Name: In Vitro Analisi per studiare linterazione tumora-macrophage (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 36 s
Description: Scopri un saggio in vitro per valutare il reclutamento dei macrofagi da parte del medium condizionato da cellule tumorali. Questo metodo facilita lo sviluppo di terapie oncologiche personalizzate.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Grant Support: Un ha ricevuto il sostegno di Alex's Lemonade Stand Foundation, American Brain Tumor Association, NIH T32CA108462 e Program for Breakthrough Biomedical Research, che è parzialmente finanziato dalla Sandler Foundation. W. Weiss è stato supportato da sovvenzioni NIH R01CA221969, R01NS091620, P50CA097257, U01CA217864, P30CA82103; la Samuel G. Waxman Cancer Research Foundation; e la sedia Evelyn e Mattie Anderson.

1. Preparazione media
<ol><li>
Preparazione del mezzo di cellule staminali senza siero
	<ol>
<li>Scongelare il supplemento 50x B27, il fattore di crescita epidermico (EGF, 20 g/mL in acido acetico 10 mM con 0,1% BSA) e il fattore di crescita del fibroblasto (FGF, 20g/mL in 10 m di acido acetico con 0,1% BSA).</li>
		<li>Aggiungere 500 l di EGF (concentrazione finale 20 ng/mL), 500 lof di FGF (concentrazione finale 20 ng/mL), 10 mL da 50x B27 a 500 mL di Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) e 5 mL di 100x Penicillin/Streptomycin (Pen/Strepp). Invertire la bottiglia 4-6 volte per mescolare, filtrare sterilizzare attraverso una tazza di filtrazione da 500 mL 0,1 m. Contrassegnare la bottiglia e conservarla a 4 gradi centigradi. NOT:</</c2> Il mezzo è buono da usare per un massimo di un mese a 4 gradi centigradi.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparare il mezzo di coltura MV-4-11: aggiungere 50 mL di siero bovino fetale (FBS) a 500 mL del mezzo di Dulbecco modificato di Iscove (IMDM). Invertire la bottiglia 4-6 volte per mescolare, filtrare sterilizzare attraverso una tazza di filtrazione da 500 mL 0,1 m. Contrassegnare la bottiglia e conservarla a 4 gradi centigradi. NOT:</</c3> Il mezzo è buono da usare per un massimo di un mese a 4 gradi centigradi.</li>
	<li>Preparare il mezzo di manutenzione delle cellule tumorali: aggiungere 50 mL di FBS a 500 mL di Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM). Invertire la bottiglia 4-6 volte per mescolare, filtrare sterilizzare attraverso una tazza di filtrazione da 500 mL 0,1 m. Contrassegnare la bottiglia e conservarla a 4 gradi centigradi. NOT:</</c4> Il mezzo è buono da usare per un massimo di un mese a 4 gradi centigradi.</li>
</ol>2. Preparazione delle cellule
Giorno 1:
<ol><li>Scongelamento delle cellule tumorali</li>
	<li>Riscaldare il mezzo di manutenzione delle cellule tumorali (come descritto al punto 1.3) a un bagno d'acqua di 37 gradi centigradi per 20 min.</li>
	<li>Prendere le cellule congelate U87, U87:EGFR, U87:EGFRvIII e U87:EGFR-EGFRvIII dal serbatoio di azoto liquido. Scongelare le cellule al bagno d'acqua di 37 gradi centigradi per 2 min. PROCEDIMENTI: Fare attenzione quando si prendono le cellule dal serbatoio di azoto liquido. Indossare guanti con protezione termica e occhiali di sicurezza in base alle esigenze.</li>
	<li>Spruzzare la superficie del cofano di coltura dei tessuti con il 70% di etanolo e pulire il 70% di etanolo sulla superficie con gli asciugamani di carta.</li>
	<li>Spruzzare le fiale criogeniche contenenti cellule e la bottiglia media con 70% di etanolo, pulire 70% etanolo sulla superficie con gli asciugamani di carta, e portarli nella cappa di coltura dei tessuti.</li>
	<li>Pipette 5 mL di mezzo di manutenzione delle cellule tumorali in un tubo di centrifuga sterile 15 mL. Invertire il tubo contenente le cellule tumorali 4-6 volte per mescolare. Pipette tutte le cellule nel tubo di centrifuga di 15 mL. Invertire il tubo di centrifuga 4-6 volte per mescolare.</li>
	<li>Centrifugare le cellule a 200 x g per 5 min a 4 gradi centigradi. Aspirare il super-attuoso.</li>
	<li>Lavare le cellule con 10 mL di fosfato tamponato salina (PBS). Centrifugare le cellule a 200 x g per 5 min a 4 gradi centigradi. Aspirare il super-attuoso.</li>
	<li>Risospendere le cellule in 12 mL di supporto di manutenzione delle cellule tumorali (come descritto nel passaggio 1.3). Pipetta su e giù 3-5 volte per mescolare. Trasferire le cellule in un pallone di coltura cellulare T75.</li>
	<li>Far crescere le cellule in un'incubatrice a 37 gradi centigradi con il 5% di CO2. Rimettere il mezzo di manutenzione delle cellule tumorali nel frigorifero di 4 gradi centigradi.</li>
</ol>Giorno 2:
<ol start="2"><li>Controllare le cellule al microscopio. Se necessario, modificare il supporto. Le cellule dovrebbero crescere in un monostrato in coltura.</li>
</ol>Giorno 3:
<ol start="3"><li>Scongelamento delle cellule MV-4-11
	<ol>
<li>Riscaldare il mezzo di coltura MV-4-11 (come descritto al punto 1.2) con un bagno d'acqua di 37 gradi centigradi per 20 min. NOT:</</c2> MV-4-11 può essere cambiato in macrofagi primari o altre linee cellulari macrofagi, a seconda della necessità dello studio specifico.</li>
