Name: Metodi di ricerca sui cloroplasti: indagine sul targeting, localizzazione e interazioni delle proteine dei cloroplasti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-15T14:30:00.000+00:00
Duration: 2 min 45 s
Description: Esplora metodi di importazione e localizzazione delle proteine nei cloroplasti di Arabidopsis thaliana. Queste tecniche in vitro e in vivo aiutano a studiare la biogenesi dei cloroplasti e le interazioni proteiche.

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<ol><li>Jarvis, P., López-Juez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenesis+and+homeostasis+of+chloroplasts+and+other+plastids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Biogenesis and homeostasis of chloroplasts and other plastids.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (12), 787-802 (2013).</li>
<li>Ling, Q., Jarvis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+protein+import+into+chloroplasts+isolated+from+stressed+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Analysis of protein import into chloroplasts isolated from stressed plants.</a> Journal of Visualized Experiments. (117), (2016).</li>
<li>Aronsson, H., Jarvis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+isolating+import-competent+Arabidopsis+chloroplasts%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">A simple method for isolating import-competent Arabidopsis chloroplasts.</a> FEBS Letters. 529 (2-3), 215-220 (2002).</li>
<li>Fitzpatrick, L. M., Keegstra, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+isolating+a+high+yield+of+Arabidopsis+chloroplasts+capable+of+efficient+import+of+precursor+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">A method for isolating a high yield of Arabidopsis chloroplasts capable of efficient import of precursor proteins.</a> Plant Journal. 27 (1), 59-65 (2001).</li>
<li>Ling, Q., Jarvis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+chloroplast+protein+import+by+the+ubiquitin+E3+ligase+SP1+is+important+for+stress+tolerance+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Regulation of chloroplast protein import by the ubiquitin E3 ligase SP1 is important for stress tolerance in plants.</a> Current Biology. 25 (19), 2527-2534 (2015).</li>
<li>Lee, J., Kang, H., Hwang, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+protein+import+into+chloroplasts+using+protoplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Studying protein import into chloroplasts using protoplasts.</a> Journal of Visualized Experiments. (142), (2018).</li>
<li>Asher, A., Ganesan, I., Klasek, L., Theg, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+physiologically+active+thylakoids+and+their+use+in+energy-dependent+protein+transport+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation of physiologically active thylakoids and their use in energy-dependent protein transport assays.</a> Journal of Visualized Experiments. (139), (2018).</li>
<li>Bouchnak, I., Moyet, L., Salvi, D., Kuntz, M., Rolland, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+chloroplast+sub-compartments+from+Arabidopsis+for+the+analysis+of+protein+Localization+by+immunoblotting+or+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Preparation of chloroplast sub-compartments from Arabidopsis for the analysis of protein Localization by immunoblotting or proteomics.</a> Journal of Visualized Experiments. (140), (2018).</li>
<li>Salvi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AT_CHLORO%3A+the+first+step+when+looking+for+information+about+subplastidial+localization+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">AT_CHLORO: the first step when looking for information about subplastidial localization of proteins.</a> Methods in Molecular Biology. 1829, 395-406 (2018).</li>
<li>Shanmugabalaji, V., Douet, V., Agne, B., Kessler, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Affinity+purification+of+chloroplast+translocon+protein+complexes+using+the+TAP+tag%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Affinity purification of chloroplast translocon protein complexes using the TAP tag.</a> Journal of Visualized Experiments. (141), (2018).</li>
<li>Kikuchi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Ycf2-FtsHi+heteromeric+AAA-ATPase+complex+is+required+for+chloroplast+protein+import%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">A Ycf2-FtsHi heteromeric AAA-ATPase complex is required for chloroplast protein import.</a> Plant Cell. 30 (11), 2677-2703 (2018).</li>
<li>Rantala, M., Paakkarinen, V., Aro, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+thylakoid+membrane+protein+complexes+by+blue+native+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Analysis of thylakoid membrane protein complexes by blue native gel electrophoresis.</a> Journal of Visualized Experiments. (139), (2018).</li>
<li>Kikuchi, S., Hirohashi, T., Nakai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+preprotein+translocon+at+the+outer+envelope+membrane+of+chloroplasts+by+blue+native+PAGE%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+and+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Characterization of the preprotein translocon at the outer envelope membrane of chloroplasts by blue native PAGE.</a> Plant and Cell Physiology. 47 (3), 363-371 (2006).</li>
<li>Chen, L. J., Li, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+megadalton+TOC-TIC+supercomplexes+as+major+mediators+of+protein+import+into+chloroplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Stable megadalton TOC-TIC supercomplexes as major mediators of protein import into chloroplasts.</a> Plant Journal. 92 (2), 178-188 (2017).</li>
<li>Jarvis, R. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJarvis%2C+RP+%22Methods+in+Molecular+Biology%22">Methods in Molecular Biology</a>. JM, W. alker 775, Humana Press. New York City. 432(2011).</li>
<li>Jarvis, R. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJarvis%2C+RP+%22Methods+in+Molecular+Biology%22">Methods in Molecular Biology</a>. JM, W. alker 774, Humana Press. New York City. 374(2011).</li>
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metodi di ricerca sui cloroplasti: indagine sul targeting, localizzazione e interazioni delle proteine dei cloroplasti

