Produzione Chimeric Antigen Receptor (CAR) Cellule T per l'immunoterapia adottiva
17 dicembre 2019
Descriviamo un approccio per generare in modo affidabile le cellule T del recettore dell'antigene chimerico (CAR) e testare la loro differenziazione e funzione in vitro e in vivo.
De-lib-er-ating un prodotto CAR T Cell con competenza funzionale che si innesta, prolifera e ha attività cit-el-uric dopo l'infusione è un componente chiave di un'efficace immunoterapia adottiva. Ad esempio, nei tumori solidi, le cellule CAR T possono penetrare nei tumori solidi e ricevono una stimolazione antigene ottimale;tuttavia, il loro innesto generale e la proliferazione sono ostacolati nelle persone. Il vantaggio principale di questo approccio è che può mantenere la qualità delle cellule CAR T o lo stato di differenziazione delle cellule CAR T senza generare cellule T terminalmente differenziate o esauste, il che avrebbe diminuito la capacità proliferativa o scarsa funzione efficace dopo l'infusione.
Questa tecnica può essere difficile perché le cellule T sono molto sensibili alla loro concentrazione cellulare o alla superficie dei vasi in cui sono coltivate. Così come i loro bisogni metabolici. Essenzialmente le cellule T devono essere mantenute felici durante tutto il processo, altrimenti non cresceranno.
Per iniziare questa procedura, impostare piatti di cultura a 6 pozzi. Attivare cellule T umane primarie fresche o crioconviate mescolandole con perline magnetiche CD28 anti-CD3, con un rapporto di tre perline per cellula T nei pozzi dei piatti di coltura. Coltura delle cellule T in mezzo X-Vivo 15 integrata con siero AB umano normale, L-glutammina, he-pees e IL2.
Attivare le cellule T ad una concentrazione di un milione di cellule T per millilitro durante l'espansione. E culturarli a 37 gradi Celsius con il 20% di ossigeno, il 5% di anidride carbonica e il 95% di umidità. Dopo la stimolazione notturna, aggiungere supernaganti lentivirali alle cellule T attivate.
Calcola il volume di supernanti necessario per raggiungere una molteplicità di infezione tra tre e cinque. Continuare a coltivare le cellule usando le stesse condizioni. Il terzo giorno, raccogliere un'aliquota rappresentativa delle cellule di crioconservazione.
Prima della crioconservazione, rimuovere le perline magnetiche tubazioni e separando magneticamente. Preparare il supporto di congelamento, che contiene PBS con 0,5%DMSO. E conservalo a quattro gradi Celsius fino a quando non è pronto per l'uso.
Quindi, centrifugare le cellule T a 300 volte G per cinque minuti. Scartare il supernatante e aggiungere cinque millilitri di PBS. Centrifugare nuovamente le cellule a 300 volte G per cinque minuti e scartare il PBS.
Sospendiamo il pellante in un millilitro di mezzo freddo per la crioconservazione. Congelare le cellule T in un contenitore di congelamento refrigerato. E conservare a meno 80 gradi Celsius per 48 ore.
Successivamente, trasferire le cellule congelate in azoto liquido. Lavare il resto delle cellule T una volta in cinque millilitri di PBS per eliminare qualsiasi vettore residuo. Centrifuga a 300 volte G per cinque minuti.
Quindi, decantare il PBS e sospendere di nuovo il pellante cellulare nel mezzo di coltura cellulare T ad una concentrazione di 500.000 cellule per millilitro. Dividi le cellule T in due culture progettate 45 e nove. Contare le cellule T per citometria a flusso usando perline di conteggio e anticorpi monoclonali per CD4 e CD8 umani.
Così come un colorante di vitalità. Rialimentare le colture a giorni nostri per mantenerle a una concentrazione di 500.000 cellule per millilitro. Il quinto giorno, conta e crio-conserva le cinque culture del giorno come descritto in precedenza.
Il settimo giorno, lavare 500.000 cellule in PBS. E sospenderli di nuovo in 100 microlitri di tampone di smistamento cellulare attivato a fluorescenza. Quindi, rilevare l'espressione della proteina superficiale CAR mediante colorazione immuno-coniata fluorescentmente anti-CAR 19 di tipo idio per citometria a flusso.