		<li>Prendere le cellule MV-4-11 congelate dal serbatoio di azoto liquido. Scongelare le cellule a un bagno d'acqua di 37 gradi centigradi per 2 min. ATTENZIONE: Fare attenzione quando si prendono le cellule dal serbatoio di azoto liquido. Indossare guanti con protezione termica e occhiali di sicurezza in base alle esigenze.</li>
		<li>Spruzzare la superficie del cofano di coltura dei tessuti con il 70% di etanolo e pulire il 70% di etanolo sulla superficie con gli asciugamani di carta.</li>
		<li>Spruzzare le fiale criogeniche contenenti cellule e la bottiglia media con 70% di etanolo, pulire 70% etanolo sulla superficie con gli asciugamani di carta, e portarli nella cappa di coltura dei tessuti.</li>
		<li>Pipetta 5 mL di MV-4-11 (come descritto al punto 1.2) in un tubo di centrifuga sterile da 15 mL. Invertire il tubo contenente le cellule tumorali 4-6 volte per mescolare. Pipette tutte le cellule nel tubo di centrifuga di 15 mL. Invertire il tubo di centrifuga 4-6 volte per mescolare.</li>
		<li>Centrifugare le cellule a 200 x g per 5 min a 4 gradi centigradi. Aspirare il super-attuoso.</li>
		<li>Lavare le cellule in 10 mL di PBS e centrificare le cellule a 200 x g per 5 min a 4 gradi centigradi. Aspirare il super-attuoso.</li>
		<li>Risospendere le celle in 12 mL di MV-4-11 (come descritto nel passaggio 1.2). Delicatamente pipette su e giù 3-5 volte per mescolare. Trasferire le cellule in un pallone di coltura cellulare T75.</li>
		<li>Far crescere le cellule in un'incubatrice a 37 gradi centigradi con il 5% di CO2.</li>
	</ol></li>
	<li>Suddivisione delle cellule tumorali
	<ol>
<li>Riscaldare il mezzo di cellule staminali senza siero (come descritto al punto 1.1) con un bagno d'acqua a 37 gradi centigradi per 20 min.</li>
		<li>Spruzzare la superficie del cofano di coltura dei tessuti con il 70% di etanolo e pulire il 70% di etanolo sulla superficie con gli asciugamani di carta. Prendere la soluzione di distacco cellulare dal frigorifero. Spruzzare le bottiglie di soluzione di distacco medio e cellulare con 70% di etanolo, pulire 70% etanolo sulla superficie con gli asciugamani di carta e portarli nella cappa di coltura dei tessuti. NOT:</</c2> Non preriscaldare la soluzione di distacco delle celle accutasi.</li>
		<li>Trasferire la coltura delle cellule tumorali dall'incubatrice nella cappa di coltura dei tessuti. Aspirare il mezzo, aggiungere 2 mL di soluzione di distacco cellulare nel pallone. NOT:</</c3> Il risciacquo con PBS prima di aggiungere accutase è facoltativo qui.</li>
		<li>Mettere il pallone nel cofano. Controlla se le cellule tumorali si arrotondano ogni minuto. Una volta che le cellule tumorali si arrotondano, toccare delicatamente il lato del pallone per aiutare le cellule a staccarsi dal pallone.</li>
		<li>Pipette 8 mL di mezzo di cellule staminali senza siero nel flacone, pipette su e giù 3 volte per mescolare, e trasferire le cellule in un tubo di centrifuga sterile 15 mL. Centrifugare le cellule a 200 x g per 5 min a 4 gradi centigradi. Aspirare il super-attuoso.</li>
		<li>Lavare le cellule in 10 mL di PBS. Pipetta su e giù 3-5 volte per mescolare. Centrifugare le cellule a 200 x g per 5 min a 4 gradi centigradi. Aspirare il super-attuoso. NOT:</</c6> Questo passaggio è facoltativo.</li>
		<li>Risospendere le cellule in 10 mL di mezzo di cellule staminali senza siero (come descritto al punto 1.1). Pipetta su e giù 3-5 volte per mescolare. Prendere 10 l delle cellule e mescolare con 10 L di soluzione Trypan Blue. Pipetta 10 - L della miscela nel vetrino di conteggio, quantificare il numero di cellule viventi utilizzando un contatore cellulare automatico.</li>
		<li>Regolare la densità cellulare a 2,5 x 105 cellule/mL con il mezzo di cellule staminali senza siero (come descritto al punto 1.1), e semiare 2 mL delle cellule in ogni pozzo di una piastra di coltura cellulare a 6 pozze. Per ogni tipo di cellule, seme 3 pozzi (campione triplicato). Allo stesso tempo, preparare 6 pozzi con 2 mL di mezzo di cellule staminali senza sè (senza cellule). NOT:</</c8> Questi campioni saranno utilizzati: 1) come controlli negativi e 2) per regolare il volume medio condizionato in base ai numeri di cellulare.</li>
		<li>Mettere le 6 piastre di pozzo in un'incubatrice a 37 gradi centigradi con il 5% di CO2. Lasciare che le cellule crescano per 24 ore.</li>
	</ol></li>
</ol>3. In Vitro Macrophage Attrazione Saggio
<ol><li>Preparazione dei supporti condizionati
	<ol>
<li>Riscaldare il mezzo di manutenzione delle cellule tumorali (come descritto al punto 1.3) a un bagno d'acqua di 37 gradi centigradi per 20 min.</li>
		<li>Spruzzare la superficie del cofano di coltura dei tessuti con il 70% di etanolo e pulire il 70% di etanolo sulla superficie con gli asciugamani di carta. Prendere la soluzione di distacco cellulare dal frigorifero. Spruzzare le bottiglie del mezzo e la soluzione di distacco cellulare con il 70% di etanolo, pulire 70% etanolo sulla superficie con gli asciugamani di carta e portarli nella cappa di coltura dei tessuti.</li>
