Name: Valutazione dello stato di fecondazione tracciando lo sperma Morfologia nucleare in Arabidopsis Doppia Fecondazione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 s
Description: Scopri come valutare lo stato di fecondazione in Arabidopsis analizzando la morfologia dei nuclei spermatici con microscopia a epifluorescenza. Questo metodo consente raccolta rapida dei dati per analisi funzionale dei fattori di fecondazione.

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Questo lavoro è stato sostenuto dalla sovvenzione KAKENHI della Japan Society for the Promotion of Science (DA JP17H05832 a T. I.) e dal finanziamento del Programma di Promozione della Ricerca sulle Scienze Molecolari delle Piante Petrolchimiche dell'Università di Chiba (Giappone).

1. Impollinazione artificiale
 NOT:</</c0> Prima di iniziare il processo, è necessaria una coppia di pinze n. 5.
<ol><li>Coltivare A. thaliana (Col-0) a 22 gradi sotto un ciclo scuro di luce/8 chili di 16 ore in una camera di crescita. NOT:</</c1> Tagliare e rimuovere il primo gambo di fiori sviluppato con forbici per promuovere lo sviluppo di gemme ascellari. Le piante in crescita vigorosa (2-3 settimane dopo il taglio del primo gambo; altezza della pianta circa 25 cm) sono adatte per l'analisi.</li>
	<li>Per evitare, rimuovere sepal (Figura 1B), petalo (Figura 1C) e stami (Figura 1D) di boccioli di fiori nella fase 118 (Figura 1A) utilizzando il numero 5 forza. Muoversi con pezzi di petali visto in cima è meglio. NOT:</</c7> Utilizzare una linea di marcatore gamete femminile adatto. In questo protocollo, abbiamo usato una pianta di tipo selvatico come genitore femmina.</li>
	<li>Quindici-diciotto ore dopo l'emasculazione, prendere lo stame di un fiore DMP9KD/HTR10-mRFP allo stadio 138 pizzicando il filamento con pinze.</li>
	<li>Per impollinare, accarezzare delicatamente lo stigma di un pistilo evirato più volte con un'antere dehiscente.</li>
</ol>2. Preparazione dell'ovulo per l'osservazione
 NOT:</</c0> Sono necessari i seguenti elementi: un vetrino a slitta con nastro adesivo a due lati collegato, pinze n. 5, un ago di iniezione da 27 G e un microscopio sezionato.
<ol><li>da 7 a 8 h dopo l'impollinazione (HAP), raccogliere il pistilo e posizionarlo sul nastro fronte/retro, quindi premere delicatamente con pinze per fissare il pistilo sul nastro (Figura 2A,A'). NOT:</</c2> La maggior parte degli ovuli in un pistillo ricevono almeno un tubo di polline 10 HAP9. Se entrambi o uno qualsiasi dei spermatozoi dal primo tubo di polline non riescono a fertilizzare, un secondo tubo di polline sarebbe attratto dall'ovulo a causa del sistema di recupero della fecondazione10. Per analizzare la morfologia dei nuclei di sperma dal primo tubo di polline, si consiglia di completare la preparazione dell'ovulo da 10 HAP al più tardi.</li>
	<li>Tagliare le estremità superiore e inferiore dell'ovaio utilizzando un ago di iniezione al microscopio dissetante (Figura 2B, B ').</li>
	<li>Sfoliare la parete dell'ovaio lungo entrambi i lati del replum (Figura 2C,C') spostando la punta dell'ago di iniezione. NOT:</</c9> Inserire l'ago di iniezione superficialmente per evitare la separazione dell'ovulo dal setto.</li>
	<li>Evert la parete dell'ovaio utilizzando l'ago di iniezione (Figura 2D,D').</li>
	<li>Avvicinare la base del setto a cui sono collegate le ovuli e sollevarla con attenzione con le pinze (Figura 2E).</li>
	<li>Trasferire gli ovuli in una goccia d'acqua su un vetrino di scorrimento e coprire delicatamente con un vetro di copertura per l'osservazione al microscopio a fluorescenza (Figura 2E,E').</li>
</ol>3. Microscopia
 NOT:</</c0> In questo protocollo, abbiamo utilizzato un microscopio a epifluorescenza dotato di un cubo filtro a fluorescenza (vedi Tabella deimateriali), una fotocamera digitale e il software di accompagnamento.
<ol><li>Acquisire immagini di ovuli contenenti nuclei di sperma tom etichettati con mRFP utilizzando un obiettivo 20x o 40x e la fotocamera digitale attrezzata.</li>
	<li>Confermare il numero di nuclei di spermatozoi con etichetta mRFP in un sacco embrionale. NOT:</</c0> Gli ovuli contenenti due nuclei di spermatozoi con etichetta mRFP possono essere inclusi nella dimensione della popolazione per l'analisi statistica.</li>
	<li>Confermare la forma e la posizione di ogni nucleo sperma con etichetta mRFP in un sacco embrionale. NOT:</</c1> Immediatamente dopo essere stato rilasciato da un tubo di polline, un paio di nuclei di spermatozoi con etichetta mRFP con densaviene vengono localizzati tra l'uovo e la cellula centrale. Un nucleo di spermam con etichetta mRFP dedensato rilevato a lato dell'estremità chalazal indica, ad esempio, la fecondazione cellulare centrale. Utilizzando una linea di marcatore di membrana gamet femminile adatta, come mostrato nella Figura supplementare 1, se la cellula sperma è sottoposta o meno alla plasmogamia (dopo la fusione della membrana ma prima della karyogamia) può essere monitorata chiaramente.</li>
</ol>

