Name: Produzione Chimeric Antigen Receptor (CAR) Cellule T per limmunoterapia adottiva (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-17T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 51 s
Description: Scopri come generare CAR T cellule con competenza funzionale per l'immunoterapia adottiva. Questo metodo preserva la qualità cellulare durante la coltura, migliorando l'efficacia terapeutica contro i tumori solidi.

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Questo lavoro è stato sostenuto in parte attraverso il finanziamento fornito da Novartis Pharmaceuticals attraverso un'alleanza di ricerca con l'Università della Pennsylvania (Michael C. Milone) e il premio St. Baldrick's Foundation Scholar Award (Saba Ghassemi).

Tutti gli studi sugli animali sono approvati dal Comitato Istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università della Pennsylvania.
1. Attivazione, trasduzione ed espansione delle cellule T
<ol><li>Attivare le cellule T umane primarie fresche o crioconservate mescolando con perline magnetiche anti CD3/CD28 (ad esempio, dinaline) a un rapporto di 3 perline per cellula T in piatti di coltura cellulare a 6 pozzetti. Cellule T di coltura nel mezzo X-VIVO 15 integrate con 5% siero umano normale AB, 2 mM L-glutamine, 20 mM HEPES, e IL2 (100 unità/mL). Mantenere le cellule T a una concentrazione di 106 cellule T/mL durante l'espansione. Cellule T di coltura a 37 gradi centigradi, 20% O2e 95% di umidità con 5% CO2.</li>
	<li>Dopo la stimolazione notturna, aggiungere il supernnatale lentivirale alle cellule T attivate. Calcolare il volume di supernatante necessario per ottenere una molteplicità di infezione (MOI) di 3/5. NOT:</</c3> Il plasmide di lentivirus CD19-BB-CAR è costituito da una cerniera CD8, un dominio coscultore 4-1BB e da un dominio di segnalazioneCD3 , 21. Il supernatante lentivirale CD19-BB è stato generato come descritto in precedenza21.</li>
	<li>Il terzo giorno, raccogliere un aliquota rappresentativa di cellule per la crioconservazione. Prima della crioconservazione, rimuovere le perline magnetiche mediante pipettaggio delicato e separazione magnetica. Preparare il mezzo di congelamento contenente la salina con buffer fosfato (PBS) con 0,5% di zolfo dimetile (DMSO) e conservarlo a 4 gradi centigradi fino all'uso.<ol>
<li>Centrifugare le cellule T a 300 x g per 5 min. Scartare il supernatante e aggiungere 5 mL di PBS. Centrifugare le cellule a 300 x g per 5 min e scartare il PBS.</li>
		<li>Risospendere il pellet cellulare in 1 mL di mezzo di crioconservazione a freddo. Congelare le cellule T in un contenitore di congelamento refrigerato e conservarle a -80 gradi centigradi per 48 h. Trasferire le cellule congelate in azoto liquido.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lavare il resto delle cellule T una volta in 5 mL di PBS per eliminare il vettore residuo. Centrifuga a 300 x g per 5 min. Decant il PBS e rimettere in sospensione il pellet cellulare nel mezzo di coltura delle cellule T ad una concentrazione di 0,5 x 106 cellule / mL.</li>
	<li>Dividere le cellule T in due colture, designate per il giorno 5 e il giorno 9. Contare le cellule T per citometria di flusso utilizzando perline di conteggio (Tabella dei materiali) e anticorpi monoclonali per cd4 e CD8 umani, nonché un colorante di fattibilità ( Tabella deimateriali).<ol>
<li>Per misurare la concentrazione delle cellule T, preparare una miscela master contenente 500 , l'l di PBS, 5 - L di perline di conteggio, 10 - L di 7-Amino-actinomycin D sistema di fattibilità cellulare, 4 - L di CD4-FITC e 4 - L di CD8-APC. Aggiungere 40 celle T al mix master e misurare la concentrazione cellulare per citometria di flusso in base al numero di cellule T vive/conteggi di perline. Eseguire il refeed per mantenere le colture a una concentrazione di 0,5 x 106 cellule/mL ogni altro giorno.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Il giorno 5, contare e crioconservare giorno 5 culture come descritto nei passaggi 1.3 e 1.5.</li>
	<li>Il giorno 7, lavare 0,5 x 106 celle T in PBS e risospendere in 100 - L di fluorescenza attivato tampone di smistamento cellulare (FACS). Rileva l'espressione della proteina superficiale CAR immunostaining con un idiotipo anti-CAR19 fluorescente da citometria di flusso.</li>
	<li>Il giorno 9, conta le culture del giorno 9 e criopreserve come descritto al punto 1.3.</li>
</ol>2. Valutazione fenotipica della differenziazione delle cellule T
<ol><li>Preparare un mix master contenente anticorpi pre-titolati per anti-CD3–BV605 (clone OKT3), anti-CD14–Pacific Blue (PB) (clone HCD14), anti-CD19–PB (clone HIB19), anti-CD4–BV510 (clone OKT4), anti-CD8–H7APC (clone SK1), anti-CCR7–C anti-CD45RO-PE (clone UCHL1), anti-CD27-PE-Cy7 (clone 1A4CD27), anti-CD95–PerCP-Cy5.5 (clone DX2) e anti-CAR19-APC.</li>
	<li>Preparare i controlli a fluorescenza individuale meno uno (FMO) per le cellule color-acqua anti-CD45RO-PE, anti-CCR7-FITC, anti-CD27-PE-Cy7 e anti-CD95-PerCP-Cy5.5 alle cellule coloracquarizzate dallo sfondo.</li>
	<li>Preparare la soluzione di colorazione delle cellule morte diluindo il reagente di stock vivo /morto (Tabella dei materiali) 1:10.000 in PBS.</li>
	<li>Scongelare giorno 3, giorno 5 e giorno 9 cellule T che erano precedentemente crioconservate. Centrifuga 1 x 106 cellule T da ogni gruppo a 300 x g per 3 min. Scartare il supernatante. Lavare le cellule una volta con PBS. Centrifuga a 300 x g per 3 min e scartare il PBS.</li>
	<li>Mescolare le cellule T con una soluzione di colorazione morta per 15 min a temperatura ambiente (RT), protetta dalla luce.</li>
	<li>Aggiungere 1 mL di buffer FACS per dissetare il colorante di colorazione della cella morta. Centrifuga a 300 x g per 3 min, scartare il supernatante e sospendere nuovamente il pellet cellulare in 100 . Incubare per 1 h a 4 gradi centigradi.</li>
	<li>Aggiungere 1 mL di tampone e centrifuga FACS a 300 x g per 3 min per lavare gli anticorpi non legati. Ripetere tre volte con il buffer FACS.</li>
	<li>Risospendere le cellule in paraformaldeide dell'1% (PFA) e conservarle a 4 gradi centigradi.</li>
	<li>Quando l'espressione CD45RO diminuisce dopo la fissazione, analizzare i campioni per citometria di flusso dopo l'immunostaining. Per valutare la differenziazione, gate nel seguente ordine: singlets (FSC-H vs FSC-A), cellule CD3- T live (Dump [live-dead violet, CD14-PB e CD19-PB vs CD3-BV605], CD4-BV510 vs CD8-APC-H7). InCD4 ecd8, i sottoinsiemi, gate su CD45RO-PE vs CCR7-FITC per definire cellule T simili a nai (CD45RO-CCR7), Tcm (CD45RO),Tem (CD45RO)- CCR7-) e Tte (CD45RO-CCR7-). Per identificare Tscm, cancello su CD27- cellule T in popolazione di cellule T ingenui. In questo scomparto, Tscm sono CD95e Tn sono CD95-.</li>
</ol>3. Analisi funzionale in vitro
<ol><li>Proliferazione delle cellule Car T e secrezione di citochine
