Misurazione della proliferazione delle cellule muscolari lustiche vascolari utilizzando la chimica dei clic

La proliferazione è un'importante misura della funzione cellulare. Questo protocollo consente agli investigatori di sviluppare un saggio di proliferazione sensibile nei loro laboratori senza l'alto costo dei kit disponibili in commercio. Il vantaggio principale di questa tecnica è che evita un duro trattamento delle cellule e / o l'uso di radioattività.

A dimostrare questa tecnica sarà Vicky Wong, la manager del mio laboratorio. Per testare la proliferazione, rimuovere le cellule muscolari lisce vascolari da un pallone con mezzi cellulari muscolari lisci nel siero e nella piastra bovina fetale al 2% a 20.000 cellule per millilitro in DMEM in una piastra da 96 pozzetti. Far crescere le cellule a 37 gradi Celsius durante la notte.

Aggiungere 30 nanogrammi per fattore di crescita derivato dalla piastrine millilitro a tre o sei pozzi come controllo positivo per stimolare la proliferazione. Aggiungere quindi PBS allo stesso numero di pozzi di un controllo negativo. Incubare per 72 ore.

Diluire in precedenza cinque scorte di EdU millimolare a un millimolare e aggiungere due microlitri a ciascun pozzo per le ultime 24 ore del periodo di coltura di 72 ore. Mantenere un set di repliche senza EdU per determinare la fluorescenza e la luminescenza in background. Ventiquattro ore dopo, fissare le cellule rimuovendo il supporto, quindi aggiungendo 150 microlitri per pozzo del 4% di paraformaldeide e incubare 10 minuti a temperatura ambiente.

Rimuovere la paraformaldeide e aggiungere 150 microlitri di 1%TX-100 in acqua per pozzo e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti. Lavare tre volte con PBS per rimuovere il TX-100. Per rilevare l'EdU incorporato usando la fluorescenza, fare 10 millilitri di soluzione di etichettatura per piastra da 96 pozzetti appena prima dell'uso aggiungendo reagenti da soluzioni stock nell'ordine giusto:20 microlitri THPTA, 20 microlitri solfato di rame, cinque microlitri fluoresceina picolil-azide e 100 microlitri ascorbate di sodio in PBS per un volume totale di 10 millilitri.

Il passaggio più critico è quello di creare la soluzione di etichettatura appena prima dell'uso. Rimuovere il PBS dai pozzi, aggiungere 150 microlitri di soluzione di etichettatura a ciascun pozzo e incubare 30 minuti a 37 gradi Celsius. Per rilevare tutti i nuclei, aggiungere DAPI a ogni pozzo e immagine su un microscopio fluorescente o un lettore di lastre di imaging.

Per evitare il conteggio manuale e quando un lettore di lastre di imaging non è disponibile, questo protocollo può essere modificato in una lettura a luminescenza utilizzando azide HRP e un substrato ELISA. Per rilevare EdU utilizzando la luminescenza, preparare prima la salina tris-buffered con lo 0,1% di polisorbato 20. Quindi aggiungere 150 microlitri di tampone di blocco ad ogni pozzo e incubare per 90 minuti a temperatura ambiente.

Dopo aver rimosso il buffer di blocco, lavare le cellule tre volte con 200 microlitri di PBS. Per rilevare l'EdU incorporato, preparare prima 10 millilitri di soluzione di etichettatura per piastra da 96 porcili aggiungendo reagenti da soluzioni stock nell'ordine giusto. In primo luogo, 20 microlitri THPTA, poi 20 microlitri solfato di rame, cinque microlitri biotina picolil-azide, 100 microlitri ascorbato di sodio in PBS per un volume totale di 10 millilitri.

Lavare i pozzi cinque volte tre minuti con 200 microlitri di TBST con scuotimento. Perossidasi endogene quench con 150 microlitri di perossido di idrogeno allo 0,3% per 20 minuti a temperatura ambiente. Dopo aver rimosso il perossido di idrogeno, lavare cinque volte tre minuti con 200 microlitri di TBST con scuotimento.

Aggiungere 50 microlitri di perossidasi di streptavidina-rafano diluita in TBST ad ogni pozzo e incubare a temperatura ambiente per un'ora. Lavare cinque volte tre minuti con 200 microlitri di TBST con scuotimento. Aggiungere 50 microlitri di substrato ELISA chemiluminescente ad ogni pozzo e leggere immediatamente in un lettore di lastre in grado di rilevare la luminescenza.

Sebbene i nuclei fluorescenti possano essere rilevati da un lettore standard di piastre a fluorescenza, utilizzando il protocollo di luminescenza, la scansione fluorescente viene convertita in una lettura liquida omogenea rilevata con perossidasi streptavidina-rafano e un substrato ELISA standard. Il vantaggio di questo metodo rispetto a una lettura fluorescente è una lettura più omogenea e la piastra può essere letta in pochi secondi come si vede qui quando è stata misurata la proliferazione di VSMC in risposta al PDGF. Lo svantaggio è che lo sfondo è più alto che con la fluorescenza, quindi i controlli negativi tendono ad essere più alti.

Nel tentativo di ridurre la variabilità, i risultati sono stati normalizzati al conteggio iniziale delle celle. Tuttavia, in un insieme separato di esperimenti, è stato dimostrato che questo metodo non è abbastanza sensibile da rilevare piccole differenze nel numero di celle. Il modo più efficiente e accurato per contare le cellule positive e totali dell'EdU è utilizzare un lettore di lastre di imaging.

Se questo tipo di lettore di lastre non è disponibile, il conteggio manuale produrrà anche risultati accurati. Quando si confrontano questi due metodi, il conteggio manuale positivo dell'EDU era identico al conteggio automatizzato, così come il conteggio totale non stimolato. Il vantaggio di questi due metodi è la visibilità delle cellule da contare, una migliore precisione e che la colorazione non specifica dei detriti può essere vista ed evitata.

Lo svantaggio principale con il metodo di conteggio manuale è il tempo. Ricordarsi di rendere fresca la soluzione di etichettatura appena prima dell'uso e aggiungere gli ingredienti nell'ordine fornito nel protocollo scritto. Se l'intensità della colorazione è fioca, provare a regolare il rapporto chelatore/rame.

Ricorda che la paraformaldeide è tossica. Dovrebbe essere usato in un cappuccio dei fumi mentre si indossano i guanti. La procedura in sé non è difficile, ma potrebbe dover essere ottimizzata regolando i rapporti chelatore/rame nella soluzione di etichettatura.

Inoltre, i tempi di incubazione e la durata del trattamento EdU possono essere regolati a seconda del tipo di cellula e della domanda specifica posta. Questa tecnica è compatibile con la superficie cellulare e la colorazione intracellulare in modo da poter determinare le caratteristiche delle cellule divisorie e non divisorie. Sebbene comunemente usato per misurare la proliferazione, la chimica dei clic può anche essere utilizzata per l'etichettatura metabolica di RNA, proteine, acidi grassi e carboidrati.

Se il bersaglio metabolico di interesse è sulla superficie cellulare, le cellule vive possono essere etichettate.