<ol><li>Mori, T., Kawai-Toyooka, H., Igawa, T., Nozaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gamete+dialogs+in+green+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant%22%5BJournal%5D)">Gamete dialogs in green lineages.</a> Molecular Plant. 8, 1442-1454 (2015).</li>
<li>Dresselhaus, T., Sprunck, S., Wessel, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fertilization+mechanisms+in+flowering+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Fertilization mechanisms in flowering plants.</a> Current Biology. 26, R125-R139 (2016).</li>
<li>Mori, T., Kuroiwa, H., Higashiyama, T., Kuroiwa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GENERATIVE+CELL+SPECIFIC+1+is+essential+for+angiosperm+fertilization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">GENERATIVE CELL SPECIFIC 1 is essential for angiosperm fertilization.</a> Nature Cell Biology. 1, 64-71 (2006).</li>
<li>von Besser, K., Frank, A. C., Johnson, M. A., Preuss, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+HAP2+%28GCS1%29+is+a+sperm-specific+gene+required+for+pollen+tube+guidance+and+fertilization%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis HAP2 (GCS1) is a sperm-specific gene required for pollen tube guidance and fertilization.</a> Development. 133, 4761-4769 (2006).</li>
<li>Mori, T., Igawa, T., Tamiya, G., Miyagishima, S. Y., Berger, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gamete+attachment+requires+GEX2+for+successful+fertilization+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Gamete attachment requires GEX2 for successful fertilization in Arabidopsis.</a> Current Biology. 24, 170-175 (2014).</li>
<li>Takahashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+male+gamete+membrane+protein+DMP9%2FDAU2+is+required+for+double+fertilization+in+flowering+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The male gamete membrane protein DMP9/DAU2 is required for double fertilization in flowering plants.</a> Development. 145, dev170076(2018).</li>
<li>Ingouff, M., Hamamura, Y., Gourgues, M., Higashiyama, T., Berger, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+dynamics+of+HISTONE3+variants+between+the+two+fertilization+products+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Distinct dynamics of HISTONE3 variants between the two fertilization products in plants.</a> Current Biology. 17, 1032-1037 (2007).</li>
<li>Smyth, D. R., Bowman, J. L., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+flower+development+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Early flower development in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 2, 755-767 (1990).</li>
<li>Kasahara, R. D., Maruyama, D., Higashiyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fertilization+recovery+system+is+dependent+on+the+number+of+pollen+grains+for+efficient+reproduction+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Signaling+%26+Behavior%22%5BJournal%5D)">Fertilization recovery system is dependent on the number of pollen grains for efficient reproduction in plants.</a> Plant Signaling & Behavior. 8, e23690(2013).</li>
<li>Kasahara, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fertilization+recovery+after+defective+sperm+cell+release+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Fertilization recovery after defective sperm cell release in Arabidopsis.</a> Current Biology. 22, 1084-1089 (2012).</li>
<li>Hamamura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+imaging+reveals+the+dynamics+of+two+sperm+cells+during+double+fertilization+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Live-cell imaging reveals the dynamics of two sperm cells during double fertilization in Arabidopsis thaliana.</a> Current Biology. 21, 497-502 (2011).</li>
<li>Igawa, T., Yanagawa, Y., Miyagishima, S., Mori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+gamete+membrane+dynamics+during+double+fertilization+of+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Plant+Research%22%5BJournal%5D)">Analysis of gamete membrane dynamics during double fertilization of Arabidopsis.</a> Journal of Plant Research. 126, 387-394 (2013).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Etichette HTR10-mRFP cromatina paterna (cioè, visualizza i nuclei delle cellule spermatiche), e la dinamica nella doppia fecondazione sono state segnalate7. Immediatamente dopo il rilascio da un tubo di polline, i nuclei di spermatozoi etichettati con etichetta HTR10-mRFP sono ancora condensati. Tuttavia, ciascuno dei nuclei di sperma viene decondenato dopo la fusione con un nucleo gameti femminile fecondato a karyogamy tre o quattro ore dopo la fusione della membrana gamete7</su...