	<ol>
<li>Verificare l'espressione CAR e la fattibilità delle celle come descritto nei passaggi 1.5 e 1.7, per citometria di flusso.</li>
		<li>Lavare 5 x 106 cellule T da ogni gruppo (giorno 3, giorno 5 e giorno 9) con PBS e risospendere in una soluzione da 1 M di carboxyfluorescein diacenimidyl ester (CFSE) in PBS per 3,5 min a RT.</li>
		<li>Aggiungere immediatamente 10 mL di PBS contenente 10% siero bovino fetale (FBS) per placare la reazione.</li>
		<li>Centrifugare la soluzione a 300 x g per 3 min. Scartare il supernatante e ripetere questa fase di lavaggio tre volte. Contare le celle alla fine della colorazione CFSE utilizzando un contatore Coulter (Tabella dei materiali).</li>
		<li>Raccogliere le cellule macchiate di CFSE (non stimolate), riutilizzare in 1% PFA e conservare a 4 gradi centigradi per l'analisi per citometria di flusso.</li>
		<li>Incubare il numero desiderato di cellule CAR CAR macchiate di CFSE con celle di coltura K562-CD19 (bersaglio) irradiate e K562-wild type (controllo) con un rapporto di 1:1 per 120 h in condizioni di coltura libera citochina, come descritto nel passaggio 1.1.</li>
		<li>Dopo 24 h, centrifugare il recipiente di coltura a 300 x g per 5 min. Raccogliere 120 l di supernatante cellulare. Valutare la produzione dipendente dall'attivazione di IL2, IFNz, TNF, GM-CSF e altre citochine infiammatorie (IL1, IL4, IL5, IL6, IL8 e IL10) mediante analisi di Luminex in conformità con le raccomandazioni del produttore.</li>
		<li>Sostituire il volume di supernatant che è stato raccolto nel passaggio 3.1.7 con un volume equivalente (120 l) di mezzo fresco.</li>
		<li>Il giorno 3 (cioè dopo 96 h), contare e ri-alimentare ad una concentrazione di 0,5 x 106 cellule / mL utilizzando citometria di flusso a base di perline come in precedenza nel passaggio 1.5.</li>
		<li>Il giorno 5, contare il CD3 livee calcolare la modifica di piegatura delle cellule T vive rispetto al numero di cellule T in tempo reale al giorno 0.</li>
		<li>Eseguire un'analisi completa della diluizione CFSE nella divisione delle celle CAR T utilizzando il software FlowJo per evidenziare cicli successivi di divisione cellulare. NOTA: i saggi di proliferazione sono ben descritti nel manuale FlowJo.</li>
	</ol></li>
	<li>Ansaggio della citotossicità NOT:</</c1> La capacità delle cellule CART19 di uccidere le cellule bersaglio che esprimono CD19 viene valutata utilizzando un'ipotesi di rilascio di 51Cr.<ol>
<li>Etichettare le cellule bersaglio mescolando 5 x 105 K562-CD19, cellule di controllo del tipo K562- wild, o cellule di leucemia NALM6 con 50 .L di551 CrO4 e 0.5 mL di RPMI integrato con 10% FBS per 90 min in incubatrice a 37 .</li>
		<li>Centrifuga refusione di cellule a 300 x g per 2,5 min. Scartare il supernatante radioattivo in opportuni contenitori di smaltimento e lavare le cellule bersaglio in 5 mL di PBS. Ripetere i passaggi di lavaggio due volte.</li>
		<li>Risospendere le cellule bersaglio nel mezzo privo di rosso fenolo contenente il 5% di FBS. Utilizzare questo supporto per il resto della procedura per ridurre lo sfondo.</li>
		<li>Dopo aver valutato l'espressione CAR e la fattibilità delle cellule in base alla citometria di flusso (come descritto nella sezione 5.1), mescolare le celle CAR T con le celle bersaglio etichettate in corrispondenza dei rapporti etsuo:target (E:T) di 10:1, 3:1 e 1:1, in triplice copia. Trasferire su una piastra inferiore U di 96 pozze.</li>
		<li>Parallelamente, includere le cellule bersaglio da sole, e le cellule bersaglio con 1% solfato di sodecyl di sodio (SDS), per determinare spontaneo (S) e massimo (M) 51Cr rilascio, rispettivamente.</li>
		<li>Centrifuga a 300 x g per 5 min e incubazione per 4 h o 20 h in un'incubatrice 37 C con 5% CO2.</li>
		<li>Dopo il tempo prestabilito, centrificare il recipiente di coltura a 300 x g per 5 min. Raccogliere 35 -L di supernatante cellulare e trasferirlo su una piastra di lettura. Evitare le bolle. Lasciare asciugare il piatto durante la notte.</li>
		<li>Sigillare la piastra con un sigillo a piastre standard e contare con un contatore di scintillio liquido. L'abbondanza di cromo nel supernatante fornisce un proxy di uccisione di cellule bersaglio. Calcolare la percentuale di lisi specifica come segue: 100 x (conteggi al minuto [cpm] versione sperimentale – cpm S release)/ (cpm M release – cpm S release).</li>
	</ol></li>
</ol>4. Analisi funzionale in vivo
<ol><li>Ottenere topi NOD-SCID-c– (NSG) di 6-10 settimane, che non dispongono di un sistema immunitario adattivo, e assegnarli casualmente al gruppo di trattamento/controllo.</li>
	<li>Iniettare gli animali per via endovenosa attraverso la vena della coda con 1 x 106 cellule NALM6 in PBS sterile da 0,1 mL.</li>
	<li>Dopo 5/7 giorni, confermare l'innesto tumorale mediante l'imaging di bioluminescenza (BLI). Iniettare 150 mg/kg di D-lucidferina ai topi che sono stati anestesizzati con isoflurane (il volume dipende dalla massa corporea).</li>
	<li>Misurare i valori di bioluminescenza utilizzando un sistema di imaging. Quantifica il flusso totale utilizzando il software corrispondente disegnando rettangoli di area identica intorno ai topi, raggiungendo dalla testa al 50% della lunghezza della coda. Sottrarre singolarmente lo sfondo per ogni immagine.</li>
	<li>Dopo aver stabilito la leucemia, iniettare 3 x 106 celle CART19 giorno, 0,5 x 106 celle CAR T, o corrispondenti cellule T umane non trasdotte (NTD) tramite vena posteriore in un volume di 100L di sterile PBS/ Ca2. NOT:</</c6> Poiché la bioattività delle cellule raccolte a vari intervalli durante il processo di coltura è diversa, la concentrazione scelta delle cellule del giorno 3 è inferiore al giorno 9.</li>
	<li>Per determinare la progressione della malattia, misurare i valori di bioluminescenza due volte alla settimana, come descritto in precedenza nel passaggio 4.3.</li>
	<li>Per determinare l'innesto di cellule CAR T, raccogliere 75 sangue con sanguinamento retroorbitale in un tubo rivestito EDTA. Trasferire 50 - L di sangue su tubi di conteggio assoluti.</li>
	<li>Macchiare il sangue con anticorpi contro CD45, CD4, CD8 e CAR per 30 min a RT. Aggiungere 400 l di 1x soluzione liscile FACS ai tubi e vortice accuratamente. Dopo la colorazione, analizzare l'espressione del marcatore di superficie per citometria di flusso. NOT:</</c7> Altri indicatori di superficie possono essere utilizzati per valutare la differenziazione e lo stato di esaurimento dei cellule T nel sangue.</li>
	<li>Per misurare i livelli di citochine nel sangue, centrifugare il sangue a 1.200 x g per 30 min a 4 gradi centigradi per separare il siero dallo strato superiore di sangue.</li>
	<li>Raccogliere il siero e misurare le citochine con una piastra di lettura designata secondo le istruzioni del produttore.</li>
</ol>

