Name: Misurazione delle interazioni tra sonde fluorescenti e lignina nelle sezioni delle piante mediante sFLIM in base allautofluorescenza nativa (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-02T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 s
Description: Scopri come misurare le interazioni FRET tra sonde fluorescenti e lignina nelle sezioni di piante utilizzando la tecnica sFLIM. Questo metodo consente studi dinamici delle interazioni enzima-lignina in biomassa lignocellulosica.

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Fanny Laurent (FARE) è ringraziata calorosamente per la preparazione delle figure. La Federazione di ricerca FRABio (Università di Lille, CNRS) è riconosciuta per aver fornito l'ambiente tecnico favorevole al raggiungimento di questo lavoro. I finanziamenti sono stati ottenuti dall'Agenzia nazionale francese per la ricerca (progetto LIGNOPROG ANR-14-CE05-0026).

1. Preparazione del campione
NOTA: i passaggi successivi per la preparazione degli esempi sono descritti nella Figura 1.
<ol><li>Preparazione del campione di impianto<ol>
<li>Da tronchi di legno o frammenti, tagliare campioni lunghi 1 cm con lame di rasoio senza danneggiarne la struttura.</li>
		<li>Incorporare campioni nel centro di glicole di polietilene (PEG), immergendoli in soluzioni successive di aumento della concentrazione di PEG diluite in acqua fino a raggiungere il 100% peg.<ol>
<li>Mettere il campione sotto vuoto per rimuovere l'acqua.</li>
			<li>Mescolare delicatamente i campioni nel 30% v/v PEG per 24 h.</li>
			<li>Mescolare delicatamente i campioni nel 50% v/v PEG per 24 h.</li>
			<li>Mescolare delicatamente i campioni in 100% PEG per 24 h a 70 gradi centigradi (il PEG puro è solido a temperatura ambiente).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Collocare i campioni in capsule a 70 gradi centigradi (su una piastra calda) e diminuire progressivamente la temperatura fino a raggiungere la temperatura ambiente.</li>
		<li>Preparare con cura 30-60 m di sezioni piatte di spessore da questi blocchi peg utilizzando un microtoma e lame usa e getta.</li>
		<li>Raccogliere e lavare le sezioni in tre bagni successivi di acqua per 5 min per rimuovere PEG dalle sezioni.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparazione della sonda fluorescente<ol>
<li>Preparare la soluzione buffer di 30 mM fosfato a pH 6.0.</li>
		<li>Pesare pioppo pione dextran rhodamine polvere.</li>
		<li>Sciogliere la polvere della sonda nel buffer con agitazione continua in una fiala di vetro per 1 h al buio ad una concentrazione finale di 0,1 g/L.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Colorazione del campione vegetale<ol>
<li>Incubare sezioni con 500 sl della sonda fluorescente (cfr. 1,2,3) per 72 h (nessuna agitazione) in un tubo di plastica (non più di 3 sezioni per tubo) al buio.</li>
		<li>Raccogliere una sezione con un pennello, adsorgarlo con un foglio pulito (evitare di asciugare la sezione), quindi montare le sezioni incubate tra un vetro di copertura e un coperchio di #1,5H.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Durata della fluorescenza e calibrazione del sistema di misurazione spettrale
NOTA: il flusso di lavoro completo per la misurazione sFLIM è illustrato nella Figura 2.
<ol><li>Determinare la larghezza della finestra spettrale del rilevatore sFLIM.<ol>
<li>Mettere i cristalli di urea in una scatola di coltura con un fondo di vetro di 0,17 m.</li>
		<li>Posizionare la scatola di coltura su un portacampioni al microscopio e selezionare l'obiettivo 20x.</li>
		<li>Selezionare un laser Ti:Sa con una lunghezza d'onda di 900 nm e una potenza del 2% e attivare la scansione.</li>
		<li>Raccogliere il secondo segnale armonico sul rivelatore sFLIM. NOTA: Il secondo segnale armonico viene emesso ad una lunghezza d'onda esattamente a metà eccitazione di 450 nm; mentre istantanea, questa misura fornisce anche la funzione di risposta strumentale del sistema.</li>
		<li>Regola gradualmente la lunghezza d'onda dell'eccitazione laser da 900 a 980 nm fino a quando il secondo segnale armonico viene raccolto nel secondo canale spettrale (462,5 nm).</li>
		<li>Determinare la lunghezza della finestra spettrale (12,5 nm).</li>
		<li>Se l'intervallo spettrale è diverso da quello previsto, risolvere i problemi eseguendo le operazioni seguenti.<ol>
<li>Regolare il laser a 910 nm.</li>
			<li>Spostare la posizione di griglia con una rotellina di scorrimento per misurare il secondo segnale armonico solo sul primo canale (limite del primo canale).</li>
			<li>Regolare il laser a 935 nm.</li>
			<li>Spostare la posizione di griglia con una rotellina di scorrimento per misurare il secondo segnale armonico solo sul primo canale (limite del secondo canale).</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Calibrazione dei canali spettrometri complessivi<ol>
<li>Inserire lo specchio sullo stadio del microscopio.</li>