Le piante da fiore producono semi attraverso la doppia fecondazione, un processo che è direttamente controllato da interazioni tra proteine localizzate sulla membrana plasmatica gameta1,2. Pianta da Fiore gameti maschili, un paio di spermatozoi, si sviluppano in polline. Un tubo di polline che cresce dopo l'impollinazione fornisce una coppia di spermatozoi ai gameti femminili, una cellula uovo e una cellula centrale, che si sviluppano in un sacco embrionale. Dopo che i gameti maschili e femminili si incontrano, le proteine sulla superficie dei gameti promuovono il riconoscimento, l'attaccamento e la fusione per completare la doppia fecondazione. In studi precedenti, le proteine della membrana dei gameti maschili GENERATIVE CELL SPECIFIC 1 (GCS1)/HAPLESS2 (HAP2)3,4 e GAMETE EXPRESSED 2 (GEX2)5 sono state identificate come regolatori di fertilizzazione coinvolti nella fusione dei gameti e rispettivamente l'allegato. Recentemente abbiamo identificato una proteina di membrana specifica del gamete maschile, DUF679 DOMAIN MEMBRANE PROTEIN 9 (DMP9), come regolatore di fertilizzazione coinvolto nell'interazione dei gameti. Abbiamo scoperto che una diminuzione dell'espressione DMP9 si traduce in un'inibizione significativa della fecondazione delle cellule ovuli durante la doppia fecondazione in A. thaliana6.
Poiché la doppia fecondazione si verifica in un sacco embrionale, che è incorporato in un ovulo che viene ulteriormente avvolto con tessuto ovarico, è difficile osservare e analizzare gli stati dei processi di doppia fecondazione. Per questo motivo, ci sono ancora molti punti poco chiari che ostacolano una comprensione completa dell'intero meccanismo del controllo della doppia fecondazione. L'istituzione di tecniche di osservazione per tracciare il comportamento dei gameti durante la doppia fecondazione in condizioni in vivo è indispensabile per l'analisi funzionale dei potenziali candidati per i regolatori di fecondazione. Recenti studi hanno prodotto linee marker in cui le strutture subcellulari dei gameti sono etichettate con proteine fluorescenti. In questo articolo, dimostriamo un protocollo semplice e veloce per osservare la doppia fecondazione che si è verificato in un sacco embrionale derivato da pistili artificialmente impollinati. Utilizzando la linea di marcatore del nucleo delle cellule spermatrici HTR10-mRFP7, lo stato di fecondazione di ogni gamete femmina può essere discriminato sulla base della morfologia del segnale nucleare dello sperma. Il nostro protocollo incentrato su un tale cambiamento morfologico dei nuclei spermatozoi alla fecondazione può ottenere in modo efficiente una quantità sufficiente di dati per la prova statistica. Una linea DMP9-knockdown con sfondo HTR10-mRFP (DMP9KD/HTR10-mRFP) è stata utilizzata come piante maschili per mostrare un unico modello di fecondazione. Il protocollo è adatto anche per l'analisi funzionale di altri regolatori di fecondazione.