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<li>Cui, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-7-Induced+Glycerol+Transport+and+TAG+Synthesis+Promotes+Memory+CD8+T+Cell+Longevity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">IL-7-Induced Glycerol Transport and TAG Synthesis Promotes Memory CD8 T Cell Longevity.</a> Cell. 161 (4), 750-761 (2015).</li>
<li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Closely+related+T-memory+stem+cells+correlate+with+in+vivo+expansion+of+CAR.CD19-T+cells+and+are+preserved+by+IL-7+and+IL-15%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Closely related T-memory stem cells correlate with in vivo expansion of CAR.CD19-T cells and are preserved by IL-7 and IL-15.</a> Blood. 123 (24), 3750-3759 (2014).</li>
<li>Singh, N., Perazzelli, J., Grupp, S. A., Barrett, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+memory+phenotypes+drive+T+cell+proliferation+in+patients+with+pediatric+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Early memory phenotypes drive T cell proliferation in patients with pediatric malignancies.</a> Science Translational Medicine. 8 (320), 320ra323(2016).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Qui descriviamo gli approcci per misurare la funzione e l'efficacia delle cellule CAR T raccolte a intervalli variabili in tutta la coltura ex vivo. I nostri metodi forniscono una visione completa dei saggi progettati per valutare la capacità proliferaria e la funzione degli effetti in vitro. Descriviamo come misurare l'attività delle cellule CAR T dopo la stimolazione attraverso la CAR e i modelli di xenotrapianto dettagliati della leucemia utilizzando cellule CAR T raccolte al giorno 3 contro il giorno 9 della loro fas...