		<li>Selezionare il laser continuo visibile (458 nm, potenza 1%).</li>
		<li>Raccogliere il segnale di riflessione sul rilevatore sFLIM e verificare se i fotoni sono misurati nel canale spettrale appropriato.</li>
		<li>Ripetere i passaggi 2.2.2 e 2.2.3 con tutti i laser continui disponibili (514 nm, 561 nm e 633 nm).</li>
		<li>Se il canale spettrale è diverso da quello previsto, spostare la posizione della griglia con la rotellina di scorrimento e ripetere i passaggi 2.1 e 2.2.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Esempio di caratterizzazione della fluorescenza
<ol><li>In uno spettrofluorometro dotato di un accessorio porta pellicola (ad esempio, strumento Jasco FP-8500), posizionare il campione di sezione dell'impianto (non incubato con la sonda fluorescente).</li>
	<li>Misurare l'emissione di fluorescenza in genere sulla gamma 300-600 nm, mentre emozionante il campione in genere sulla gamma 250-550 nm.</li>
	<li>Traccia l'intensità della fluorescenza rispetto all'eccitazione e alle lunghezze d'onda di emissione per disegnare una mappa a fluorescenza 3D.</li>
	<li>Determinare l'area massima di eccitazione/emissione dal terreno.</li>
</ol>4. Misurazione spectrale di FRET
<ol><li>Calibrazione dell'autoorescenza<ol>
<li>Selezionare l'obiettivo 20x (NA: 0.8).</li>
		<li>Impostare l'eccitazione laser a due fotoni a 750 nm.</li>
		<li>Posizionare la sola sezione di paglia di frumento (WS) tra lo scivolo e il coperchio.</li>
		<li>Applicare i seguenti parametri nel software. Passare alla modalità lambda. Selezionare il rilevatore spettrale ChS con una risoluzione di 9,7 nm. Selezionare l'intervallo spettrale compreso tra 420 e 722 nm.</li>
		<li>Acquisire l'immagine.</li>
		<li>Determinare il picco di emissione del donatore (470 nm con questa configurazione).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Calibrazione dell'accettazione<ol>
<li>Posizionare le sonde fluorescenti a base di rodamina in una scatola di coltura con un fondo di vetro da 0,17 m.</li>
		<li>Acquisire l'immagine con la stessa impostazione.</li>
		<li>Determinare il picco di emissione dell'accettatore (570 nm con questa configurazione).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Determinare l'intervallo spettrale con il segnale massimo "WS da solo" e nessun segnale di accettazione come donatore solo emissione per le misurazioni sFLIM (460-490 nm con questa configurazione).</li>
	<li>Misurazione del campione<ol>
<li>Posizionare la sezione dell'impianto colorato tra il vetrino e il coperchio.</li>
		<li>Acquisire l'immagine con la stessa impostazione.</li>
		<li>Salvare il file lsm.</li>
		<li>Qualitativamente associare un forte evento FRET con una diminuzione del picco di emissione dei donatori rispetto al "campione WS da solo" e un aumento del picco di emissione dell'acceleratore rispetto al campione di rodoso.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. misurazioni sFLIM
NOTA: per la configurazione di sFLIM, il sistema utilizzato è un'impostazione sFLIM del dominio temporale come descritto in precedenza10. È possibile utilizzare un microscopio verticale e varie volte correlati a schede di conteggio di singoli fotoni e produttori di microscopi confocali e il protocollo deve essere adattato di conseguenza.
<ol><li>Impostare il sistema sulla modalità sFLIM.<ol>
<li>Impostare il microscopio confocale come descritto in 4.1.1 e 4.1.2.</li>
		<li>Passare alla modalità Non-Descanned nel software per inviare fotoni fluorescenti al rilevatore sFLIM.</li>
		<li>Impostare l'acquisizione di sFLIM sulla modalità Abilita per consentire il conteggio dei fotoni su SPC150.</li>
		<li>Selezionare 30 s time collection su SPC150.</li>
		<li>Verificare che il CFD sia compreso tra 1 x 105 e 1 x 106. AVVISO: Assicurarsi che il numero di fotoni misurato sulla scheda TCSPC sia sempre inferiore all'1% della frequenza di eccitazione laser (in questa configurazione, la frequenza di eccitazione laser è di 80 Mhz e la velocità di rilevamento non può superare gli 800 kHz in qualsiasi pixel per evitare un effetto pile up11).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Posizionare la sezione dell'impianto "WS alone" tra il vetrino e il coperchio.<ol>
<li>Impostare il software in modalità continua per consentire la scansione laser.</li>
		<li>Scegliere l'area di misurazione sul campione.</li>
		<li>Fare clic su Start su SPC150.</li>
		<li>Salvare il file sdt.</li>
		<li>Ripetere il processo per almeno 10 campioni per condizione.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Posizionare la sezione dell'impianto colorato tra il vetrino e il coperchio.<ol>
<li>Ripetere i passaggi 5.2.1 - 5.2.5.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Analisi sFLIM
<ol><li>Selezionare i dati sFLIM acquisiti file su "WS da solo" e importarli nel software SPCImage utilizzando File Importa.</li>
	<li>Selezionare i parametri di adattamento.<ol>
<li>Dall'opzione Modello, selezionare Multi-esponenziali incompleti: 12,5 ns.