Il primo giorno contano e crio-conservano le nove culture del giorno come descritto in precedenza. In questo studio vengono misurate la funzione e l'efficacia delle cellule CAR T che vengono raccolte a intervalli variabili in tutta la coltura X-Vivo. Utilizzando i metodi descritti in questo video, le cellule T vengono stimolate ed espanse per tre o nove giorni.
Il profilo di differenziazione cellulare come indicato dalla strategia di gating mostrata qui, viene analizzato misurando l'abbondanza di glicoproteine distinte espresse sulla superficie cellulare. Un progressivo spostamento verso la differenziazione dell'effettore si vede nel tempo durante la cultura X-Vivo. Viene quindi valutata la funzione dell'effettore e la capacità proliferativa delle cellule CAR T in risposta all'antigene.
Le celle espanse meno sono funzionalmente superiori a quelle ampiamente coltivate per una durata più lunga. In un modello di topo xenografto umano di ALL viene confrontata la potenza delle cellule CAR T raccolte in diversi periodi di tempo. Le cellule di nove giorni mostrano una risposta anti-tiepida dose-dipendente con una risposta completa del valore di una dose elevata di tre milioni;e una perdita di efficacia per la bassa dose di 500.000.
Tuttavia, il giorno in cui tre cellule hanno mostrato un controllo persistente del tumore sia in dosi alte che basse. Questa risposta è associata al conteggio assoluto di CAR-T 19 nel sangue periferico dei topi. Nel complesso, questi risultati forniscono la prova che le cellule CAR T raccolte in precedenza, superano quelle raccolte in seguito.
Seguendo questa procedura, possono essere eseguiti ulteriori test di funzione come il saggio di cavalluccio marino per misurare le loro proprietà metaboliche come il consumo di ossigeno o la capacità di spir-it-ed. Diversi cicli di ristimolazione possono anche essere eseguiti per fornire informazioni sulla loro differenziazione e persistenza delle cellule CAR T. Usando questo lavoro come base, noi e altri ricercatori siamo impegnati in studi per abbreviare ulteriormente il processo culturale.
Può anche essere esteso nella progettazione di approcci di base per altri antigeni del cancro. Prestare sempre attenzione quando si lavora con il lentivirus. Ma anche quando il lentivirus è progettato per essere replicante incompetente.
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Panoramica
Questo articolo descrive un metodo per generare cellule T con recettore dell'antigene chimerico (CAR) dotate di competenza funzionale. Si sottolinea l'importanza di mantenere la qualità delle cellule T durante il processo per garantire una immunoterapia adottiva efficace.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Immunoterapia
- Biologia cellulare
- Ematologia
Sfondo
- I linfociti T con recettore chimerico (CAR T) sono ingegnerizzati per bersagliare antigeni specifici nei tumori.
- Un attecchimento e una proliferazione efficaci dei CAR T sono fondamentali per il successo della terapia.
- I tumori solidi presentano sfide uniche per la penetrazione e la funzionalità dei CAR T.
- Mantenere la vitalità dei linfociti T durante tutto il processo di coltura è essenziale per la loro efficacia.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo affidabile per la generazione di cellule T con recettore chimerico (CAR T).
- Valutare la differenziazione e la funzionalità delle cellule CAR T in vitro e in vivo.
- Migliorare l'efficacia complessiva delle terapie con cellule CAR T.
Metodi Utilizzati
- Generazione di cellule T CAR da cellule T derivate dal paziente.
- Valutazione in vitro della differenziazione e della funzione delle cellule T.
- Valutazione in vivo dell'attecchimento e dell'attività delle cellule T CAR.
- Monitoraggio dello stato di salute e dei fabbisogni metabolici delle cellule T durante la coltura.
Risultati principali
- Generazione con successo di cellule T CAR con competenza funzionale preservata.
- Dimostrata capacità delle cellule T CAR di proliferare e funzionare in modo efficace dopo l'infusione.