I recettori degli antigeni chimerici (CAT) forniscono un approccio promettente per reindirizzare le cellule T contro antigeni tumorali distinti. I CR sono recettori sintetici che legano un bersaglio dell'antigene. Mentre la loro composizione precisa è variabile, i CAR contengono generalmente 3 domini distinti. Il dominio extracellulare dirige il legame verso un antigene bersaglio ed è in genere costituito da un frammento di anticorpo a catena singola collegato alla CAR tramite una cerniera extracellulare. Il secondo dominio, comunemente derivato dalla catena CD3 del complesso del recettore delle cellule T (TCR), promuove l'attivazione delle cellule T in seguito al coinvolgimento della CAR. Un terzo dominio costimulatory è incluso per migliorare la funzione delle cellule T, innesto, metabolismo, e la persistenza. Il successo della terapia cellulare CAR T in varie neoplasie ematopoietiche tra cui la leucemia linfoblastica acuta a cellule B (ALL), la leucemia linfocitica cronica (CLL) e il mieloma multiplo evidenziano la promessa terapeutica di questo approccio1,2,3,4,5. Le recenti approvazioni della Food and Drug Administration (FDA) per due terapie cellulari CAR T specifiche per CD19, tisagenlecleucel per bambini e giovani adulti ALL e axicabtagene ciloleucel per il linfoma diffuso a grandi cellule B, rafforza il merito traslazionale della terapia cellulare CAR T.
Gli approcci basati su CAR T prevedono l'isolamento delle cellule T dal sangue periferico, l'attivazione, la modificazione genetica e l'espansione ex vivo. La differenziazione è un parametro importante che regola l'efficacia delle cellule CAR T. Di conseguenza, limitare la differenziazione delle cellule T durante la coltura ex vivo migliora la capacità del prodotto infuso di innestare, espandere e persistere, fornendo un'immunosorveglianza a lungo termine dopo il trasferimento adottivo2,7,8,9. Le cellule T sono costituite da diversi sottoinsiemi distinti, tra cui: cellule T ingenue (Tn), memoria centrale (Tcm), memoria efsiatrice (Tem), effettore differenziato (Tte) e memoria delle cellule staminali (Tscm). Le cellule T differenziate dell'effetto hanno una potente capacità citolitica; tuttavia, sono di breve durata e ne innestano male10,11,12. Al contrario, le cellule T con un fenotipo meno differenziato, comprese le cellule T ingenue e Tcm, presentano capacità di innesto e proliferazione superiori dopo il trasferimento delle cellule adottive13,14,15,16,17,18. La composizione delle cellule T raccolte nel prodotto prefabbricato può variare tra i pazienti e correlata al potenziale terapeutico delle cellule T CAR. La proporzione di cellule T con un immunofenotipo ingenuo nel prodotto dell'aferesi iniziale è altamente correlata sia con l'innesto che con la risposta clinica19.
La durata della coltura è un parametro importante che influenza la differenziazione nelle cellule T CAR preparate per il trasferimento adottivo. Recentemente abbiamo sviluppato un approccio per generare cellule CAR T di qualità superiore utilizzando un paradigma di coltura abbreviato20. Utilizzando il nostro approccio, abbiamo dimostrato che una cultura limitata dà origine a cellule CAR T con funzione efsiatrice superiore e persistenza dopo il trasferimento adottivo in modelli di xenotrapianto di leucemia. Qui presentiamo gli approcci per generare in modo affidabile cellule CART19 (cellule T autologhe progettate per esprimere anti-CD19 scFv collegate al CD3 e ai domini di segnalazione 4-1BB) e includiamo una descrizione dettagliata dei saggi che forniscono informazioni sulla bioattività e sull'efficacia di CAR T prima del trasferimento adottivo.