		<li>Togliere i piatti a 6 pozzi dall'incubatrice. Tubo con attenzione il supporto condizionato in 15 mL di tubi di centrifuga sterile. Metti i tubi sul ghiaccio. Pipette il supporto nel "solo media" bene in un tubo di centrifugare sterile 15 mL separato. NOT:</</c2> Prima di questo passaggio, assicurarsi di controllare al microscopio per vedere se le cellule si attaccano. In caso contrario, è possibile utilizzare piastre rivestite al punto 2.4.8 per consentire un migliore attaccamento o includere le celle galleggianti nel passaggio di conteggio.</li>
		<li>Aggiungere 0,5 mL di soluzione di distacco cellulare in ogni pozzetto della piastra a 6 pozze. Controlla se le cellule tumorali si arrotondano ogni minuto. Una volta che le cellule tumorali si arrotondano, toccare delicatamente il lato della piastra per aiutare le cellule a staccarsi.</li>
		<li>Pipetta 2,5 mL di mezzo di manutenzione delle cellule tumorali nel pozzo, pipetta su e giù 3 volte per mescolare e trasferire le cellule in un tubo di centrifuga sterile da 15 mL. Prendere 10 l delle cellule e mescolare con 10 L di soluzione Trypan Blue. Pipetta 10 - L della miscela nel vetrino di conteggio e quantificare il numero di cellule viventi utilizzando un contatore cellulare automatico.</li>
		<li>Regolare il volume del supporto condizionato in base al numero di cellulare utilizzando il mezzo di cellule staminali libere del siero (incubazione di 37 gradi centigradi durante la notte). Ad esempio, se il pozzo A ha 3 volte il numero di celle vive con il minor numero di celle, diluire il supporto condizionato 1:3. Questo passaggio viene utilizzato per controllare la differenza causata dal tasso di proliferazione cellulare. NOT:</</c3> Il motivo per utilizzare il supporto per cellule staminali prive di siero con 37 gradi centigradi è quello di controllare il possibile cambiamento nel supporto con un'esposizione prolungata di 37 gradi centigradi.</li>
		<li>Filtrare il supporto condizionato con i filtri da 0,45 m. Metti il supporto condizionato sul ghiaccio. NOT:</</c4> Questo passaggio rimuove le cellule e i detriti cellulari nel supporto condizionato.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparazione delle cellule MV-4-11
	<ol>
<li>Riscaldare il mezzo IMDM (senza FBS) a un bagno d'acqua di 37 gradi centigradi per 20 min.</li>
		<li>Spruzzare la superficie del cofano di coltura dei tessuti con il 70% di etanolo e pulire il 70% di etanolo sulla superficie con gli asciugamani di carta. Spruzzare la bottiglia media con il 70% di etanolo, pulire 70% etanolo sulla superficie con gli asciugamani di carta e portarli nella cappa di coltura dei tessuti.</li>
		<li>Prendere il flacone di cellule MV-4-11 nel cofano di coltura dei tessuti. Pipetta 10 mL di cellule in un tubo di centrifuga sterile da 15 mL. Prendere 10 l di cellule e mescolare con 10 .L di soluzione Trypan Blue. Pipetta 10 - L della miscela nel vetrino di conteggio e quantificare il numero di cellule viventi utilizzando un contatore cellulare automatico. Centrifugare le cellule a 200 x g per 5min a 4 gradi centigradi. Aspirare il super-attuoso.</li>
		<li>Lavare le cellule con 10 mL di PBS e centrifugare le cellule a 200 x g per 5 min a 4 gradi centigradi. Aspirare il super-attuoso.</li>
		<li>Risospendere le celle nel mezzo IMDM (senza FBS) per una densità di cellule finali di 1x106 celle/mL. NOT:</</c5> Il numero di cellule di macrofagi utilizzati qui può essere regolato.</li>
	</ol></li>
	<li>Saggio di Transwell NOT:</</c1> Per questo passaggio, utilizzare un kit di analisi per la migrazione delle celle o acquistare i reagenti e inserire separatamente. Per le celle MV-4-11, scegliere Inserti Transwell con dimensioni di 5 pori m. Per rilevare la migrazione dei macrofagi, quantificare direttamente il numero di macrofagi nella camera inferiore o utilizzare metodi colorimetrici/fluorimetrici. Qui, dimostriamo il saggio usando il metodo colorimetrico.<ol>
<li>Portare la piastra 24-bene, l'inserto e i reagenti a temperatura ambiente.</li>
		<li>Aggiungete 250 celle di MV-4-11 preparate sopra in ogni inserto.</li>
		<li>Aggiungete 400 l di medio/medio condizionato (con incubazione notturna a 37 gradi centigradi, questi campioni servono come controllo negativo) alle camere inferiori della piastra di 24 pozze. Per ogni linea o controllo tumorale, utilizzare campioni triplicati. Evitare le bolle tra l'inserto e il mezzo condizionato. Bolle inibirà macrofagi di migrazione ai pozzi di fondo.</li>
		<li>Incubare le piastre in un'incubatrice di 37 gradi centigradi con il 5% di CO2 per 4 h. NOT:</</c4> Il tempo di incubazione può essere regolato. Le cellule che migrano nelle camere inferiori possono essere viste al microscopio.</li>
		<li>Toccare delicatamente l'inserto sulla parete interna dello stesso pozzo e scartare l'inserto. Poiché le cellule MV-4-11 crescono in sospensione, la soluzione di distacco cellulare o il trattamento con la trypsin non è necessaria qui.</li>
		<li>Pipette pipette delicatamente le cellule nei pozzi su e giù 3 volte per mescolare. Trasferire 225 litri di sospensione cellulare su una piastra a parete nera 96 piani adatta per la misurazione fluorescente.</li>
		<li>Diluire il tinrito CyQuant 1:75 con tampone di lisi 4x. Vortice brevemente e girare verso il basso la soluzione. Aggiungete 75 l di soluzione ad ogni pozzetto della piastra di 96 pozze. Incubare 15 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Leggere la fluorescenza utilizzando il set di filtri 480/520 nm con un lettore di lastre di fluorescenza.</li>
