Microarray di DNA e RNA ad alta densità - Sintesi fotolitografica, ibridazione e preparazione di grandi librerie di acido nucleico

I microarray di DNA e RNA sono molto utili per studiare le interazioni tra acidi nucleici e proteine, ma sono anche un metodo conveniente per la preparazione di librerie di sequenze. La fotolitografia permette di sintetizzare centinaia di migliaia di sequenze uniche in parallelo ed è attualmente l'unico metodo diretto per la sintesi dell'RNA sui microarray. La sintesi fotolitografica in situ dei microarray può anche essere estesa agli oligonucleotidi modificati chimicamente, ad esempio con due fluoro primi di acidi nucleici peptidici.

Vedere il processo di fabbricazione e movimentazione di microarray può aiutare a capire come questo complesso macchinario è stato sviluppato dalla nota sintesi standard del DNA in fase solida. Iniziare questa procedura con la progettazione di microarray e la funzionalizzazione delle diapositive come descritto nel protocollo di testo. Accendere il sintetizzatore DNA UV LED e la sua ventola di raffreddamento.

Fissare un misuratore di intensità UV al punto focale della luce UV in ingresso e accenderlo. Nel computer avviare il software WiCell Controller. Accendere e inizializzare il dispositivo micromere.

Caricare un file maschera tutto bianco facendo clic con il pulsante destro del mouse su DMD e quindi selezionando carica immagine. Fare clic con il pulsante destro del mouse sull'icona UVS e selezionare L'otturatore UV aperto. Leggere il valore di potenza sul misuratore di intensità e contare 60 secondi.

Dopo 60 secondi, leggere nuovamente il valore di potenza e annotare i valori iniziale e finale. Chiudere l'otturatore selezionando l'otturatore UV vicino e spegnere il misuratore di intensità. Calcola il valore medio dell'intensità UV in milliwatt per centimetro quadrato.

Nel software WiCell caricare i file di lavoro, sequenza e protocollo nelle rispettive sotto-finestre, quindi fare clic su invia per inviare la sequenza e i file di protocollo al sintetizzatore DNA. Per assemblare la cella di sintesi posizionare una guarnizione di perfluoroelastomero spessa sul blocco di quarzo della cella. Quindi posizionare uno scivolo al microscopio forato e funzionalizzato sopra la prima guarnizione e verificare che i fori sulle diapositive si connettono con il tubo di ingresso e uscita della cella di sintesi.

Posizionare una seconda guarnizione sottile in politetrafluoroetilene sopra lo scivolo forato, che circonda i due fori. Infine, posiziona un secondo scivolo funzionale ma senza fronzoli in cima alla seconda guarnizione. Ora posiziona un telaio metallico a 4 viti sopra la cella a doppio substrato assemblata Stringi la vite alla stessa forza di bloccaggio utilizzando un cacciavite di coppia.

Attaccare i tubi di ingresso e uscita al sintetizzatore del DNA. Innescare la linea di lavaggio acetonitrile e verificare il corretto flusso di acetonitrile attraverso i substrati. Misurare il volume dell'acetonitrile sulla linea dei rifiuti dopo aver attraversato sette cicli di adescamento acetonitrile.

Questo volume dovrebbe essere di due millilitri. Attaccare la cella di sintesi al piano focale della luce UV in ingresso. In caso di preparazione della libreria, attaccare una linea di ingresso e uscita extra sul retro della cella e riempire la camera posteriore con i due millilitri della soluzione di betacarotene.

Inizia la sintesi cliccando prima su Esegui nel software WiCell. Al primo comando di attesa nel file di lavoro, premere start sul sintetizzatore DNA. Dopo la sintesi di microarray regolari, scollegare la cella dal sintetizzatore e smontare la cellula.

Utilizzare una penna diamanta per incidere il numero di sintesi sulle diapositive di vetro. Incidere il numero sulla faccia non sintetizzata di ogni diapositiva. Trasferire gli scivoli in tubi di centrifuga da 50 millilitri e conservare in un'area essiccata fino a un ulteriore utilizzo.

Dopo la sintesi dei microarray di libreria, prima scolare la soluzione di betacarotene dalla camera, quindi lavare la camera due volte scorrono attraverso cinque millilitri di cloruro di metilene prima di drenare. Per la deprotezione microarry del DNA, riempire un barattolo di vetro di colorazione con 20 millilitri di etanolo e 20 millilitri di EDA. Posizionare i microarray solo DNA verticalmente nel barattolo, chiudere il coperchio e lasciare le diapositive per deproteggersi per due ore a temperatura ambiente.

Dopo due ore, recuperare le diapositive utilizzando una pinzetta e risciacquarle accuratamente con acqua doppia distillata. Asciugare gli scivoli in una centrifuga microarray per alcuni secondi prima di conservarli in un essiccatore. Per la deprotezione del microarray di RNA, preparare una soluzione secca di 20 millilitri trietilammina e 30 millilitrieri acetonitrile in un tubo di centrifuga da 50 millilitri.

Trasferire uno scivolo di microarray di RNA nel tubo di centrifuga, chiudere il coperchio e avvolgere con pellicola di tenuta plastica. Agitare delicatamente il tubo di centrifuga su uno shaker orbitale per un'ora e 30 minuti a temperatura ambiente. Quindi, rimuovere lo scivolo e lavare due volte con 20 millilitridi di acetonitrile secco prima di asciugarsi in una centrifuga a microarray per alcuni secondi.