<table><tbody><tr><td>Anti CD3 / CD28 dynabeads</td><td>Thermo Fisher</td><td>40203D</td><td></td></tr><tr><td>APC Topo Anti-Umano CD8</td><td>BD Biosciences</td><td>555369</td><td>RRID:AB_398595</td></tr><tr><td>APC-H7 Topo anti-umano CD8 Anticorpo BD</td><td>Biosciences</td><td>560179</td><td>RRID:AB_1645481</td></tr><tr><td>BD FACS Soluzione di lisi 10X Concentrato</td><td>BD Biosciences</td><td>349202</td><td></td></tr><tr><td>BD Trucount Provette di conteggio assoluto</td><td>BD Biosciences</td><td>340334</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Violet 510 anticorpo CD4</td> umano <td>BioLegend</td><td>317444</td><td>RRID:AB_2561866</td></tr><tr><td>Brilliant Violet 605 anticorpo CD3 umano</td><td>BioLegend</td><td>317322</td><td>RRID:AB_2561911</td></tr><tr><td>CellTrace CFSE Kit di proliferazione cellulare</td><td>Life Technolohgies</td><td>C34554</td><td></td></tr><tr><td>CountBright Absolute Counting Beads,</td> <td>Invitrogen</td><td>C36950</td><td></td></tr><tr><td>FITC anti-umano CD197 (CCR7) Anticorpo</td><td>BD Pharmingen</td><td>561271</td><td>RRID:AB_10561679</td></tr><tr><td>FITC Topo anti-umano CD4</td><td>BD Biosciences</td><td>555346</td><td>RRID:AB_395751</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Siero umano</td><td>AB Valley Biomedical</td><td>HP1022</td><td></td></tr><tr><td>Umano IL-2 IS, grado premium Miltenyi</td><td></td><td>130-097-744</td><td></td></tr><tr><td>L-glutammina</td><td>Gibco</td><td>28030-081</td><td></td></tr><tr><td>Contatore a scintillazione liquida, MicroBeta trilux</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Sonde</td><td>molecolari</td> viola fissabili <td>L34964</td><td></td></tr><tr><td>Multisizer Coulter Counter</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Na251CrO4</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEZ030S001MC</td><td></td></tr><tr><td>Pacific Anticorpo CD14 blu BioLegend</td><td></td><td>325616</td><td>RRID:AB_830689</td></tr><tr><td>Anticorpo CD19 anti-umano blu del Pacifico</td><td>BioLegend</td><td>302223</td><td></td></tr><tr><td>PE anti-umano CD45RO Anticorpo</td><td>BD Biosciences</td><td>555493</td><td>RRID:AB_395884</td></tr><tr><td>PE/Cy5 anti-umano CD95 (Fas) Anticorpo</td><td>BioLegend</td><td>305610</td><td>RRID:AB_493652</td></tr><tr><td>PE/Cy7 anti-umano CD27 Anticorpo</td><td>Beckman Coltro</td><td>A54823</td><td></td></tr><tr><td>Mezzo privo di rosso fenolo</td><td>Gibco</td><td>10373-017</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione SDS UltraPure, 10%</td> <td>Invitrogen</td><td>15553027</td><td></td></tr><tr><td>Via-Probe</td><td>BD Biosciences</td><td>555815</td><td></td></tr><tr><td>X-VIVO 15</td><td>Gibco</td><td>04-418Q</td><td></td></tr><tr><td>XenoLight D-Luciferin - K+ Salt</td><td>Perkin Elmer</td><td>122799</td><td></td></tr></tbody></table>