		<li>Analizzare i dati sottraendo lo spazio vuoto e normalizzandosi alla linea cellulare del tumore di controllo.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Liu, Y., Cao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+and+function+of+tumor-associated+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+%26+Molecular+Immunology%22%5BJournal%5D)">The origin and function of tumor-associated macrophages.</a> Cellular & Molecular Immunology. 12 (1), 1-4 (2015).</li>
<li>Riabov, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+tumor+associated+macrophages+in+tumor+angiogenesis+and+lymphangiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Role of tumor associated macrophages in tumor angiogenesis and lymphangiogenesis.</a> Frontiers in Physiology. 5, (2014).</li>
<li>Coussens, L. M., Zitvogel, L., Palucka, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutralizing+tumor-promoting+chronic+inflammation%3A+a+magic+bullet%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neutralizing tumor-promoting chronic inflammation: a magic bullet.</a> Science. 339 (6117), 286-291 (2013).</li>
<li>Tsukamoto, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+Blockade+of+IL6+and+PD-1%2FPD-L1+Signaling+Abrogates+Mutual+Regulation+of+Their+Immunosuppressive+Effects+in+the+Tumor+Microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Combined Blockade of IL6 and PD-1/PD-L1 Signaling Abrogates Mutual Regulation of Their Immunosuppressive Effects in the Tumor Microenvironment.</a> Cancer Research. 78 (17), 5011-5022 (2018).</li>
<li>Borgoni, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depletion+of+tumor-associated+macrophages+switches+the+epigenetic+profile+of+pancreatic+cancer+infiltrating+T+cells+and+restores+their+anti-tumor+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Oncoimmunology%22%5BJournal%5D)">Depletion of tumor-associated macrophages switches the epigenetic profile of pancreatic cancer infiltrating T cells and restores their anti-tumor phenotype.</a> Oncoimmunology. 7 (2), e1393596(2018).</li>
<li>Argyle, D., Kitamura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+Macrophage-Recruiting+Chemokines+as+a+Novel+Therapeutic+Strategy+to+Prevent+the+Progression+of+Solid+Tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Targeting Macrophage-Recruiting Chemokines as a Novel Therapeutic Strategy to Prevent the Progression of Solid Tumors.</a> Frontiers in Immunology. 9, 2629(2018).</li>
<li>An, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EGFR+cooperates+with+EGFRvIII+to+recruit+macrophages+in+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">EGFR cooperates with EGFRvIII to recruit macrophages in glioblastoma.</a> Cancer Research. , (2018).</li>
<li>Fan, Q. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EGFR+phosphorylates+tumor-derived+EGFRvIII+driving+STAT3%2F5+and+progression+in+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">EGFR phosphorylates tumor-derived EGFRvIII driving STAT3/5 and progression in glioblastoma.</a> Cancer Cell. 24 (4), 438-449 (2013).</li>
<li>Jacquelot, N., Duong, C. P. M., Belz, G. T., Zitvogel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+Chemokines+and+Chemokine+Receptors+in+Melanoma+and+Other+Cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Targeting Chemokines and Chemokine Receptors in Melanoma and Other Cancers.</a> Frontiers in Immunology. 9, 2480(2018).</li>
<li>Arimont, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+Analysis+of+Chemokine+Receptor-Ligand+Interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Structural Analysis of Chemokine Receptor-Ligand Interactions.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 60 (12), 4735-4779 (2017).</li>
<li>Turner, M. D., Nedjai, B., Hurst, T., Pennington, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokines+and+chemokines%3A+At+the+crossroads+of+cell+signalling+and+inflammatory+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Cytokines and chemokines: At the crossroads of cell signalling and inflammatory disease.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1843 (11), 2563-2582 (2014).</li>
<li>Sokol, C. L., Luster, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemokine+system+in+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">The chemokine system in innate immunity.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (5), (2015).</li>
<li>Pathria, P., Louis, T. L., Varner, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+Tumor-Associated+Macrophages+in+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Targeting Tumor-Associated Macrophages in Cancer.</a> Trends in Immunology. 40 (4), 310-327 (2019).</li>
<li>Mantovani, A., Marchesi, F., Malesci, A., Laghi, L., Allavena, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour-associated+macrophages+as+treatment+targets+in+oncology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Tumour-associated macrophages as treatment targets in oncology.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 14 (7), 399-416 (2017).</li>
</ol>