<table><tbody><tr><td>Microscopio a epifluorescenza</td> <td>BX51</td><td>Olympus</td><td></td></tr><tr><td>Vetro di copertura Vetro</td><td>Matsunami</td><td>C018181</td><td></td></tr><tr><td>DMP9KD/HTR10-mRFP</td><td></td><td></td><td>Arabidopsis thaliana, HTR10-mRFP background Takahashi et al. (2018)6</td></tr><tr><td>Nastro</td> <td>biadesivoNichiban</td><td>NW-15S</td><td>15 mm di larghezza</td></tr><tr><td>DP72</td><td>Olympus</td><td></td><td>Degital</td></tr><tr><td>fotocamera Pinze</td><td>Vigor</td><td></td><td>Sono disponibili tutte le 5 pinze disponibili</td></tr><tr><td>Camera di crescita</td><td>Nihonika</td><td>LPH-411PFQDT-SP</td><td></td></tr><tr><td>HTR10-mRFP</td><td></td><td></td><td>Arabidopsis thaliana, ecotipo Columbia-0 (Col-0) background Ingouff et al. ( 2007)7</td></tr><tr><td>Ago per iniezione</td><td>Terumo</td><td>NN-2719S</td><td>27 G</td></tr><tr><td>Vetro per vetrini</td><td>Vetro Matsunami</td><td>S9443</td><td></td></tr><tr><td>SZX9</td><td>Microscopio da dissezione</td><td>Olympus</td><td></td></tr><tr><td>U-MRFPHQ</td> Cubo <td>per filtro a fluorescenza Olympus (Eccitazione: BP535-555, Emissione: BA570-625, Specchio bicromatico: DM565)</td><td></td>UPlanFL N 40x Olympus <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>Obiettivo (NA 1.3),</td></tr><tr><td>UPlanSApo 20x</td><td>Olympus</td><td></td> a immersione in olio <td>Obiettivo (NA 0.75), asciutto</td></tr></tbody></table>

valutazione dello stato di fecondazione tracciando lo sperma morfologia nucleare in arabidopsis doppia fecondazione

Evaluation of Fertilization State by Tracing Sperm Nuclear Morphology in Arabidopsis Double Fertilization

Le piante da fiore hanno un sistema di riproduzione sessuale unico chiamato "doppia fecondazione", in cui ciascuno spermatozoi si fonde con precisione con una cellula uovo o una cellula centrale. Così, due eventi di fecondazione indipendenti si svolgono quasi simultaneamente. La cellula uovo fecondata e la cellula centrale si sviluppano rispettivamente in zigote ed endosperma. Pertanto, un controllo preciso della doppia fecondazione è essenziale per lo sviluppo del seme che ne consegue. La doppia fecondazione si verifica nel gametophyte femminile (sacco embrionale), che è profondamente nascosto e coperto da spessi tessuti ovuli e ovarici. Questa costruzione del tessuto piisilo rende abbastanza difficile l'osservazione e l'analisi della doppia fecondazione e ha creato la situazione attuale in cui molte domande riguardanti il meccanismo della doppia fecondazione rimangono senza risposta. Per la valutazione funzionale di un potenziale candidato per l'regolatore di fecondazione, l'analisi fenotipica della fecondazione è importante. Per giudicare il completamento della fecondazione in Arabidopsis thaliana, le forme dei segnali di fluorescenza che etichettano i nuclei dello sperma vengono utilizzate come indicatori. Una cellula sperma che non riesce a fertilizzare è indicata da un segnale di fluorescenza condensata al di fuori dei gameti femminili, mentre una cellula sperma che concime con successo è indicata da un segnale dedensato a causa della karyogamia con il nucleo dei gameti femminili. Il metodo qui descritto fornisce uno strumento per determinare la fecondazione riuscita o non riuscita in condizioni di invivo.

Gli ovuli di un pistilio impollinato con DMP9KD/HTR10-mRFP sono stati raccolti a 7-8 HAP e osservati.
La maggior parte degli ovuli conteneva due nuclei di spermatozoi con etichetta mRFP con etichetta mRFP con etichetta e mOFST con etichetta durante la prima pagina (lato micropila) e le posizioni del nucleo delle cellule centrali (lato finale di Charazal), rispettivamente (Figura 3A</stro...

Dimostriamo un metodo per determinare la fecondazione riuscita o fallita sulla base della morfologia nucleare dello sperma nell'Arabidopsis doppia fecondazione utilizzando un microscopio a epifluorescenza.

Valutazione dello stato di fecondazione tracciando lo sperma Morfologia nucleare in Arabidopsis Doppia Fecondazione

Flowering plants have a unique sexual reproduction system called &#8216;double fertilization&#39;,&#160;in which each of the sperm cells precisely fuses ...