- Individuati i fattori chiave che influenzano la salute delle cellule T durante la coltura.
- Fornite indicazioni per l'ottimizzazione delle terapie con cellule T CAR nei tumori solidi.
Conclusioni
- Il metodo sviluppato migliora la qualità delle cellule CAR T per l'uso terapeutico.
- Mantenere la salute delle cellule T è fondamentale per la loro efficacia nell'immunoterapia adottiva.
- Studi futuri dovrebbero concentrarsi sull'ulteriore ottimizzazione della generazione e della funzione delle cellule CAR T.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La produzione di cellule CAR T con competenza funzionale preservata è fondamentale per far progredire l'immunoterapia adottiva nei percorsi oncologici. Questo metodo consente una valutazione accurata dell'espressione del recettore CAR, della differenziazione, della capacità proliferativa e dell'attività citolitica, fornendo un'elevata affidabilità predittiva nei modelli preclinici. Una produzione affidabile di cellule CAR T influenza direttamente le decisioni strategiche nel passaggio tra ricerca scoperta e ricerca traslazionale.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Prima Fase della Scoperta e Validazione del Target
- Permette l'analisi di ipotesi terapeutiche generando cellule T CAR dirette contro antigeni specifici.
- Supporta la riduzione del rischio biologico attraverso la valutazione funzionale della differenziazione e della persistenza delle cellule T CAR.
- Facilita una previsione affidabile dell'interazione con il bersaglio e dell'attività citolitica in modelli preclinici.
Sviluppo di screening e saggi
- Prepara popolazioni di cellule T CAR validate per saggi di citotossicità e di rilascio di citochine.
- Standardizza la misurazione dell'espressione del recettore CAR e della funzione effettrice per ottenere risultati riproducibili nei saggi.
- Consente una valutazione quantitativa della proliferazione e della vitalità cellulare, supportando screening affidabili di composti o antigeni.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea i profili funzionali dei linfociti T con CAR a modelli di xenotrapianto pertinenti alla malattia per garantire continuità traslazionale.
- Permette un avanzamento basato sulla valutazione del rischio confrontando l'efficacia di linfociti T con CAR raccolti a diversi intervalli di coltura.
- Fornisce una riduzione del rischio di tipo meccanicistico collegando lo stato di differenziazione alla persistenza in vivo e all'attività antitumorale.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo protocollo di produzione di cellule T con recettore chimerico dell'antigene collega la fase iniziale della scoperta, lo sviluppo dei saggi e la validazione preclinica, consentendo un'integrazione fluida dei flussi di lavoro per i programmi di immunoterapia.
- Biologia della scoperta Supporta il test delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi metabolici mediante la generazione funzionale di cellule T CAR.
- Selezione: Fornisce letture quantitative e riproducibili per l'espressione del recettore CAR e la funzione citolitica.
- Analitica: Fornisce misurazioni mediante citometria a flusso e saggi citochinici per analisi comparativa.
- Ricerca traslazionale Collega la differenziazione e la funzione in vitro all'efficacia in vivo in modelli di xenoattecchimento.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma standardizzata adattabile ad altri bersagli antigenici e modelli di malattia.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica nella funzione delle cellule CAR T.
- Valore operativo: Migliora la standardizzazione, la riproducibilità e la scalabilità della produzione delle cellule CAR T.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione e l'efficienza del capitale consentendo una valutazione preclinica solida.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione e lo sviluppo dei candidati per l'immunoterapia con adeguamento del rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella coltura di cellule T, nella trasduzione con lentivirus e nell'analisi mediante citometria a flusso.
- Richiede l'accesso a strutture specializzate per la coltura cellulare e a strumentazione analitica.
- Necessita di una standardizzazione intersettoriale per il conteggio cellulare, la valutazione della vitalità e i saggi funzionali.
- È adattabile a diversi bersagli antigenici e sistemi di modelli preclinici mediante ottimizzazione del protocollo.
- Una manipolazione accurata dei vettori lentivirali è essenziale per la sicurezza biologica e la riproducibilità.