William A. Weiss è co-fondatore di StemSynergy Therapeutics. Non c'è niente da rivelare.

In questo protocollo, ci sono diversi passaggi chiave: 1) selezione dell'inserto Transwell. Per la linea cellulare MV-4-11, 5 inserti Transwell m funzionano bene. Tuttavia, per altre linee cellulari come la linea cellulare monocito comunemente usata THP-1, una dimensione diversa dei pori potrebbe funzionare meglio. 2) Man mano che linee cellulari diverse crescono a velocità diverse, è importante regolare il volume dei supporti condizionati in base ai numeri di cellulare. A tale scopo, i supporti privi di cellule incubati...

I macrofagi sono cellule immunitarie con un'elevata eterogeneità fenotipica e funzionale1. Essi svolgono ruoli importanti nei sistemi di difesa ospite, riparazione dei tessuti, sviluppo e progressione del tumore1. I TAM sono macrofagi nel microambiente dei tumori solidi. Alcuni TAM possono promuovere la crescita tumorale inibendo l'attività citotossica mediata dalle cellule T, modulando il microambiente tumorale (TME), promuovendo l'angiogenesi, l'invasione e la metastasi2,3,4, 5. I TAM sono tra i tipi di cellule più abbondanti nel TME e un numero più elevato di TAM in genere è correlato alla peggiore sopravvivenza del paziente in molti tipi di tumori solidi6. Le distinte firme genetiche delle cellule tumorali influenzano la loro capacità di reclutare macrofagi. In GBM, un tumore cerebrale aggressivo senza cura, i macrofagi possono rappresentare fino alla metà della massa tumorale7. La coamplificazione del recettore del fattore di crescita epidermico (EGFR) e del suo mutante di troncamento EGFRvIII è frequentemente osservata in GBM, che conferisce vantaggi di crescita tumorale8. Le cellule che coeprimono EGFR ed EGFRvIII attraggono più macrofagi rispetto alle cellule che esprimono EGFR o EGFRvIII da poco.
Le chemiochine sono una famiglia di piccole citochine che svolgono un ruolo significativo nella regolazione della composizione immunitaria nel TME6,9. Le cellule umane esprimono più di 50 citochine10. L'infiltrazione immunitaria nei tumori è in gran parte realizzata dall'interazione tra citochine e recettori citochine11. Ogni tipo di cellule immunitarie esprime recettori chemiochine distinti/ chemiochine e può essere reclutato da cellule che secernono chemiochine specifiche / recettori chemiochine12. Le cellule tumorali possono aumentare l'espressione di alcune chemiochine per reclutare cellule immunitarie come TAM, cellule T regolatorie e cellule soppressori derivate da mieloidi (MDSC)6. Il blocco della chemiochina specifica secreta dai tumori può essere un modo promettente per inibire l'infiltrazione delle cellule immunitarie nella massa del tumore.
Qui, descriviamo un protocollo che consente la valutazione in vitro dell'interazione tumora-macrofago, utilizzando supporti condizionati dalle cellule tumorali contenenti chemiochine e linee cellulari di macrofago.

<table><tbody><tr><td>0,1 &mu; m tazza di filtrazione</td><td>Thermo fisher</td><td>566-0010</td><td></td></tr><tr><td>0.45 &mu; m unità filtrante</td><td>Millipore</td><td>SLHA033SS</td><td></td></tr><tr><td>pipette sierologiche da 10 mL</td><td>Olympus plastics</td><td>12-104</td><td></td></tr><tr><td>provette da centrifuga sterili da 15 mL</td><td>Olympus plastics</td><td>28-103</td><td></td></tr><tr><td>puntale per pipetta da 1 mL</td><td>ART molecular bioproducts</td><td>2779-RI</td><td></td></tr><tr><td>pipetta aspirante da 2 mL</td><td>Falcon</td><td>357558</td><td></td></tr><tr><td>piastra a 24 pozzetti</td><td>Millipore</td><td>ECM507</td><td>Fa parte di ECM507, o può essere acquistato separatamente</td></tr><tr><td>4x tampone di lisi</td><td>Millipore</td><td>ECM507</td><td>Parte di ECM507, o può essere acquistato separatamente</td></tr><tr><td>5 &mu; m Inserto Transwell</td><td>Millipore</td><td>ECM507</td><td>Parte di ECM507, oppure può essere acquistato separatamente</td></tr><tr><td>Pallone da 75 cm2</td><td>Corning</td><td>430641U</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Tecnologie cellulari innovative</td><td>AT-104</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>CyQuant Dye</td><td>Millipore</td><td>ECM507</td><td>Parte di ECM507, oppure può essere acquistato separatamente</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>DMEM:F12</td><td>Gibco</td><td>10565-018</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>26140</td><td></td></tr><tr><td>FGF</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Gibco</td><td>12440-053</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Penna Strep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blu</td><td>Biorad</td><td>1450021</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro analisi per studiare l'interazione tumora-macrophage

