Scaffold di stampa Core/shell per l'ingegneria dei tessuti di strutture tubolari
27 settembre 2019
Presentato qui è un set-up biostampa tridimensionale semplice da usare, nucleo/guscio, tridimensionale per la fabbricazione in un solo passaggio di scaffold cavi, adatto per l'ingegneria tissutale di strutture vascolari e altre strutture tubolari.
La fabbricazione di strutture tubolari è un approccio promettente all'ingegneria tissutale delle reti vascolari, che rimane una delle principali sfide nella coltivazione di tessuti spessi in vitro. Il principale vantaggio della tecnica core/shell è la semplice produzione di impalcature a filamento cavo in un unico passaggio, riducendo i tempi di fabbricazione e potenzialmente consentendo la stampa diretta con le celle. Preparare una formulazione idrogel con le proprietà viscoelastiche appropriate e sostenere un flusso continuo bilanciato dei materiali nucleo/guscio è fondamentale per la stampa 3D di impalcature stabili.
Per iniziare, riempire la siringa sterile da 5 ml con idrogel appena preparato. Riempire una seconda siringa da 5 ml, dotata di un ago smussato calibro 27, con soluzione di reticolamento preparata al momento. Assemblare l'ugello nucleo/guscio.
Inserire un ago smussato G27 come componente del nucleo e fissare l'ago utilizzando la vite. L'ago interno dovrebbe sporgere a circa 1 mm dall'ugello esterno del guscio del nucleo. Collegare la siringa con la soluzione di retino all'ago G27 nell'ugello e caricare la siringa in uno dei supporti dell'estrusore di una stampante 3D sterilizzata con etanolo.
Montare la siringa con idrogel nel secondo estrusore e collegarla all'ugello. Utilizzare una serratura Luer per collegare un tubo corto all'ingresso laterale Luer dell'ugello del nucleo/guscio. Regolare manualmente l'allineamento fino a quando l'ugello non tocca la superficie prima di ritrarre l'ugello a una distanza pari al diametro esterno dell'ugello.
Importare il codice g dell'impalcatura generato e premere Riproduci per avviare il processo di stampa. Dopo la stampa, rimuovere con cura il substrato con l'impalcatura stampata e versare la soluzione di retiatura secondaria su tutta l'impalcatura. Incubare l'impalcatura per un minuto a temperatura ambiente.
Per staccare l'impalcatura dal substrato, tirare delicatamente l'impalcatura lateralmente. Se l'impalcatura aderisce fortemente al substrato, inserire un bordo affilato tra entrambi i materiali per separarli. Trasferire l'impalcatura in un contenitore fresco.
I raggi UV sterilizzano entrambi i lati dell'impalcatura per 30 minuti per lato. Quindi posizionare l'impalcatura in un mezzo di coltura cellulare incolore e incubare l'impalcatura a 37 gradi Celsius con anidride carbonica del 5% per almeno 24 ore. Il giorno dopo, raccogli l'huvex da una coltura in vitro con 0,25% di tripside per cinque minuti a 37 gradi Celsius.
Quando le cellule si sono staccate, interrompere la reazione enzimatica con 3 mL di mezzo di coltura cellulare fresco e raccogliere le cellule per centrifugazione. Sospendere il pellet in un mezzo di coltura fresco contenente rosso fenolo e diluire le cellule a una concentrazione di 3,4 volte 10 fino alla quinta endoteliale per concentrazione di millilitro. Caricare le cellule in una siringa sterile da 5 ml dotata di un ago calibro 27 e individuare un punto di ingresso nell'impalcatura.
Allineando l'ago con la sezione dritta del filamento dell'impalcatura, forare con cura l'impalcatura ad angolo basso. Verificare che l'ago si trova all'interno del filamento cavo del canale e deprimere delicatamente lo stantuffo per iniettare circa 1-2 mL di sospensione cellulare nell'impalcatura. Il flusso della sospensione dovrebbe essere visibile attraverso l'impalcatura traslucida.