</li>
		<li>Dall'opzione Preferences (Preferenze)selezionare Calcola risposta strumentale (Calculate Instrumental Response automatically).</li>
		<li>Dal menu a destra del pannello principale, selezionare il modello di adattamento esponenziale 2: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/59925/59925equ01.jpg">
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Per ogni canale, applicare il modello di raccordo e salvare i parametri di adattamento in un foglio di calcolo(1, a2, t1, t2).</li>
	<li>Per il confronto tra canali ed esperimenti, calcolare la durata media della fluorescenza in un foglio di calcolo (Tm): <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/59925/59925equ02.jpg">
</li>
	<li>Calcolare la durata media per tutti i campioni (almeno 10) in tutti i canali.<ol>
<li>Analizzare Tm sui canali dei donatori (dal canale 1 al 3: 460-490 nm) e determinare il canale dedicato (Canale 2 corrispondente a 467,5 - 480 nm) che mostra il numero di fotoni più alto e corrisponde all'emissione massima di lignina. I valori del canale 2 devono essere utilizzati nel passaggio 6.7.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Selezionare i dati sFLIM acquisiti file su WS colorato e importarli nel software SPCImage.<ol>
<li>Ripetere i passaggi da 6.1 a 6.4.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Calcolare l'efficienza FRET EFRET per il donatore nel precedente canale selezionato WS Alone (TmD) e dal campione di piante colorate (TmDA): <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/59925/59925equ03.jpg">
</li>
	<li>Confrontare i valori sFLIM ed EFRET tra WS e l'esempio.<ol>
<li>Si consideri un EFRET positivo associato a una riduzione omogenea della durata tra WS e il campione da analizzare come un evento FRET (vedere risultati rappresentativi e opere di Spriet et al.12 e Terryn et al.10 per i dettagli).</li>
		<li>Considerare una diminuzione della vita distribuita in modo diverso per essere dovuta a una combinazione di livello di compattazione FRET e lignina e non interpretare come interazioni molecolari.</li>
		<li>Considerare nessuna modifica a vita come assenza di segnale FRET misurabile, ma non come una mancanza di interazione con lignina</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

La correlazione della durata della fluorescenza e le misurazioni dello spettro di emissione consentono di combinare i vantaggi di entrambi i metodi. In effetti, le misurazioni spettrali da sole mancano di sensibilità e rimangono qualitative. D'altra parte, la durata della fluorescenza è il metodo di scelta per le tradizionali misurazioni quantitative freT, ma è stato dimostrato che lignina autofluorescenza potrebbe variare a seconda della composizione e dell'ambiente lignina16. Pertanto, le interazioni di lignina con un accettatore o le modifiche strutturali della lignina non possono essere discriminate in quanto entrambe comportano una diminuzione della vita. Come dimostrato, il metodo sviluppato fornisce una misurazione inequivocabile, sensibile e quantitativa delle interazioni tra molecole di lignina e accettatore nelle sezioni vegetali. Anche se le diverse fasi del metodo sono state rigorosamente ottimizzate, è necessario prestare particolare attenzione per i seguenti punti.
Per quanto riguarda i campioni, la qualità della sezione dell'impianto è fondamentale per garantire l'imaging a fuoco. I diversi passaggi per l'incorporamento peg devono essere rigorosamente seguiti. La fase finale di lavaggio è essenziale per evitare interferenze dal PEG rimanente nei campioni. Inoltre, la concentrazione del buffer e il pH devono essere mantenuti rigorosamente identici per tutte le misurazioni, poiché qualsiasi cambiamento può avere un forte impatto sulle proprietà di fluorescenza.
Anche la misurazione a vita può essere delicata. La durata della fluorescenza del donatore può essere instabile, ad esempio a causa di un'alta eccitazione. In tal caso, la messa a punto della potenza del laser e dello zoom può risolvere il problema. Un'altra fonte ben nota di artefatti nelle misurazioni TCSPC è il pile-up dell'impulso fotonico. Infatti, TCSPC non è in grado di misurare la velocità di due fotoni emessi tra gli stessi due impulsi laser. Mentre i campioni di piante sono altamente strutturati, la fluorescenza non è omogenea e può portare a un effetto di pileup nascosto. Mentre il numero di fotoni al secondo rimane al di sotto del limite di eccitazione dell'1%, può essere più alto in alcune aree campione. Per garantire nessun esperimento di pileup, è possibile considerare la misurazione della durata della fluorescenza del donatore con un flusso di fotoni diversi. Se la durata aumenta mentre il flusso diminuisce, un effetto pileup sta alterando le misure. Il flusso di fotoni ottimale viene raggiunto con la stabilità della vita del donatore.