In Vitro Assay to Study Tumor-macrophage Interaction

I macrofagi associati al tumore (TAM) rappresentano una grande percentuale di cellule nella massa tumorale per diversi tipi di cancro. Glioblastoma (GBM), un tumore maligno al cervello senza cura, ha fino a metà dei ARM di massa tumorale. I TAM possono essere pro-tumorale o anti-tumorale, a seconda dell'attivazione di geni specifici nelle cellule. Le mutazioni genetiche nei tumori, attraverso la regolazione dell'espressione della citochina, possono influenzare il reclutamento di TAM nel microambiente tumorale. Qui, descriviamo un saggio quantitativo basato sulle cellule per valutare il reclutamento di macrofaci da parte del mezzo condizionato dalle cellule tumorali. Questo analisi utilizza la linea cellulare del macrofago umano MV-4-11 per studiare l'attrazione dei macrofazaggi da parte del mezzo condizionato dal glioblastoma, consentendo un'elevata riproducibilità e bassa variabilità. I dati generati con questo saggio possono contribuire a una migliore comprensione dell'interazione tra il tumore e il microambiente tumorale. Un saggio simile può essere usato per valutare l'interazione tra le cellule tumorali e altre cellule immunitarie, comprese le cellule T e le cellule killer naturali (NK).

I risultati sono di solito mostrati tramite grafici a barre (esempio mostrato Figura 1). I campioni con valori elevati di 480/520 indicano che il supporto condizionato ha un'elevata capacità di reclutare macrofagi. A seconda delle esigenze sperimentali, possono essere inclusi controlli aggiuntivi. Ad esempio, si possono usare anticorpi neutralizzanti per trattare i media condizionati per abolire il macrofalo chemiotassi, ed eseguire lo stesso saggio. Si posso...

Questo articolo rappresenta un utile saggio in vitro per valutare la capacità del mezzo condizionato dalle cellule tumorali per attirare i macrofagi.

In Vitro Analisi per studiare l'interazione tumora-macrophage

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a ...