Dopo il primo passaggio di deprotezione trasferire lo scivolo di RNA nella soluzione di idrazina idratare, chiudere il coperchio e avvolgere con pellicola di tenuta plastica. Dopo due ore di agitazione delicata su uno shaker orbitale, rimuovere lo scivolo e lavarlo due volte con 20 millilitri di acetonitrile secco. Quindi asciugare in una centrifuga microarray per alcuni secondi.

Se il microarray di RNA contiene anche nucleotidi di DNA, procedere con un terzo passaggio di deprotezione. Aggiungere il microarray DNA/RNA a un tubo da 50 millilitri contenente una soluzione di EDA-etanolo uno a uno Dopo 5 minuti a temperatura ambiente, rimuovere lo scivolo e lavare il microarray due volte con 20 millilitri di acqua sterile. Asciugare lo scivolo in una centrifuga microarray e conservare in un essiccatore.

In un tubo di microcentrifugo sterile da 1,5 millilitri, preparare il tampone di ibridazione contenente DNA marcato Cy3, come descritto nel protocollo di testo. Mescolare e vortice la soluzione. Posizionare con cura una camera di ibridazione autoadesivo da 300 microliter sull'area di sintesi su ogni diapositiva e pipetta nella soluzione di ibridazione.

Coprire i fori della camera con punti adesivi e avvolgere l'intero scivolo in un foglio di alluminio. Posizionare lo scivolo microarray nel forno di ibridazione, coprirlo e lasciarlo ruotare delicatamente alla temperatura di ibridazione selezionata per due ore. Dopo due ore, staccare lo scivolo, rimuovere il foglio di alluminio, pipettare la soluzione di ibridazione e strappare con cura la camera di ibridazione.

Trasferire gli scivoli in un tubo di centrifuga contenente 30 millilitri di Tampone di lavaggio non rigoroso. Agitare vigorosamente per due minuti a temperatura ambiente. Trasferire lo scivolo in un tubo di centrifuga contenente 30 millilitri di Stringent Wash Buffer e agitare vigorosamente per un minuto.

Infine, trasferire lo scivolo in un tubo di centrifuga contenente 30 millilitri di Tampone di lavaggio finale. Agitare per qualche secondo. Asciugare lo scivolo in una centrifuga microarray.

Ora, posizionare il microarray asciutto, l'area di sintesi rivolta verso il basso, nel porta scorrevole dello scanner microarray. Per deproteggere e scindere le librerie di DNA, immergere lo scivolo nella soluzione di scissione, in un tubo di centrifuga da 50 millilitri. Chiudere il tubo e avvolgere con pellicola di tenuta plastica, prima di ruotare delicatamente in uno shaker orbitale per due ore a temperatura ambiente.

Dopo due ore, rimuovere lo scivolo e lavare due volte con 20 millilitri di acetonitrile scrupolosamente asciutto prima di lasciarlo asciugare all'aria. Con una pipetta, applicare 100 microlitri di acqua sterile sull'area di sintesi ormai percepibile. Pipettare la soluzione su e giù alcune volte prima di trasferirla in un tubo di microcentrifugo da 1,5 millilitri.

Ripetere il processo e combinare l'eluiato di microarray nello stesso tubo. Evaporare l'eluito del truciolo alla secchezza e quindi riinsogliere in 10 microlitri di H2O privo di nucleasi. Di seguito sono riportati i risultati di un saggio di ibridazione eseguito su un microarray contenente le versioni dna e RNA di una sequenza di 25meri.

La scansione in appare in un formato greenscale corrispondente all'eccitazione, spettro di emissione della fluorescenza Cy3, con intensità di fluorescenza registrata in unità arbitrarie. C'è una significativa variabilità nei valori assoluti di fluorescenza tra gli esperimenti. Vengono mostrati i risultati per tre sintesi indipendenti che utilizzano gli stessi parametri di fabbricazione e la stessa manipolazione post-sintetica.

Il DNA a 25meri, se ibridato al suo filamento di DNA complementare etichettato Cy3, produrrà segnali di fluorescenza che vanno da 20.000 a 30.000, molto raramente sopra o sotto. L'RNA a 25mer, se ibridato allo stesso complemento di DNA etichettato Cy3, darà intensità di fluorescenza sulle caratteristiche corrispondenti che vanno da 15.000 a 20.000. Tuttavia, l'intensità di fluorescenza dei duplex RNA/DNA scenderà occasionalmente al di sotto di 8.000, quando i corrispondenti duplex DNA/DNA fluoresceranno ancora entro l'intervallo da 20.000 a 30.000.

In questi casi, i risultati per l'RNA possono essere considerati non ottimali. Come per qualsiasi altro esperimento basato sull'RNA è importante ricordare che i microarray di RNA sono sensibili alla degradazione e devono essere maneggiati in condizioni sterili. Le librerie di acidi nucleici raccolte dai microarray possono essere utilizzate nel sequenziamento del DNA o dell'RNA, nonché nella codifica delle informazioni digitali sul DNA.

Il NED produce un'intensa luce UV che non dovrebbe essere esaminata direttamente. Per questo motivo, si consiglia di indossare occhiali protettivi mentre lo strumento è in uso.