Per quanto riguarda l'analisi della curva di decadimento sFLIM, si consiglia di basarsi su ogni singola curva adatta per garantire che il modello descriva accuratamente le misurazioni. In caso contrario, assicurarsi innanzitutto che nessuno degli artefatti menzionati in precedenza abbia danneggiato i dati. Quindi, il passaggio 2.1.4 fornisce la funzione di risposta strumentale (IRF) del sistema. Se IRF presenta alcune anomalie, ottimizzare il percorso ottico per ridurle al minimo. È inoltre possibile utilizzare un IRF misurato per l'adattamento durante la fase 6.2. Infine, i gradi di libertà del modello di adattamento possono essere aumentati a un decadimento a tre esponenziali nel passaggio 6.2. Tuttavia, il numero di fotoni necessari per la determinazione della vita individuale e della proporzione è elevato e si raccomanda quindi di utilizzarli solo per ottenere una durata media più stabile dal passaggio 6.4. Informazioni più esaustive su FLIM, la sua caratterizzazione18, sFLIM e la sua applicazione12 in particolare alla lignina10, possono essere trovate nella letteratura.
Sebbene impegnativa, la misurazione del FRET nei tessuti delle piante che utilizzano l'autofluorescenza nativa mostra alcuni vantaggi. Rispetto alle misurazioni FRET eseguite su tessuti viventi in cui gli studi di interazione tra biomolecole spesso richiedono ingegneria genetica per esprimere marcatori fluorescenti intrinseci, tessuti vegetali lignificati come quelli qui presentati, offrono l'autofluorescenza e le sonde fluorescenti del partner estrinseca possono essere facilmente aggiunte, risparmiando molto tempo. Tuttavia, a seconda delle specie vegetali analizzate e dei possibili pretrattamenti effettuati, è probabile che l'autofluorescenza venga modificata, in modo che debba essere caratterizzata con cura e il fluoroforo utilizzato come sonde potrebbe dover essere adattato.
Il metodo sFLIM deve essere applicato alle sonde fluorescenti prive di attività catalitica (PEG e dextran). Nel quadro dell'idrolisi di lignocellulosa vegetale, potrebbero essere eseguite interazioni di enzimi in vari campioni di biomassa, con conseguente determinazione dell'impatto della localizzazione (cellule e tessuti) sulla forza di interazione. Il successivo passaggio di ottimizzazione sarà l'automazione del passaggio di analisi. Infatti, con abbastanza dati analizzati, potrebbe essere implementata una procedura di analisi basata sull'apprendimento automatico per l'analisi automatizzata del fenotipo, che aumenterebbe la sua amenabilità per un rapido screening dell'efficienza enzimatica-biomassa. Inoltre, sFLIM non richiede la fissazione del campione e può essere facilmente applicato agli studi dinamici di interazione enzimatica-lignina. Un metodo così unico probabilmente guiderà la strategia di ingegneria degli enzimi e il pretrattamento della biomassa per ottimizzare la valorizzazione della lignocellulosa.

Lignocellulosa idrolgona in zuccheri monomerici come il glucosio richiede enzimi. La loro attività è nota per essere contenuta nella creazione di interazioni non specifiche tra enzimi e lignina1,2, quest'ultima è un polimero idrofobico e un importante costituente della lignocellulosa3. Pertanto, misurare quantitativamente tali interazioni direttamente su scala cellulare è una sfida che deve essere affrontata per ottimizzare l'attività catalitica enzimatica e il pretrattamento della lignocellulosa4.
La misurazione del trasferimento di energia di risonanza (FRET) di Fàrster (o fluorescenza) è un metodo di scelta per valutare l'interazione delle biomolecole in situ. Questo trasferimento di energia non radiativa può verificarsi tra un donatore e un fluoroforo accettatore se soddisfano condizioni diverse. Lo spettro di emissione del donatore deve sovrapporsi, almeno in parte, allo spettro di eccitazione degli accettanti. La scelta dei fluorofori è quindi cruciale per tali esperimenti. Quindi, l'efficienza di trasferimento diminuisce con la sesta potenza della loro distanza5 e si verifica solo se entrambe le molecole sono nelle immediate vicinanze (tipicamente nella gamma nanometrica). Altre contingenze possono alterare l'efficienza di trasferimento, come l'orientamento del dipolo-dipolo, ma sono attenuate se i fluorofori hanno flessibilità.
FRET può essere misurato con diverse tecniche e descrizioni dettagliate possono essere trovate nella letteratura6,7. In breve, i metodi principali si basano su: i) emissioni sensibilizzate in cui viene seguita la variazione della fluorescenza delle emissioni accettanti e fornisce risultati principalmente qualitativi; ii) il fotosbiancamento dell'accettatore in cui la fluorescenza delle emissioni del donatore viene misurata prima e dopo il fotosbleaching dell'accettazione (in questo caso, è possibile ottenere stime FRET più precise, ma richiedono una forte potenza laser applicata a campioni fissi); e iii) misurazione della durata che diminuisce per il donatore in presenza dell'accettatore. Questo metodo richiede strumenti specifici e consente misurazioni di interazione precise e sensibili tra fluorofori. Considerando la misura FRET tra sonde fluorescenti e lignocellulosa, la difficoltà principale è che la lignocellulosa non è un singolo fluoroforo nativo e spettrale, proveniente principalmente dalla lignina e dipendente dalla biomassa8,9.