I macrofagi associati al tumore svolgono ruoli importanti nel microambiente tumorale. Comprendere come le diverse mutazioni genetiche nelle cellule tumorali influenzino il reclutamento di macrofagi è fondamentale per progettare un trattamento personalizzato per i pazienti oncologici. Questo saggio fornisce un modo semplice e robusto per valutare l'interazione tra cellule tumorali e macrofagi in vitro.Questo saggio può essere modificato per valutare le interazioni tra le cellule tumorali e altre cellule immunitarie in vitro. Per iniziare questa procedura, riscaldare il mezzo di cellule staminali privo di siero posizionandolo in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius per 20 minuti. Spruzzare la superficie del cappuccio di coltura tissutale con il 70% di etanolo e pulire la superficie spruzzata con tovaglioli di carta.Successivamente spruzzare le bottiglie della soluzione di distacco di medie e celle con etanolo al 70% e pulirle con tovaglioli di carta. Trasferire le bottiglie pulite nel cappuccio di coltura tissutale. Recuperare la cellula tumorale e trasferirla nella cappa di coltura tissutale.Aspirare il mezzo e lavare le cellule con 10 millilitri di PBS. Quindi aggiungere due millilitri di soluzione di distacco cellulare al pallone. Impostare il pallone nel cofano, controllando ogni minuto per vedere se le cellule tumorali si sono arrotondate per eccesso.Una volta che le cellule tumorali si arrotondano, toccare delicatamente il lato del pallone per aiutare le cellule a staccarsi. Dopo questo, pipettare otto millilitri di mezzo cellulare privo di siero nel pallone e pipettare su e giù tre volte per mescolare. Trasferire questa sospensione cellulare in un tubo di centrifuga da 15 millilitri e centrifugare a 200 volte g e a quattro gradi Celsius per cinque minuti.Aspirare il supernatante. Quindi lavare le celle in 10 millilitri di PBS, assicurandosi di pipettare su e giù da tre a cinque volte per mescolare. Centrifugare le cellule a 200 volte g e a quattro gradi Celsius per cinque minuti.Aspirare il supernatante e rimescolare le cellule in 10 millilitri di mezzo privo di siero. Pipetta su e giù da tre a cinque volte per mescolare. Mescolare 10 microlitri di questa sospensione cellulare con 10 microlitri di soluzione Trypan Blue.Successivamente pipetta 10 microlitri del Trypan Blue e miscela cellulare in una diapositiva di conteggio, e utilizzare un contatore di cella automatico per quantificare il numero di cellule viventi. Utilizzare il mezzo cellulare privo di siero per regolare la densità cellulare a 2,5 per 10 alla quinta cella per millilitro. Quindi semina due millilitri delle cellule in ogni pozzo di un piatto di coltura a sei pozzi.Allo stesso tempo, preparare sei pozzi con solo due millilitri di mezzo di cellule staminali privo di siero. Successivamente, incubare le piastre a sei pozzi a 37 gradi Celsius con 5% di anidride carbonica per 24 ore. Prima spruzzare la superficie del cappuccio di coltura tissutale con il 70% di etanolo e pulire la superficie spruzzata con tovaglioli di carta.Successivamente spruzzare le bottiglie della soluzione di distacco di medie e celle con etanolo al 70% e pulirle con tovaglioli di carta. Trasferire le bottiglie pulite nel cappuccio di coltura tissutale. Dopo questo, recupera le piastre a sei pozzi dall'incubatore.Pipettare con cura il supporto condizionato in tubi di centrifuga sterile da 15 millilitri e posizionare i tubi sul ghiaccio. Aggiungere 0,5 millilitri di soluzione di distacco cellulare in ogni pozzo delle piastre a sei pozzi e controllare ogni minuto se le cellule tumorali si sono arrotondate per eccesso. Una volta che le cellule tumorali si arrotondano, toccare delicatamente il lato della piastra per aiutare a staccare le cellule.Pipetta successiva 2,5 millilitri di mezzo di mantenimento delle cellule tumorali nel pozzo e pipetta su e giù tre volte per mescolare. Trasferire le cellule in un tubo di centrifuga sterile da 15 millilitri. Mescolare 10 microlitri di cellule con 10 microlitri di soluzione Trypan Blue e trasferire 10 microlitri di questa miscela nella diapositiva di conteggio.Utilizzare un contatore di cellule automatico per quantificare il numero di cellule viventi e utilizzare il mezzo di cellule staminali privo di siero che è stato incubato a 37 gradi Celsius durante la notte per regolare il volume del supporto condizionato in base al numero di cellule. Filtrare il supporto condizionato attraverso filtri da 0,45 micrometri e posizionare il supporto condizionato sul ghiaccio. Per iniziare, riscaldare il mezzo IMDM in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius per 20 minuti.Pulire la cappa di coltura tissutale con il 70% di etanolo e pulire la bottiglia di mezzo e trasportarla nel cappuccio come descritto in precedenza. Successivamente trasferire il pallone delle cellule MV-4-11 nel cofano. Pipetta 10 millilitri di cellule in un tubo di centrifuga da 15 millilitri.Utilizzare Trypan Blue e un contatore di celle automatico per quantificare il numero di celle viventi come descritto in precedenza. Quindi centrifugare le cellule a 200 volte g e a quattro gradi Celsius per cinque minuti. Aspirare il supernatante e lavare le cellule con 10 millilitri di PBS.Centrifugare di nuovo a 200 volte g e a quattro gradi Celsius per cinque minuti. Aspirare il supernatante e rimescolare le cellule nel mezzo IMDM ad una densità cellulare finale di un milione di cellule per millilitro. Per prima cosa porta i materiali necessari a temperatura ambiente.Aggiungere 250 microlitri delle celle MV-4-11 preparate ad ogni inserto. Aggiungere quindi 400 microlitri del mezzo o del mezzo condizionato solo alle camere inferiori della piastra da 24 pompoli, assicurandosi di aggiungere i campioni in triplice copia. Incubare a 37 gradi Celsius con anidride carbonica al 5% per quattro ore.Quindi toccare delicatamente l'inserto sulla parete interna dello stesso pozzo e scartare l'inserto. Pipettare delicatamente le cellule nei pozzi su e giù tre volte per mescolare. Trasferire 225 microlitri di questa sospensione cellulare nei pozzi di una piastra da 96 po' con pareti nere adatta alla misurazione fluorescente.Successivamente, diluire il colorante CyQUANT con tampone di lysis 4x con un rapporto da uno a 75. Vortice brevemente e girare verso il basso la soluzione. Trasferire 75 microlitri di questa soluzione in ogni pozzo della piastra da 96 pozzi e incubare a temperatura ambiente per 15 minuti.Utilizzando un lettore di lastre di fluorescenza, leggere la fluorescenza e analizzare i dati come delineato nel protocollo di testo. In questo studio, un saggio in vitro viene utilizzato per studiare l'interazione del macrofago tumorale. Campioni con alti valori di fluorescenza indicano che il supporto condizionato ha un'alta capacità di reclutare macrofagi.A seconda delle esigenze sperimentali, è possibile includere controlli aggiuntivi. Ad esempio, si possono usare anticorpi neutralizzanti per trattare i mezzi condizionati per abolire la chemiotassi macrofagia e funzionare allo stesso modo. Si possono anche aggiungere chemiochine extra ai supporti condizionati, che fungono da controllo positivo.È importante controllare le differenze di numero di cella per questo test perché diversi tipi di cellule possono crescere a velocità diverse. La conferma in vivo dei risultati in vitro è fondamentale. Si possono iniettare cellule tumorali nei topi e analizzare i tumori con citometria a flusso, immunosottenizione e CitoF per confermare i risultati.

in-vitro-assay-to-study-tumor-macrophage-interaction

Research

Ricerca

JoVE Journal

Cancer Research

Ricerca sul cancro

In questo video, studiamo l'interazione tumore-macrofago utilizzando un saggio di interazione transwell-macrofago basato sulla fluorescenza. Il saggio prevede l'analisi della migrazione dei macrofagi attraverso la chemiotassi indotta da sostanze chimiche.