produzione chimeric antigen receptor (car) cellule t per l'immunoterapia adottiva

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells for Adoptive Immunotherapy

L'immunoterapia adottiva promette per il trattamento del cancro e delle malattie infettive. Descriviamo un semplice approccio per trasdurre le cellule T umane primarie con il recettore dell'antigene chimerico (CAR) ed espandere la loro progenie ex vivo. Includiamo saggi per misurare l'espressione CAR, nonché la differenziazione, la capacità proliferare e l'attività citolitica. Descriviamo i saggi per misurare la produzione di citochine e la secrezione infiammatoria di citochina nelle cellule CAR T. Il nostro approccio fornisce un metodo affidabile e completo per la coltura delle cellule T CAR per modelli preclinici di immunoterapia adottiva.

Utilizzando i metodi descritti sopra, abbiamo stimolato e ampliato le cellule T per 3 o 9 giorni (Figura 1A,B). Abbiamo anche analizzato il loro profilo di differenziazione, come indicato dalla strategia di gating delineata nella Figura 1C, misurando l'abbondanza di glicoproteine distinte espresse sulla superficie cellulare. Mostriamo un progressivo spostamento verso la differenziazione degli effetti nel tempo durante la cultura...

Descriviamo un approccio per generare in modo affidabile le cellule T del recettore dell'antigene chimerico (CAR) e testare la loro differenziazione e funzione in vitro e in vivo.

Produzione Chimeric Antigen Receptor (CAR) Cellule T per l'immunoterapia adottiva

Adoptive immunotherapy holds promise for the treatment of cancer and infectious disease. We describe a simple approach to transduce primary human T cells ...