In questo documento, proponiamo una procedura nuova e originale adattata a sezioni di campioni di legno / piante. Questo metodo basato su sFLIM apre la strada alle misurazioni quantitative di FRET tra sonde fluorescenti e lignina in campioni nativi di lignocellululosa.

<table><tbody><tr><td>Microscopio confocale</td><td>ZEISS</td><td>LSM 710 NLO</td><td>per imaging confocale</td></tr><tr><td>a spazzola</td><td></td><td></td><td>fine per raccogliere sezioni</td></tr><tr><td>fiale</td><td></td><td></td> di vetro <td>per incubazioni</td></tr> vetri <tr><td>coprimicroscopio ad alta precisione 170+/-5&5&; m n&deg; 1,5#</td><td>Marienfeld</td><td>0107032</td><td>venduto da Dutscher s.a in Francia</td></tr><tr><td>Laser pulsato a infrarossi</td><td>VISIONE</td><td>CAMALEONTICA</td> COERENTE <td>Per l'eccitazione del campione</td></tr><tr><td>Micropipetta Research Plus monocanale 20-200&micro; L</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>con punte corrispondenti</td></tr><tr><td>Micropipette Research Plus monocanale 2-20&micro; L</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>con punte corrispondenti</td></tr><tr><td>Vetrini per microscopio circa 76 x 26 mm bordi rettificati estremità smerigliata</td> Lame per microtomo <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>LR45D</td><td></td></tr><tr><td>monouso (confezione da 50)</td><td>Agar Scientific</td><td>T5024</td><td>venduto da Oxford Instruments in Francia</td></tr><tr><td>mPEG-Rhodamine, 10 kDa</td><td>Creative Peg Works</td><td>PSB-2263</td><td></td></tr><tr><td>mPEG-Rhodamine, 20 kDa</td><td>Creative Peg Works</td><td>PSB-22642</td><td></td></tr><tr><td>mPEG-Rhodamine, 5 kDa</td><td>Creative Peg Works</td><td>PSB-2264</td><td></td></tr><tr>smalto per<td>unghie</td><td></td><td></td><td>per il montaggio</td></tr><tr><td>del pHmetro cinque easy plus</td><td>Mettler toledo</td><td>FEP20</td><td>con elettrodo</td></tr><tr><td>poli (glicole etilenico) mol medio wt 1450</td><td>Merck (sigma-Aldrich)</td><td>P5402-1kg</td><td>per l'inclusione</td></tr> <tr><td>del campionelame di rasoio, lame a un taglio, acciaio inox, scatola da 100</td><td>Agar Scientific</td><td>T586</td><td>per la preparazione di frammenti saled by Oxford Instruments in Francia</td></tr><tr><td>microtomo rotativo</td><td>Microm Microtech</td><td>HM 360</td><td></td></tr><tr><td>sFLim detector</td><td>BECKER-HICKL</td><td>SPC 150</td><td>per l'acquisizione a vita</td></tr><tr><td>di sodio diidrogeno fosfato diidrato NaH2PO4, 2H2O</td><td>Merck (sigma-Aldrich)</td><td>71500</td><td>per soluzione tampone</td></tr><tr><td>sodio fosfato bibasico diidrato Na2HPO4,2H2O</td><td>Merck (sigma-Aldrich)</td><td>30435-1kg</td><td>per soluzione tampone, vecchio riferimento, il nuovo è 71643-1kg</td></tr><tr><td>tetrametil rodamina isotiocianato-destrano 10 k Da</td><td>Merck (sigma-Aldrich)</td><td>R8881-100mg</td><td></td></tr></tbody></table>

misurazione delle interazioni tra sonde fluorescenti e lignina nelle sezioni delle piante mediante sflim in base all'autofluorescenza nativa

Measuring Interactions between Fluorescent Probes and Lignin in Plant Sections by sFLIM Based on Native Autofluorescence

Nella biomassa lignocellulosica (LB), l'attività degli enzimi è limitata dalla comparsa di interazioni non specifiche con la lignina durante il processo di idrolisi, che mantiene gli enzimi lontani dal loro substrato. La caratterizzazione di queste interazioni complesse è quindi una sfida in substrati complessi come LB. Il metodo qui misura le interazioni molecolari tra molecole con marcafluno e lignina autofluorescente nativa, che sarà rivelata dal trasferimento di energia di risonanza del Fàrster (FRET). Contrariamente alle misurazioni FRET nelle cellule viventi che utilizzano due fluorofori esogeni, le misurazioni FRET nelle piante che utilizzano la lignina non sono banali a causa della sua complessa autofluorescenza. Abbiamo sviluppato una pipeline di acquisizione e analisi originale con l'osservazione correlata di due proprietà complementari della fluorescenza: l'emissione di fluorescenza e la durata. sFLIM (microscopia di imaging a vita spettrale e fluorescente) fornisce la quantificazione di queste interazioni con alta sensibilità, rivelando diversi livelli di interazione tra biomolecole e lignina.

