Un modello basato sulla linea cellulare Murine di inibizione cronica CDK9 per studiare i difetti di elongazione trascrizionale non genetica diffusa (TE^sicuramente)in Tumori

Dato che i tumori TEdeff sono un ostacolo significativo contro l'immunoterapia, il nostro modello farmacologico è uno strumento vantaggioso perché imita adeguatamente i diffusi difetti trascrittivi ed epigenetici osservati in tali tumori, e consente di studiare queste anomalie non genetiche per ottenere nuove intuizioni, trovare nuovi usi per i farmaci esistenti o trovare nuove strategie contro tali tumori. Questo è un modello facile da stabilire e generalizzabile per studiare i difetti di allungamento trascrizionale nei tumori, consentendo di studiare le interazioni tumorali-immunitarie sia in vitro che in vivo. Questo metodo può essere applicato anche alle linee di carcinoma umano.

Lo abbiamo testato su T47D e CAL51 a breve termine, dando origine a caratteristiche simili a TEdeff. Il protocollo che descriviamo qui fornisce un framework di base per ridurre al minimo le variabili note critiche per la generazione di funzionalità simili a TEdeff per inibizione cronica di CDK9. Tuttavia, bisogna fare attenzione a ottimizzare l'esatta dose subletale di flavopirindolo per altre linee murine.

L'impatto della variazione nella densità di placcatura cellulare, nelle condizioni di coltura, nelle condizioni di stimolazione delle citochine può variare per diverse linee murine cellulari. Inizia estraendo RNA poliA-positivo dalla metà dei campioni precedentemente ribosomiali impoveriti di RNA usando perline magnetiche oligo dT. Riprestare le perline nel flaconcino vortice per 30 secondi e trasferire 200 microlitri delle perline in un tubo.

Aggiungere un volume uguale di buffer di associazione e mescolare il contenuto. Posizionare il tubo in un magnete per un minuto e scartare il supernatante. Quindi, rimuovere il tubo dal magnete e riprestare le perline lavate in 100 microlitri di tampone di legame.

Regolare il volume del campione impoverito di RNA ribosomiale a 100 microlitri con Tris-HCl da 10 millimolari a pH 7,5. Aggiungere 100 microlitri di buffer di legame al campione. Riscaldare la miscela a 65 gradi Celsius per due minuti per interrompere le strutture secondarie dell'RNA, quindi posizionarla immediatamente sul ghiaccio.

Aggiungere i 200 microlitri di RNA totale ai 100 microlitri di perline lavate e mescolare accuratamente su un rotore per cinque minuti. Posizionare il tubo sul magnete per uno o due minuti, rimuovere con cura tutto il supernatante, quindi rimuovere il tubo dal magnete e aggiungere 200 microlitri di tampone di lavaggio. Mescolare con cura il campione tubazione su e giù alcune volte, riportare il tubo al magnete per un minuto e rimuovere il supernatante.

Quindi, utilizzare uno spettrofotometro per misurare la purezza e la concentrazione dell'mRNA isolato legato al tallone. Utilizzare la restante metà del campione impoverito di RNA ribosomiale come input per le colonne della proteina A per immunoprecipitato gli RNA con cappuccio a cinque primi con anticorpo monoclonale a 7-metilguanosina. Lavare la proteina A perline magnetiche dal kit RIP secondo il protocollo del produttore per pre-legare l'anticorpo alle perline, dell'anticorpo 7-metilguanosina al tallone sospeso in 100 microlitri di tampone di lavaggio dal kit.

Incubare la miscela a temperatura ambiente per 30 minuti mentre si ruota a bassa velocità. Quindi centrifugare brevemente i tubi e metterli sul separatore magnetico. Rimuovere e scartare il supernatante, quindi togliere i tubi dal separatore magnetico e rimescolare le perline con 500 microlitri di tampone di lavaggio.

Vortice i tubi, centrifugarli brevemente, e rimetterli sul separatore magnetico, e di nuovo scartare il supernatante. Quindi, aggiungere 120 nanogrammi di RNA ribosomiale impoverito di RNA alle perline legate agli anticorpi insieme a un microlitro di inibitore della RNasi e incubare la miscela a temperatura ambiente per 60-90 minuti con lieve agitazione. Dopo l'incubazione, far girare il campione a 300 volte g per 10 secondi e trasferire il supernatante con l'mRNA non chiuso su un nuovo tubo di microcentrifugo.

Ripetere il lavaggio altre due volte con 100 microlitri di tampone di lavaggio e mettere in comune il supernatante raccolto. Elute l'mRNA chiuso dalle perline aggiungendo 300 microlitri di tampone di lisi dell'urea preparati secondo le indicazioni manoscritte e riscaldando la miscela a 65 gradi Celsius per due o tre minuti. Unire 300 microlitri del campione eluito con 300 microlitri di fenolo:cloroformio:alcol isoamile, invertire la miscela e lasciare per 10 minuti.

Mescolare delicatamente di nuovo il campione e centrifugare per due minuti. Pipettare con cura lo strato superiore in un tubo fresco e scartare lo strato inferiore. Aggiungere 300 microlitri di 2-propanolo e 30 microlitri di acetato di sodio trimolare al campione, invertirlo alcune volte e metterlo in meno 20 gradi Celsius per 20 ore.