Chloroplast Research Methods: Probing The Targeting, Localization And Interactions Of Chloroplast Proteins

Metodi di ricerca sui cloroplasti: indagine sul targeting, localizzazione e interazioni delle proteine dei cloroplasti

Chloroplasts are the organelles that define plants1. Along with many other metabolic, developmental and signaling functions, chloroplasts are responsible ...

Benvenuti nelle Collezioni JoVE Methods on Chloroplast Research Methods, curate dal nostro editor ospite, Paul Jarvis. Questa raccolta copre una vasta gamma di tecniche in vitro e in vivo che caratterizzano le interazioni proteiche all'interno dei cloroplasti. I ricercatori dell'Università di Oxford descrivono un metodo in vitro che utilizza cloroplasti isolati, incubati con proteine marcate radioattivamente per monitorarne l'assorbimento.Questo metodo è uno sviluppo di approcci precedenti utilizzati per studiare l'importazione di proteine del cloroplasto in vitro. Successivamente, in modo complementare, si esamina in vivo l'importazione di proteine di cloroplasti. Questo metodo utilizza l'espressione transitoria di proteine chimeriche e protoplasti per esaminare i cambiamenti di dimensione e la localizzazione delle proteine tramite immunoblotting e microscopia a fluorescenza.In questo video metodico, gli autori hanno esaminato il sistema di membrane tilacoidi presente nei cloroplasti. Isolando le membrane, le vie di traslocazione proteica vengono chiarite nei cloroplasti tramite SDS-PAGE e immagini fosforiche. I ricercatori francesi applicano diversi metodi di centrifugazione per isolare i sottocompartimenti presenti nei cloroplasti.Queste frazioni cellulari isolate vengono poi analizzate tramite immunoblotting e proteomica per fornire informazioni sulla localizzazione suborganellare delle proteine dei cloroplasti. Successivamente, i ricercatori svizzeri hanno utilizzato la purificazione per affinità di complessi multiproteici di cloroplasti per esaminare la macchina molecolare coinvolta nell'importazione di proteine. In particolare i complessi multiproteici talk e tick incorporati nelle membrane dell'involucro.In un approccio complementare, gli scienziati caratterizzano il complesso proteico tilacoide vegetale in Arabidopsis utilizzando Blue Native PAGE, o BN-PAGE, che consente la separazione dei complessi proteici nella loro forma nativa e funzionale. I complessi vengono ulteriormente analizzati tramite una pagina SD 2D. Hai appena dato un'occhiata ai vari metodi utilizzati per studiare le proteine dei cloroplasti nella nostra Collezione di Metodi JoVE.Puoi consultare gli articoli in dettaglio sulla pagina web della Chloroplast Research Methods Collection mostrata nel link sullo schermo.

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Biochemistry

Biochimica

Il confronto, approccio di proteomica quantitativa descritta mira ad ottenere intuizioni nella composizione dei complessi multiproteici in condizioni diverse ed è dimostrato dal confronto ceppi geneticamente diversi. Per l'analisi quantitativa volumi uguali di frazioni diverse da un gradiente di densità di saccarosio sono mescolati e analizzati mediante spettrometria di massa.

Un nuovo approccio per l&#39;analisi comparativa dei multiproteico Complessi Basato su<sup&gt; 15</sup&gt; N metabolica Etichettatura e quantitativa Spettrometria di Massa

Formazione di complessi proteici in vivo può essere visualizzato da bimolecular fluorescenza complementazione. Partner di interazione sono fusi a parti complementari tag fluorescenti e transitoriamente espressi in foglie di tabacco, risultando in un segnale fluorescente ricostituito upon vicinanza delle due proteine.