Per dimostrare la capacità sFLIM di sezionare le interazioni molecolari tra lignina e molecole fluorescenti, abbiamo usato per la prima volta tre diversi campioni (Figura 3): paglia di grano nativo (WS), paglia di grano nativo incubata con PEGed con rhodamina (PR10) e grano di paglia autoctono con etichettatura dextrana con rhodamina (DR10). PR10 è noto per interagire con la lignina, mentre DR10 dovrebbe essere inerte13,14,15. Le curve sFLIM (Figura 3, superiore) mostrano alcune modifiche che possono essere ottenute tra il campione di riferimento (WS) e due casi di interazione (DR10 e PR10). In effetti, si può prima notare facilmente l'aumento della fluorescenza nelle regioni spettrali corrispondente alla gamma di emissione della rodamina. Un'attenta osservazione delle tre prime curve di decadimento dei fotoni del canale rivela anche un'inflessione più forte per la DR10 rispetto a PR10. Dopo aver montato le curve di decadimento dei fotoni e aver calcolato ogni canale significa vita a fluorescenza, la firma FRET diventa più evidente (Figura 3, fondo). Infatti, mentre la durata della fluorescenza aumenta e diminuisce alternativamente lungo lo spettro della fluorescenza per il campione WS, viene osservata una chiara firma FRET sia per PR10 che per DR10 con: 1) un valore costante di durata nel canale di emissione solo donatore (3 primi canali, in blu); e 2) una crescente durata della fluorescenza nel canale spettrale corrispondente ad un crescente contributo del fluoroforo del donatore ad alta vita.
Una volta determinato un FRET inequivocabile, il confronto della durata della fluorescenza della lignina (canale 2) consente la quantificazione della diminuzione della durata tra WS (0,47 ns), DR10 (0,42 ns) e PR10 (0,36 ns) e, quindi, rivela interazioni molecolari tra ws (0,47 ns), DR10 (0,42 ns) e PR10 (0,36 ns) e quindi rivela interazioni molecolari tra lignina e PR10 (0,36 ns) e quindi rivela interazioni molecolari tra lignina e PR10 e DR10 con una maggiore affinità per PR10.
Per illustrare la rilevanza di questo metodo per quantificare diversi livelli di interazione, scegliamo altri tre campioni, imitando l'accessibilità degli enzimi su campioni vegetali trattati: WS trattato con acido (AWS), in combinazione con PR di due pesi molecolari con contrasto di 5 kDa e 20 kDa (PR5 e PR20). Dopo un'attenta ispezione delle firme sFLIM, viene estratta la durata della fluorescenza della lignina(Figura 4). Come detto in precedenza, la durata della fluorescenza della lignina può essere alterata dal suo ambiente16,17. Dopo il trattamento con l'acido, le misure di durata della fluorescenza in AWS (0,28 ns) diventano inferiori a quelle misurate in precedenza per WS (0,47 ns), il che conferma il requisito della procedura sFLIM per un'interpretazione inequivocabile della riduzione a vita e la necessità di controlli negativi per ogni condizione testata. Come previsto, si osserva una forte riduzione della durata quando si aggiunge PR ad AWS mentre interagisce con la lignina. Inoltre, l'interazione è più forte con PR5 (0,14 ns) rispetto a PR20 (0,16 ns), che è coerente con la misurazione del raggio idrodinamico (2,3 nm e 4,8 nm per PR5 e PR20, inducono diversi vincoli sterici e quindi una maggiore accessibilità della PR5 alla lignina.