De-lib-er-ating un prodotto CAR T Cell con competenza funzionale che si innesta, prolifera e ha attività cit-el-uric dopo l'infusione è un componente chiave di un'efficace immunoterapia adottiva. Ad esempio, nei tumori solidi, le cellule CAR T possono penetrare nei tumori solidi e ricevono una stimolazione antigene ottimale;tuttavia, il loro innesto generale e la proliferazione sono ostacolati nelle persone. Il vantaggio principale di questo approccio è che può mantenere la qualità delle cellule CAR T o lo stato di differenziazione delle cellule CAR T senza generare cellule T terminalmente differenziate o esauste, il che avrebbe diminuito la capacità proliferativa o scarsa funzione efficace dopo l'infusione.Questa tecnica può essere difficile perché le cellule T sono molto sensibili alla loro concentrazione cellulare o alla superficie dei vasi in cui sono coltivate. Così come i loro bisogni metabolici. Essenzialmente le cellule T devono essere mantenute felici durante tutto il processo, altrimenti non cresceranno.Per iniziare questa procedura, impostare piatti di cultura a 6 pozzi. Attivare cellule T umane primarie fresche o crioconviate mescolandole con perline magnetiche CD28 anti-CD3, con un rapporto di tre perline per cellula T nei pozzi dei piatti di coltura. Coltura delle cellule T in mezzo X-Vivo 15 integrata con siero AB umano normale, L-glutammina, he-pees e IL2.Attivare le cellule T ad una concentrazione di un milione di cellule T per millilitro durante l'espansione. E culturarli a 37 gradi Celsius con il 20% di ossigeno, il 5% di anidride carbonica e il 95% di umidità. Dopo la stimolazione notturna, aggiungere supernaganti lentivirali alle cellule T attivate.Calcola il volume di supernanti necessario per raggiungere una molteplicità di infezione tra tre e cinque. Continuare a coltivare le cellule usando le stesse condizioni. Il terzo giorno, raccogliere un'aliquota rappresentativa delle cellule di crioconservazione.Prima della crioconservazione, rimuovere le perline magnetiche tubazioni e separando magneticamente. Preparare il supporto di congelamento, che contiene PBS con 0,5%DMSO. E conservalo a quattro gradi Celsius fino a quando non è pronto per l'uso.Quindi, centrifugare le cellule T a 300 volte G per cinque minuti. Scartare il supernatante e aggiungere cinque millilitri di PBS. Centrifugare nuovamente le cellule a 300 volte G per cinque minuti e scartare il PBS.Sospendiamo il pellante in un millilitro di mezzo freddo per la crioconservazione. Congelare le cellule T in un contenitore di congelamento refrigerato. E conservare a meno 80 gradi Celsius per 48 ore.Successivamente, trasferire le cellule congelate in azoto liquido. Lavare il resto delle cellule T una volta in cinque millilitri di PBS per eliminare qualsiasi vettore residuo. Centrifuga a 300 volte G per cinque minuti.Quindi, decantare il PBS e sospendere di nuovo il pellante cellulare nel mezzo di coltura cellulare T ad una concentrazione di 500.000 cellule per millilitro. Dividi le cellule T in due culture progettate 45 e nove. Contare le cellule T per citometria a flusso usando perline di conteggio e anticorpi monoclonali per CD4 e CD8 umani.Così come un colorante di vitalità. Rialimentare le colture a giorni nostri per mantenerle a una concentrazione di 500.000 cellule per millilitro. Il quinto giorno, conta e crio-conserva le cinque culture del giorno come descritto in precedenza.Il settimo giorno, lavare 500.000 cellule in PBS. E sospenderli di nuovo in 100 microlitri di tampone di smistamento cellulare attivato a fluorescenza. Quindi, rilevare l'espressione della proteina superficiale CAR mediante colorazione immuno-coniata fluorescentmente anti-CAR 19 di tipo idio per citometria a flusso.Il primo giorno contano e crio-conservano le nove culture del giorno come descritto in precedenza. In questo studio vengono misurate la funzione e l'efficacia delle cellule CAR T che vengono raccolte a intervalli variabili in tutta la coltura X-Vivo. Utilizzando i metodi descritti in questo video, le cellule T vengono stimolate ed espanse per tre o nove giorni.Il profilo di differenziazione cellulare come indicato dalla strategia di gating mostrata qui, viene analizzato misurando l'abbondanza di glicoproteine distinte espresse sulla superficie cellulare. Un progressivo spostamento verso la differenziazione dell'effettore si vede nel tempo durante la cultura X-Vivo. Viene quindi valutata la funzione dell'effettore e la capacità proliferativa delle cellule CAR T in risposta all'antigene.Le celle espanse meno sono funzionalmente superiori a quelle ampiamente coltivate per una durata più lunga. In un modello di topo xenografto umano di ALL viene confrontata la potenza delle cellule CAR T raccolte in diversi periodi di tempo. Le cellule di nove giorni mostrano una risposta anti-tiepida dose-dipendente con una risposta completa del valore di una dose elevata di tre milioni;e una perdita di efficacia per la bassa dose di 500.000.Tuttavia, il giorno in cui tre cellule hanno mostrato un controllo persistente del tumore sia in dosi alte che basse. Questa risposta è associata al conteggio assoluto di CAR-T 19 nel sangue periferico dei topi. Nel complesso, questi risultati forniscono la prova che le cellule CAR T raccolte in precedenza, superano quelle raccolte in seguito.Seguendo questa procedura, possono essere eseguiti ulteriori test di funzione come il saggio di cavalluccio marino per misurare le loro proprietà metaboliche come il consumo di ossigeno o la capacità di spir-it-ed. Diversi cicli di ristimolazione possono anche essere eseguiti per fornire informazioni sulla loro differenziazione e persistenza delle cellule CAR T. Usando questo lavoro come base, noi e altri ricercatori siamo impegnati in studi per abbreviare ulteriormente il processo culturale.Può anche essere esteso nella progettazione di approcci di base per altri antigeni del cancro. Prestare sempre attenzione quando si lavora con il lentivirus. Ma anche quando il lentivirus è progettato per essere replicante incompetente.