Interazioni proteina-proteina visualizzati tramite bimolecular complementazione fluorescenza in protoplasti di tabacco e foglie

Qui si descrive un nuovo metodo per studiare importazione delle proteine ​​in cloroplasti isolati sotto stress. Il metodo è rapido e semplice, e può essere applicata per studiare le conseguenze delle diverse condizioni di stress per l'importazione proteine ​​cloroplasto, ei corrispondenti meccanismi regolatori.

Analisi delle proteine ​​importazione in cloroplasti isolati da piante stressate

Qui presentiamo un protocollo di cattura di interazione applicato ai protoplasti a foglia di Arabidopsis thaliana . Questo metodo si basa fondamentalmente sulla creazione di reticolazione UV in vivo e consente l'isolamento e l'identificazione delle proteine ​​legate alla mRNA da un ambiente fisiologico.

Cattura di Interactome mRNA da protoplasti vegetali

Vi presentiamo protocolli qui per isolamento ad alto rendimento di tilacoidi fisiologicamente attivo e analisi di trasporto di proteina per la traslocazione di cloroplasto doppia arginina (cpTat), secretiva (cpSec1) e vie di segnale riconoscimento delle particelle (cpSRP).

Isolamento dei tilacoidi fisiologicamente attivo e il loro uso nelle analisi di trasporto energia-dipendente della proteina

Qui descriviamo un protocollo per esprimere proteine in protoplasti utilizzando il metodo di trasformazione PEG-mediata. Il metodo fornisce facile espressione di proteine di interesse e di indagine efficiente di localizzazione della proteina e il processo di importazione per varie condizioni sperimentali in vivo.

Lo studio di proteine importazione in cloroplasti utilizzando protoplasti

Qui presentiamo un protocollo collaudato e testato per la purificazione del cloroplasto complessi di importazione della proteina (complesso di TOC-TIC) utilizzando il rubinetto-tag. Il protocollo di affinità-isolamento di uno stadio potenzialmente può essere applicato a qualsiasi proteina ed essere utilizzato per identificare nuovi partners di interazione mediante spettrometria di massa.

Purificazione di affinità del cloroplasto Translocon proteina complessi usando il Tag di rubinetto

Qui, descriviamo un metodo per purificare i cloroplasti intatti da foglie di Arabidopsis e loro tre sub-scomparti principali (busta, lo stroma e tilacoidi), utilizzando una combinazione di centrifugazione differenziale, gradienti di Percoll continui, e pendenze del saccarosio discontinuo. Il metodo è utile per subplastidial e localizzazione subcellulare delle proteine mediante immunoblotting e proteomica.

Preparazione del cloroplasto Sub-compartimenti da Arabidopsis per l'analisi di localizzazione della proteina di Immunoblotting o proteomica

Molte specie vegetali cambiano il posizionamento dei cloroplasti per ottimizzare l'assorbimento della luce. Questo protocollo descrive come utilizzare uno strumento semplice e costruito in casa per studiare il movimento del cloroplasto nelle foglie di Arabidopsis thaliana utilizzando i cambiamenti nella trasmissione della luce attraverso una foglia come proxy.

Utilizzo dei cambiamenti nella trasmissione fogliare per studiare il movimento del cloroplasto in Arabidopsis thaliana

La necessità di nuovi approcci per studiare i siti di contatto di membrana (MCS) è cresciuta a causa del crescente interesse per lo studio di queste strutture cellulari e dei loro componenti. Qui, presentiamo un protocollo che integra tecnologie di microscopia precedentemente disponibili per identificare e quantificare i complessi proteici intra-organello e inter-organello che risiedono nelle MCS.

Visualizzazione e quantificazione delle interazioni proteiche endogene intra-organelli nei siti di contatto ER-mitocondri mediante saggi di legatura di prossimità

Esplora metodi di importazione e localizzazione delle proteine nei cloroplasti di Arabidopsis thaliana. Queste tecniche in vitro e in vivo aiutano a studiare la biogenesi dei cloroplasti e le interazioni proteiche.

Metodi di ricerca sui cloroplasti: indagine sul targeting, localizzazione e interazioni delle proteine dei cloroplasti

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