Saggio di attrazione dei macrofagi Transwell basato sulla fluorescenza: un metodo in vitro per studiare l'interazione tumore-macrofago attraverso la chemiotassi indotta da sostanze chimiche

Comprendere il comportamento maligno del cancro richiede la creazione di modelli accurati di come le cellule tumorali interagiscono con i componenti del microambiente tumorale, come i macrofagi. Qui descriviamo due metodi per studiare l'interazione delle cellule di glioblastoma con i macrofagi e le microglia associati al tumore, dove viene valutato l'effetto sull'invasione del glioblastoma.

Coculture saggi per studiare macrofagi e microglia stimolazione del glioblastoma Invasion

In questo studio è stata esaminata l'attività fagocitica dei macrofagi contro le cellule tumorali, in particolare le cellule carcinoma mammario dei topi da 4T1. Il modello di cocoltura a cellule vive è stato stabilito e osservato utilizzando una combinazione di microscopia a contrasto di interferenza fluorescente e differenziale. Questa valutazione è stata immaginata utilizzando un software di imaging per sviluppare video time-lapse multipunto.

Time-Lapse 2D Imaging dell'attività fagocitica in M1 Macrophage-4T1 Mouse Mammary Carcinoma Cells in Co-cultures

Qui, presentiamo un metodo utilizzando supporti a membrana permeabili per facilitare lo studio della segnalazione paracrina senza contatto utilizzata dalle cellule tumorali per sopprimere la risposta immunitaria. Il sistema è suscettibile di studiare il ruolo dei fattori secreti sul tumore nell'smorzamento dell'attivazione dei macrofaci.

Studiare gli effetti dei ligandi paracrini setosecreti dal tumore sull'attivazione dei macrofagi utilizzando la co-cultura con i supporti membrana permeabili

Qui, presentiamo un protocollo per studiare l'interazione di macrofagi primari derivati da monociti umani con uno sferoide tumorale in una matrice di collagene I tridimensionale (3D), con la possibilità di confrontare l'impatto delle proprietà solubili e fisiche del microambiente sull'invasione cellulare.

Un test di co-invasione di macrofagi-tumori sferoidi

Dati i limitati modelli di xenotrapianto disponibili per studiare le interazioni tra CART umane e cellule mieloidi, abbiamo stabilito modelli in vitro e in vivo per comprendere l'impatto dei macrofagi umani sulle cellule CART. I risultati possono potenzialmente essere generalizzati per valutare i ruoli dei macrofagi nel microambiente tumorale e testare immunoterapie mirate ai macrofagi.

Studio delle interazioni tra cellule mieloidi e cellule CAR T in vitro e in vivo

Qui presentiamo un protocollo dettagliato per l'applicazione della rodamina 123 per identificare il potenziale di membrana mitocondriale (MMP) e studiare CLIC4 HN4 di atterramento-indotta delle cellule apoptosi in vitro. Sotto il microscopio di fluorescenza comune e microscopio a fluorescenza confocale, la modifica in tempo reale di MMP è stata registrata.

Rilevamento del potenziale di membrana di mitocondri per studiare CLIC4 HN4 Knockdown-indotta delle cellule apoptosi In Vitro

Il test della cometa è un metodo efficace per rilevare danni al DNA compreso singolo e doppio filamento di DNA si rompe. Descriviamo la cometa alcalino e neutro saggi per misurare il danno del DNA in cellule di cancro per valutare l'effetto terapeutico della chemioterapia.

Valutazione In Vitro del DNA danni utilizzando test della cometa

Questo protocollo descrive un'analisi di invasione verticale invertito che potrebbe essere utilizzata per quantificare le funzionalità di migrazione e invasione delle cellule in un ambiente tridimensionale, preservando il microambiente cellulare. Questo test è adatto per le cellule rare e/o sensibili.

Lo spostamento verso l'alto: Un semplice e flessibile In Vitro tridimensionale invasione protocollo di analisi

Questa carta presenta una procedura completa per valutare in vitro in esistenza l'angiogenesi del tumore classico nel hemangioblastomas (HBs) e del suo ruolo in HBs. I risultati evidenziare la complessità della HB-neovascolarizzazione e suggeriscono che questa forma comune dell'angiogenesi è solo un meccanismo complementare in HB-neovascolarizzazione.

Una procedura completa per valutare le prestazioni In Vitro del Hemangioblastoma Neovascularization putativo utilizzando la sferoide germogliatura Assay

Scopri un saggio in vitro per valutare il reclutamento dei macrofagi da parte del medium condizionato da cellule tumorali. Questo metodo facilita lo sviluppo di terapie oncologiche personalizzate.

In Vitro Analisi per studiare l'interazione tumora-macrophage

Esplora altri video