Entrambi gli esperimenti dimostrano la rilevanza di questo metodo per valutare finemente le interazioni della lignina con gli enzimi, a seconda delle loro dimensioni e dei campioni vegetali pre-trattamento.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59925/59925fig01.jpg"> Figura 1: Diverse fasi di preparazione dei campioni. La paglia di frumento (WS) (A) viene prima ridotta di dimensioni (B) da incorporare nel supporto PEG (C). Il blocco viene tagliato utilizzando un microtoma dotato di lame usa e getta (D). Dopo il lavaggio, le sezioni risultanti (E) vengono posizionate per l'incubazione nella soluzione PEG o dextran tagged-rhodamine (F). Le sezioni etichettate sono montate per le misurazioni sFLIM (G). Le barre di scala sono 2 cm (A), 1 cm (B e C), 200 m (E e G). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59925/59925fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59925/59925fig02.jpg"> Figura 2: flusso di lavoro completo delle interazioni spettrali basate su FRET. La figura presenta l'impostazione che combina l'intensità della fluorescenza spettrale e le misurazioni della durata. Le immagini a fluorescenza spettrale vengono acquisite con un microscopio confocale e le durate a fluorescenza sequenziale per ogni intervallo spettrale vengono misurate con il rivelatore sFLIM. L'analisi delle curve di decadimento dei fotoni consente una determinazione accurata delle interazioni tra il campione e le molecole di interesse. Le tarature devono essere elaborate per evitare artefatti. In primo luogo, il rivelatore sFLIM deve essere calibrato in modo spettrale e la sua funzione di risposta strumentale deve essere controllata. In secondo luogo, il segnale di autofluorescenza complesso deve essere calibrato con precisione per ogni campione per determinare la durata della fluorescenza in ogni canale prima dell'aggiunta di una molecola accettante. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59925/59925fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59925/59925fig03.jpg"> Figura 3: Misurazioni sFLIM rappresentative. Le curve sFLIM (pannello superiore) sono state acquisite su paglia di grano nativo (WS), WS incubato con PEG etichettato con rhodamina (WS-PEG) e paglia di grano autoctona con dextran etichettato con rhodamina (WS-DEX). Per ogni campione, le curve sFLIM sono state dotate di un modello di decadimento biesponenziale e la durata media della fluorescenza è stata calcolata per ogni canale (pannello inferiore). I campioni di WS-PEG e WS-DEX presentano una diminuzione della durata della fluorescenza nel canale corrispondente all'autofluorescenza (tre prime barre) associata a un aumento di vita del canale corrispondente a un'emissione mista di autofluorescenza e rhodamina. Questo comportamento è caratteristico di un evento FRET tra molecole con etichettatura lignina e molecola con tag rhodamine. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59925/59925fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59925/59925fig04.jpg"> Figura 4: Analisi della durata della fluorescenza del canale corrispondente all'autofluorescenza della lignina. Dopo la convalida di un evento FRET basato sulla firma sFLIM, la durata media della fluorescenza è stata misurata su WS (AWS) trattato con acido, in combinazione con PR5 o PR20 (rispettivamente 5 kDa e 20 kDa). Mentre entrambi i campioni di PR presentano una diminuzione della vita, il più piccolo è caratterizzato da una riduzione più forte della vita, rivelando una più forte interazione molecolare con la lignina. Il metodo è quindi sufficientemente sensibile da discriminare tra entrambi (sono rappresentati il valore medio e l'errore standard, n&gt;10 per condizione). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59925/59925fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Questo protocollo descrive un setup originale che combina misurazioni spettrali e di durata di fluorescenza per valutare il trasferimento di energia di risonanza di F 'rster (FRET) tra sonde fluorescenti a base di rhodamina e polimero di lignina direttamente nelle sezioni di spessore dell'impianto.

Misurazione delle interazioni tra sonde fluorescenti e lignina nelle sezioni delle piante mediante sFLIM in base all'autofluorescenza nativa

In lignocellulosic biomass (LB), the activity of enzymes is limited by the appearance of non-specific interactions with lignin during the hydrolysis ...

Nella biomassa lignocellulosica l'attività degli enzimi che analizzano i polisaccaridi è limitata dall'esistenza di interazioni non specifiche con la lignina. L'analisi FRET è un approccio rilevante per l'evoluzione su scala nanometrica. Ottenere tutte le sezioni dopo può essere una sfida a seconda della biomassa.Prenditi il tuo tempo facendo il sessatura con il microtomo ed esegui lavaggi delicati. La raccolta delle misurazioni fluorescenti della durata e dello spettro consente una determinazione quantitativa sensibile e inequivocabile del FRET tra molecole di lignina e TAG in situ. Questo metodo utilizza l'uso di tecniche difficili, come il sezionamento di campioni sull'acquisizione e l'analisi di microscopie multidimensionali che possono essere facili da imparare con una dimostrazione visiva.Per preparare campioni vegetali da legno, grano, fibre o frammenti utilizzare lamette da barba per tagliare campioni lunghi un centimetro senza danneggiare la struttura del materiale e posizionare i campioni sotto vuoto per rimuovere qualsiasi aria. Immergere i campioni per 24 ore in concentrazioni successive del 30% e del 50% di PEG diluito in acqua a temperatura ambiente con agitazione delicata. Seguito da 24 ore immerso in una concentrazione