Agarose cross-linked attivata per lo sviluppo rapido delle resine di maromtagrafia di affinità - Cattura anticorpale come caso di studio

Gli anticorpi monoclonali dominano il mercato biofarmaceutico e sono tipicamente purificati dalla cromatografia proteina A. La resina secondo è un importante fattore di costo durante la produzione che influisce sul prezzo delle terapie a base di anticorpi. Qui descriviamo un nuovo ligando di affinità basato sulla proteina fluorescente che viene letto come vettore per l'epitopo lineare dell'anticorpo neutralizzante dell'HIV 2F5.

In generale il nostro metodo consente la rapida generazione di resine cromatografiche di affinità che possono essere utilizzate per la cattura di anticorpi monoclonali. Abbiamo dimostrato questa capacità catturando anticorpi 2F5 da estratto di piante grezze. Abbiamo ottimizzato le condizioni di acquisizione e il buffer della soluzione al fine di migliorare la capacità di legame dinamico e la riutilizzabilità della resina.

La nostra resina consente condizioni generalmente più allentate rispetto alla proteina A e ha il potenziale per ridurre i costi di purificazione degli anticorpi monoclonali. Inoltre, la resina può essere facilmente adattata ad altri anticorpi che si legano agli epitopi lineari. Per iniziare questa procedura, regolare la concentrazione della soluzione di ligando di affinità preparata in modo che sia nell'intervallo da 5 a 15 grammi per litro come definito dalla progettazione di esperimenti.

Conservare la soluzione sul ghiaccio fino a quando la reazione di accoppiamento non è pronta. Quindi, riempire una siringa da due millilitri con la soluzione DFE. E preparare un adattatore per montare le siringhe su colonne di agarosio a collegamento incrociato attivate dal SSN con un volume del letto di un millilitro.

Per ogni 10 colonne utilizzate per l'accoppiamento, preparare 30 millilitri di soluzione di disattivazione, 30 millilitri di soluzione a basso pH e un millilitro di soluzione di stoccaggio. Quindi preparare 20 millilitri di un acido cloridrico millimolare in un tubo. E incubarlo sul ghiaccio per almeno 20 minuti.

Preparare una scala di precisione per monitorare il flusso attraverso le frazioni per tutti i passaggi durante la reazione di accoppiamento. Successivamente, aprire una colonna di agarosio retitica sigillata attivata dal SSN. Applicare una goccia di buffer sull'ingresso dell'adattatore, per evitare che l'aria entri nella colonna.

Montare l'adattatore per siringhe all'ingresso della colonna. Lavare la colonna con sei millilitri di ghiaccio freddo un millimolare acido cloridrico, ad una portata inferiore a quella di un millilitro al minuto. Utilizzando una siringa a due millilitri, iniettare immediatamente 1,5 millilitri di soluzione DFE a una portata inferiore a un millilitro al minuto.

E raccogliere il flusso attraverso la frazione su una scala di precisione per l'analisi successiva. Sigillare la colonna ad entrambe le estremità e incubare per 15-45 minuti, a 22 gradi Celsius. Successivamente iniettare sei millilitri della soluzione di attivazione, seguiti da sei millilitri di soluzione a basso pH, a una portata inferiore a un millilitro al minuto, rimuovere i ligandi non legati in modo covalente dalla resina.

Iniettare sei millilitri della soluzione di attivazione e incubare la colonna per 15 minuti. Successivamente, iniettare sei millilitri di soluzione a basso pH nella colonna. Seguito da sei millilitri della soluzione di attivazione.

Quindi iniettare altri sei millilitri di soluzione a basso pH nella colonna. Iniettare due millilitri di soluzione di archiviazione nella colonna e conservarla a quattro gradi Celsius. Preparare innanzitutto 100 millilitri dell'estratto vegetale chiarificato contenente 2F5 o del supernatante per il sistema di espressione a base cellulare preferito, che contiene anche 2F5.

Preparare quindi il buffer di equilibrazione e il buffer illusione ad alta resistenza X di ferro, come delineato nel protocollo di testo. Sciacquare il sistema cromatografico con i buffer. Montare una colonna di affinità DFE sul sistema cromatografico.

E equilibrare con cinque CV di buffer di equilibrazione, ad una portata di un millilitro al minuto. Monitorare l'assorbanza UV a 280 nanometri. Quindi caricare 80 millilitri dell'estratto vegetale chiarificato o del supernatante sulla colonna con una portata di 5 millilitri al minuto.

Per garantire un tempo di contatto di due minuti. Raccogli il flusso attraverso i campioni in due frazioni milliliter o ricostruzione della curva di svolta. Conservare il flusso attraverso i campioni a quattro gradi Celsius, se non è possibile un'analisi immediata del campione.

Dopo questo lavare la colonna con 6CV di tampone di equilibrazione. Raccogliere un campione all'inizio, al centro e alla fine del lavaggio. Diluire il MAB2F5 con cinque volumi di buffer illusione ad alta resistenza ionica.

Raccogliere la frazione DFE quando il segnale UV a 280 nanometri è aumentato a cinque unità di assorbanza al di sopra della linea di base. Ottimizzare il buffer illusione per ogni coppia epitopo-anticorpo, come delineato nel protocollo di testo. La proteina di fusione DFE è espressa in piante di tabacco transgeniche, coltivate in serra.

Il recupero complessivo del DFE è di 23,5 milligrammi per chilogrammo. Con una purezza superiore al 90%La quantità assoluta di DFE immobilizzata sulla resina aumenta con la massa di DFE iniettata nella colonna e si altipiani a circa 15 grammi per litro, mentre la resa di accoppiamento diminuisce continuamente man mano che viene iniettato più DFE. Si vede che le molecole di DFE mantengono la loro florescenza rossa, anche dopo l'accoppiamento.

L'intensità del colore corrisponde alla quantità totale di DFE immobilizzato. Pertanto, il colore delle colonne può essere utilizzato come semplice parametro di controllo qualità per stimare l'efficienza dell'accoppiamento e la qualità delle colonne. L'anticorpo ricombinante 2F5 è prodotto transitoriamente nelle piante di Nicotiana benthamiana coltivate in un fitotrone.

La cattura di 2F5 dall'estratto vegetale grezzo, viene testata utilizzando colonne di affinità, accoppiate con circa sette milligrammi di DFE purificato. Una concentrazione di cloruro di magnesio di 1,25 molare è sufficiente per eluire 2F5 dalla resina di affinità DFE con un recupero vicino al 100% e una purezza di circa il 97%, paragonabile alle resine proteiche A. Il DBC della resina di affinità DFE con una svolta del 10%2F5, diminuisce linearmente nel corso dei 25 cicli, a circa il 15% del valore iniziale.

Abbiamo utilizzato un approccio di progettazione di esperimenti per ottimizzare la capacità di accoppiamento del nostro ligando di affinità. Queste condizioni possono essere perfezionate per altri ligandi in futuro. Il nostro metodo utilizza proteine florescenti per infilare una proteina sub portante per il ligando specifico del prodotto.

Allo stesso tempo basta aggiungere funzioni come indicatore di qualità visiva della procedura di mobilitazione, fornendo un feedback immediato e intuitivo all'operatore.