Questo protocollo fornisce un modo per valutare il coinvolgimento di un certo fattore nella doppia fecondazione dell'arabidopsis. Lo stato di fecondazione può essere giudicato dalla morfologia dei nuclei spermatica a colpo d'occhio, quindi è possibile ottenere rapidamente i dati per l'analisi statistica. Questo metodo è specifico per la valutazione del fenotipo di fecondazione in Arabidopsis.Ci sono ancora regolatori di fecondazione sconosciuti, anche se in Arabidopsis. Questo metodo sarebbe utile per l'analisi funzionale di futuri fattori di fecondazione sconosciuti. Per padroneggiare l'abilità di una gestione rapida e intatta degli ovuli sono importanti per il successo di questa analisi.Per iniziare, far crescere arabidopsis thaliana a 22 gradi Celsius sotto una luce di 16 ore e un ciclo buio di otto ore in una camera di crescita. Tagliare e rimuovere il primo gambo di fiori sviluppato con forbici per promuovere lo sviluppo di gemme ascellari. Due o tre settimane dopo aver tagliato il primo gambo, misurare l'altezza della pianta.Le piante con altezza superiore a 25 centimetri sono considerate piante in crescita vigorosa e sono adatte per l'analisi. Per eviculare, cerca le gemme nella fase 11 con pezzi di petali visti in alto. Usa un numero cinque forcep per rimuovere sepali, petali e stami di boccioli di fiori.Da 15 a 18 ore dopo l'emaculazione, prendere lo stame di una linea di abbattimento DMP9 con sfondo di fiore HTR10-mRFP allo stadio 13 pizzicando il filamento con le forcep. Per impollinare, accarezzare delicatamente lo stigma di un pistillo evirato più volte con un'ante dehiscente. Da sette a otto ore dopo l'impollinazione, raccogliere il pistillo e posizionarlo sul nastro a doppia aspetto.Quindi, premere delicatamente con pinza per fissare il pistillo sul nastro. Al microscopio sezionato, tagliare le estremità superiore e inferiore dell'ovaio usando un ago da iniezione. Spostare la punta dell'ago di iniezione per tagliare la parete dell'ovaio lungo entrambi i lati del replum.Tagliare con cura in modo da non separare il funicolo e il tratto trasmiminte. Evita la parete dell'ovaio. Pizzicare la base del setto a cui sono collegati gli ovuli e sollevarla con attenzione con le forcep.Trasferire gli ovuli in una goccia d'acqua su un vetro scorrevole e coprire delicatamente con un coverglass per l'osservazione al microscopio a fluorescenza. Su un microscopio a epifluorescenza dotato di un cubo filtrante a fluorescenza, regolare l'obiettivo a 20x o 40x. Acquisire immagini degli ovuli contenenti nuclei spermatozoi etichettati con mRFP.Confermare il numero di nuclei spermatico etichettati mRFP in un sacco embrionale. Confermare la forma e la posizione di ogni nucleo spermatico etichettato mRFP in un sacco embrionale. In questo studio, i fenotipi di fecondazione sono stati giudicati dalla morfologia del segnale nucleare dello sperma negli ovuli.La maggior parte degli ovuli conteneva due nuclei spermatozoi decondensati etichettati mRFP sul lato micropilare degli ovociti e sul lato finale charazal della cellula centrale. Ciò indica una doppia fecondazione riuscita. Inoltre, sono stati osservati ovuli contenenti un nucleo spermatico decondensato etichettato mRFP nel nucleo cellulare centrale più un nucleo spermatico condensato etichettato mRFP al di fuori dell'ovulo, che indica una singola fecondazione.In caso di doppia fecondazione fallita, due nuclei spermatozoi condensati etichettati mRFP sono stati osservati al confine dell'ovulo e della cellula centrale. Nell'analisi utilizzando la linea di abbattimento DMP9 con sfondo di polline HTR10-mRFP, raramente sono stati osservati ovuli contenenti un singolo nucleo spermatico condensato etichettato mRFP o tre o più nuclei spermatico etichettati mRFP. Combinandosi con l'uso di linee marcatori femminili, è possibile analizzare lo stato di fecondazione più accurato.Ad esempio, lo stato di fecondazione dopo la fusione del gamete e prima della cariogamia può essere giudicato. Sì, il processo di fecondazione è diviso in diversi passaggi. Le domande che ogni regolatore di fecondazione ha coinvolto in quali passaggi può essere risposto con questo metodo migliorato.Fornirebbe una visione più approfondita della riproduzione sessuale della pianta.

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