del 100% di PEG a 70 gradi Celsius.Dopo l'immersione PEG al 100%, posizionare i campioni in capsule su una piastra calda di 70 gradi celsius e diminuire progressivamente la temperatura della piastra in cinque gradi celsius fino a quando la piastra raggiunge la temperatura ambiente. Una volta raffreddati i campioni, utilizzare un microtomo e lame monouso per ottenere con cura sezioni piatte spesse da 30 a 60 micrometri da ciascun blocco PEG. Rimuovere il PEG dalle sezioni con tre lavaggi d'acqua delicati di cinque minuti.Dopo l'ultimo lavaggio, incubare fino a tre sezioni per tubo con 500 microlitri di sonda fluorescente preparata al momento per 72 ore protetti dalla luce. Al termine dell'incubazione di colorazione, utilizzare un pennello per trasferire le sezioni su uno scivolo prima di montare le sezioni tra uno scivolo di vetro e uno scivolo di copertura numero 1.5H. Per determinare la larghezza della finestra spettrale del rivelatore sFLIM, posizionare i cristalli di urea in una scatola di coltura con un fondo di vetro da 0,17 micrometri e posizionare la scatola su un portacampioni al microscopio.Seleziona l'obiettivo 20X e un laser a zaffiro drogato in titanio con una lunghezza d'onda di 900 nanometri e una potenza del 2% e accendi la scansione. Per eseguire misurazioni sFLIM, passare alla modalità sFLIM. Per raccogliere il secondo segnale armonico sul rivelatore sFLIM, regolare gradualmente la lunghezza d'onda dell'eccitazione laser da 900 a 980 nanometri fino a quando il secondo segnale armonico non viene raccolto nel secondo canale spettrale.Quindi determinare la lunghezza della finestra spettrale. Passare alla modalità digitalizzata non D per inviare fotoni fluorescenti al rilevatore SFLIM. Impostare l'acquisizione sFLIM sulla modalità abilita per consentire il conteggio dei fotoni sul contatore del singolo fotone.Quando lo strumento è pronto, posizionare una sola sezione vegetale di paglia di grano nativa di controllo tra lo scivolo e lo scivolo di copertura sullo stadio del microscopio e impostare il sistema sulla modalità continua per consentire la scansione laser. Impostare una raccolta di 30 secondi e verificare che il discriminatore di frazione costante sia compreso tra uno per 10 e il quarto e uno per 10 al sesto. Quindi selezionare l'area di misurazione nel campione e fare clic su Avvia.Al termine della misurazione, salvare il file sdt e ripetere la misurazione per almeno altri nove campioni. Occorre trovare un equilibrio tra il raggiungimento di un numero sufficiente di fotoni raccolti per il fotone evitando l'acquisto di impulsi e gli effetti indotti dalla foto che possono alterare la durata della florescence. In alto analizzare i dati sFLIM acquisiti, importare i soli file di dati di paglia di grano nativo nel software del contatore di fotoni singolo e aprire Opzione e modalità per selezionare Multi Exponential 12,5 nanosecondi incompleto.In Opzioni e preferenze selezionare Calcola automaticamente risposta strumentale e selezionare il modello adattamento esponenziale. Per ogni canale, applicate il modello di raccordo e salvate i parametri di adattamento in un foglio di calcolo. Per un confronto tra i canali e gli esperimenti calcolare la durata della fluorescenza principale in un foglio di calcolo.Per calcolare la durata media per almeno 10 campioni in tutti i canali, analizzare la durata fluorescente principale sui canali donatori per determinare il valore del canale dedicato che ha scelto il numero di fotone più alto e corrisponde all'emissione massima di lignina. Per confrontare i valori sFLIM ed EFRET tra il campione di paglia di grano autoctono di controllo e un campione sperimentale, considerare un EFRET positivo associato a una diminuzione omogenea della durata tra il controllo e i campioni sperimentali da analizzare come evento FRET. In questo esperimento rappresentativo, le curve sFLIM mostrano alcune delle modifiche che possono essere ottenute tra il campione di riferimento e i due casi di interazione.In effetti, l'aumento della fluorescenza nelle regioni spettrali corrispondente all'intervallo di emissione di rodiammina è facilmente visualizzabile. Un'attenta osservazione delle tre curve di decadimento del fotone del primo canale, rivela anche una più forte flessione per la paglia di grano autoctono con destrina taggata con Rhodamine, che per la paglia di grano autoctona incubata con PEG taggato con Rhodamine. Dopo aver sistemato le curve di decadimento del fotone e aver calcolato la durata della fluorescenza principale di ogni canale, la firma FRET diventa più ovvia.Ad esempio, mentre il tempo di vita della fluorescenza aumenta e diminuisce alternativamente lungo lo spettro di fluorescenza per il campione di paglia di grano nativo, si osserva una chiara firma FRET sia per le sezioni di paglia di grano autoctone incubate con PEG taggato con rhodamina e paglia di grano autoctono con destrina taggata con campioni di rodiammina. Nel contesto dell'idrolisi della biomassa lignocellulosica, questo metodo può essere facilmente trasferito a studi di interazione enzimatica in vari campioni di biomassa che richiedono una caratterizzazione rigorosa di ogni nuova biomassa. Poiché lo sFLIM non richiede la fissazione del campione, apre la strada a studi dinamici sull'interazione enzimatica lignina ed è probabile che guidi strategie di ingegneria enzimatica e pre-trattamenti della biomassa.Come la maggior parte del tempo, le misurazioni del tempo di vita richiedono l'uso di sorgenti laser a infrarossi a impulsi. Le precauzioni di sicurezza appropriate devono essere prese di conseguenza.

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