo reale.

Imaging dei cambiamenti morfologici nei batteri utilizzando la microscopia a fluorescenza a cellule vive

Il video descrive la tecnica di imaging FLIM-FRET per determinare l'interazione proteina-proteina nei batteri vivi che esprimono proteine citoplasmatiche marcate con proteine fluorescenti, un eGFP donatore e l'accettore mCherry. La tecnica combinata consente anche la quantificazione delle proteine interagenti.

Imaging FLIM-FRET per la caratterizzazione delle interazioni proteina-proteina nei batteri vivi

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Utilizzo di proteine ​​fluorescenti per visualizzare e Quantificazione<em&gt; Chlamydia</em&gt; Vacuolo crescita dinamica in cellule viventi

Gli studi sulle biomolecole in vivo sono fondamentali per comprendere la funzione molecolare in un contesto biologico. Qui descriviamo un nuovo metodo che consente l'internalizzazione di biomolecole fluorescenti, come il DNA o le proteine, in microrganismi viventi. Viene inoltre presentata e discussa l'analisi dei dati in vivo registrati mediante microscopia a fluorescenza.

Internalizzazione e di osservazione di Fluorescent Biomolecole in Living microrganismi via elettroporazione

Capire la funzione dei processi essenziali nei batteri è complesso. Microscopia a fluorescenza con target-specifici coloranti possa fornire spunti preziosi per progressione di crescita e ciclo cellulare delle cellule microbiche. Qui, Agrobacterium tumefaciens è usato come un batterio modello per evidenziare i metodi per l'imaging di cellule vive per la caratterizzazione dei processi essenziali.

Vivere la microscopia di fluorescenza delle cellule per osservare i processi essenziali durante la crescita delle cellule microbiche

Le cellule batteriche sono spazialmente altamente organizzate. Per seguire questa organizzazione nel corso del tempo in lenta crescita xanthus di Myxococcus cellule, è stato sviluppato un set-up per l'imaging di cellule vive di fluorescenza ad alta risoluzione spazio-temporale sopra parecchie generazioni. Utilizzando questo metodo, potrebbe essere determinato spatiotemporal dinamica di proteine importanti per la segregazione del cromosoma e la divisione cellulare.

Imaging di fluorescenza Live-cella del completo ciclo cellulare vegetativo della lenta crescita sociale batterio xanthus di Myxococcus

Questo protocollo di imaging cellulare vivo-batterico consente di vedere le interazioni tra più specie batteriche a livello di singola cellula nel tempo. L'imaging time-lapse consente l'osservazione di ogni specie batterica in monocultura o cocoltura per interrogare le interazioni interspecie in comunità batteriche multispecie, tra cui la motilità e la vitalità delle singole cellule.

Visualizzazione cinetica delle interazioni batteriche interspecie a uni cell

Impara la microscopia a fluorescenza a cellule vive per studiare la localizzazione proteica subcellulare e i cambiamenti morfologici in Bacillus subtilis e Staphylococcus aureus. Questo metodo consente l'osservazione diretta dei processi cellulari.

Microscopia a fluorescenza a cellule vive per studiare la localizzazione delle proteine subcellulari e i cambiamenti della morfologia cellulare nei batteri (Video) | JoVE Journal

Microscopia a fluorescenza a cellule vive per studiare la localizzazione delle proteine subcellulari e i cambiamenti della morfologia cellulare nei batteri

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