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Questo video mostra una tecnica per produrre cellule T del recettore dell'antigene chimerico (CAR) ex vivo. Le cellule T umane sono incubate con biglie magnetiche rivestite con anticorpi anti-CD3 e anti-CD28, insieme a un terreno integrato con interleuchina-2 (IL-2), che porta all'attivazione e alla proliferazione delle cellule T. Vengono introdotti vettori lentivirali transgenici, che consentono all'RNA transgenico di integrarsi nel genoma ospite ed esprimere il transgene. Ciò si traduce in...

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Descriviamo un sistema quantitativo di analisi della citolisi in vitro in tempo reale per valutare la potenza delle cellule T del recettore dell'antigene chimerico che prendono di mira le cellule tumorali liquide e solide. Questo protocollo può essere esteso per valutare altre cellule echeggiatrici immunitarie, così come i trattamenti combinati.

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Qui, presentiamo un protocollo per l'editing genetico nelle cellule T umane primarie utilizzando la tecnologia CRISPR Cas per modificare le cellule CAR-T.

Produzione di cellule CAR-T umane ingegnerizzate CRISPR

Questo articolo descrive in dettaglio il processo di produzione delle cellule T del recettore dell'antigene chimerico per uso clinico, in particolare utilizzando un processore cellulare automatizzato in grado di eseguire la trasduzione virale e la coltivazione delle cellule T. Forniamo raccomandazioni e descriviamo le insidie che dovrebbero essere considerate durante lo sviluppo del processo e l'implementazione di uno studio clinico in fase iniziale.

Produzione di cellule T del recettore dell'antigene chimerico su un processore cellulare automatizzato

Questo protocollo semplifica la produzione di vettori retrovirali e la trasduzione delle cellule T murine, facilitando la generazione efficiente di cellule CAR-T di topo.

Generazione efficiente di cellule T del recettore chimerico murino dell'antigene (CAR)-T

Questo protocollo fornisce un flusso di lavoro semplificato per generare e testare cellule T regolatorie del recettore dell'antigene chimerico umano (CAR Tregs).

Generazione di cellule T regolatorie del recettore dell'antigene chimerico umano

Questo protocollo delinea una procedura dettagliata per la generazione di cellule T del recettore chimerico dell'antigene (CAR) transitorio utilizzando mRNA non integrato per l'immunoterapia del cancro e fornisce metodi affidabili per valutare le cellule CAR-T e la loro funzione citotossica.

Un approccio non virale per generare cellule T transitorie del recettore dell'antigene chimerico utilizzando l'mRNA per l'immunoterapia del cancro

Qui, descriviamo un metodo per creare goccioline a doppia emulsione che incapsulano una cellula T e una cellula bersaglio del cancro per esaminare l'uccisione cellulare a livello di singola cellula. Questo metodo consente la doppia quantificazione sia delle molecole citotossiche che dell'apoptosi delle cellule bersaglio all'interno di un'ampia popolazione di cellule T.

Saggio di citotossicità basato su goccioline per valutare le cellule T del recettore dell'antigene chimerico a livello di singola cellula

Questo protocollo descrive i passaggi essenziali per la coltivazione delle cellule T primarie, inclusi il loro isolamento, attivazione, espansione e trasfezione transitoria tramite elettroporazione dell'mRNA. Inoltre, viene proposto un flusso di lavoro e un pannello di anticorpi per l'analisi citometrica a flusso del fenotipo, dei marcatori di attivazione, della vitalità e dell'espressione del recettore antigenico chimerico (CAR).

Isolamento, coltivazione e trasfezione transitoria delle cellule T primarie umane per generare cellule T del recettore antigenico chimerico (CAR)

Scopri come generare CAR T cellule con competenza funzionale per l'immunoterapia adottiva. Questo metodo preserva la qualità cellulare durante la coltura, migliorando l'efficacia terapeutica contro i tumori solidi.

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