Dopo l'incubazione, centrifugare il campione per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Scartare con cura il supernatante e asciugare il pellet a temperatura ambiente per cinque minuti. Rimescolare il pellet in acqua priva di nucleasi e misurare la purezza e la concentrazione dell'RNA con uno spettrofotometro.

Isolare le cellule cd8-positive secondo le direzioni del manoscritto, quindi rimorsi le cellule nel buffer del sistema di separazione magnetica disponibile in commercio. Aggiungere 100 microlitri di cocktail di anticorpi per ogni millilitro di cellule e incubare le cellule sul ghiaccio per 15 minuti. Quindi, aggiungere 100 microlitri di perline magnetiche ogni 100 microlitri di cocktail anticorpale e lasciare le cellule sul ghiaccio per altri 15 minuti.

Dopo l'incubazione, aggiungere sette millilitri di tampone di separazione magnetica alle cellule, aliquota da tre a quattro millilitri a un tubo fresco e posizionare il tubo su un magnetico per cinque minuti. Decantare il liquido con le celle cd8-positive in un tubo fresco sul ghiaccio. Quindi, aggiungere i restanti tre o quattro millilitri di cellule alle perline magnetiche e posizionare il tubo sul magnete per cinque minuti.

Decantare il secondo lotto di celle cd8-positive al tubo con il primo lotto. Cellule SAMBOK di fibroblasti aderenti ingegnerizzate con semi insieme alla molecola co-stimolante a 75.000 cellule per pozzo in piastre da 24 pozzi e coltura in un incubatore umidificato di 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica. Dopo 24 ore, lavare il monostrato APC una volta con il mezzo di Dulbecco modificato di Iscove e aggiungere 0,5 per 10 alle sei cellule ingenua in due millilitri di mezzo integrati secondo le indicazioni del manoscritto.

Coltura delle cellule per 20 ore, quindi raccogliere delicatamente le cellule OT-I non aderenti raccogliendo il supporto e pellettando le cellule a 191 volte g per due minuti. Contare le cellule e seminarle con un rapporto uno a uno in una co-coltura con cellule B16/F10, B16/F10-OAV non trattate e B16/F10-OAV pretrattate con flavopirindolo. Coltura delle cellule per 20 ore in un incubatore umidificato di 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica, quindi rimuovere le cellule cd8 positive OT-I e lavare le cellule Aderenti B16/F10-OAV in PBS.

Tripinare i tre gruppi di cellule attaccate nello 05%EDTA con tripina per cinque minuti, quindi pelletarli a 191 volte g per cinque minuti. Incubare le cellule B16/F10-OVA raccolte in PBS freddo con colorante di vitalità e anticorpi etichettati pertinenti, quindi analizzare la vitalità con citometria a flusso. Questo protocollo è stato utilizzato per stabilire un modello cellulare difettoso di allungamento della trascrizione che mostra una profonda perdita di fosforilazione nella posizione serina 2 sul dominio di ripetizione C-terminale dell'RNA polimerasi II e una significativa diminuzione di H3K36me3, che è implicata nella definizione dei confini di esonero e nell'inibire le trascrizioni criptica fuggitiva.

Le cellule mostrano difetti critici di elaborazione dell'mRNA con rapporti crescenti di mRNA non correttamente limitati e non poliadenylati. Inoltre, in questo modello cellulare si osserva una repressione specifica dei principali geni della via di risposta infiammatoria e la morte cellulare mediata da FasL. Un saggio esplorativo per verificare se il modello cellulare conferisce resistenza all'attacco citotossico delle cellule T mostra che i difetti cronici di allungamento della trascrizione indotti dal flavopirindolo possono conferire un mezzo di fuga da un attacco immunitario antitumoreo.

Le cellule B16/F10 trattate con flavopiridolo che sovrascrivono stabilmente il gene OAV non erano suscettibili alle cellule T citotossiche positive del CD8, che hanno una tossicità selettiva nei confronti delle cellule che esprimono oAV. Le cellule non pretrattate con flavopirindolo sono state sottoposte a morte cellulare maggiore, mentre il parentale B16/F10 che non esprime l'antigene OAV è sopravvissuto. È importante ricordare che la riduzione del livello di trietilazione fosfoserina 2 e H3K36 sul trattamento con flavopiridolo 25 nanomolare non garantisce una riduzione sia del livello di fopsho-STAT1 che di fosfo-NF-kappaB.

Ogni linea di carcinoma del topo è unica e JAK1 e CCNT1 possono salvare l'effetto del flavopirindolo. Inoltre, questo modello può essere utilizzato in vivo per monitorare la resistenza offerta dai tumori TEdeff contro le risposte immunitarie antitumorali innate e adattive. Ad esempio, i trattamenti anti-asialo potrebbero essere utilizzati per regolare l'attività delle cellule NK e la terapia del checkpoint immunitario potrebbe essere somministrata ai topi portatumiferici TEdeff.

Il carico di linfociti infiltrati nel tumore, o TIL, è un indicatore di successo nell'immunoterapia. Il nostro modello ci ha spianato la strada per esplorare l'entità dell'attivazione e dell'esaurimento dei TIL nel microambiente tumorale TEdeff sia prima che dopo l'immunoterapia.