Quando l'intera impalcatura è stata riempita con sospensione cellulare, immergere l'impalcatura in un mezzo di coltura cellulare fresco e restituire l'impalcatura all'incubatore di coltura cellulare per un massimo di 10 giorni. Per l'imaging vivo/morto alla fine dell'incubazione, sciacquare l'impalcatura con PBS e utilizzare un ago contundente per iniettare con cura soluzione viva / morta nell'impalcatura. Verificare che la soluzione abbia riempito l'intera impalcatura e posizionare l'impalcatura a 37 gradi Celsius per 30 minuti.
Al termine dell'incubazione, sciacquare l'impalcatura con PBS e trasferire con cura l'impalcatura su uno scivolo di vetro. Le cellule tinte possono quindi essere osservate nelle impalcature al microscopio a fluorescenza. In questa sezione trasversale di un'impalcatura appena stampata e post-lavorata, si può osservare un canale cavo chiaramente visibile all'interno del filamento.
Anche dopo 72 ore di incubazione nel mezzo di coltura cellulare a 37 gradi Celsius come dimostrato, il filamento mantiene la struttura cava per tutta la lunghezza dell'impalcatura. Qui, viene mostrato un saggio rappresentativo vivo / morto delle cellule endoteliali dopo 48 ore di coltura all'interno di un'impalcatura. Le cellule vive possono essere identificate dal loro segnale fluorescente verde brillante.
Questa tecnica è alla base della fabbricazione in un solo passaggio di impalcature tubolari cave e può essere aggiornata mediante stampa diretta utilizzando celle incorporate nel bio-inchiostro.
Panoramica
Questo articolo presenta una configurazione di biostampa tridimensionale core/shell per la fabbricazione in un unico passaggio di impalcature cave. Queste impalcature sono adatte per applicazioni di ingegneria tissutale, in particolare per strutture vascolari e tubulari.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Ingegneria dei tessuti
- Stampa biologica 3D
- Realizzazione di scaffold
Sfondo
- Lo sviluppo di strutture tubolari è fondamentale per creare reti vascolari in tessuti spessi.
- La biostampa core/shell consente una produzione efficiente di impalcature cave.
- Una corretta formulazione dell'idrogel e un adeguato controllo del flusso sono essenziali per una stampa 3D di successo.
- La stampa diretta con cellule può migliorare la funzionalità dell'impalcatura.
Scopo dello studio
- Dimostrare un metodo semplificato per la fabbricazione di scaffold cavi.
- Esplorare il potenziale dell'incorporazione diretta di cellule durante il processo di stampa.
- Fornire un protocollo dettagliato per la preparazione dello scaffold e il seminamento cellulare.
Metodi Utilizzati
- Preparazione di soluzioni di idrogel e di agenti di reticolazione.
- Assemblaggio di una punta a nucleo/guscio per la stampa 3D.
- Stampa di impalcature seguita da reticolazione secondaria.
- Coltura cellulare e semina all'interno delle impalcature stampate.
Risultati principali
- Scafolding cavi stampati con successo con una struttura stabile.
- Dimostrata un'efficace incorporazione e vitalità delle cellule all'interno degli scafolding.
- Canali cavi mantenuti lungo tutta la lunghezza dello scafolding dopo l'incubazione.
- Saggi di vitalità cellulare hanno confermato lo stato di salute delle cellule endoteliali negli scafolding.
Conclusioni
- La tecnica di biostampa core/shell permette una fabbricazione efficiente dello scaffold.
- La stampa diretta con cellule può migliorare la funzionalità degli scaffold.
- Questo metodo ha potenzialità per far progredire le applicazioni nell'ingegneria tissutale.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questo metodo di biostampa core/shell consente la fabbricazione in un unico passaggio di impalcature tubolari cave, affrontando un collo di bottiglia critico nell'ingegneria dei tessuti vascolari grazie alla riduzione della complessità e del tempo di produzione. L'approccio garantisce una previsione affidabile nella progettazione delle impalcature mediante la formazione riproducibile di canali cavi e la compatibilità con le procedure di semina cellulare. Tale tecnica si posiziona così come una piattaforma trasferibile per ridurre i rischi nello sviluppo precoce di costrutti vascolari nei percorsi preclinici.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Permette l'analisi di ipotesi sulla formazione di reti vascolari attraverso la fabbricazione precisa di scaffold cavi.
- Valore operativo: Riduce la necessità di prototipazione iterativa fornendo una struttura tubolare stabile e riproducibile in un unico passaggio di stampa.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Produce canali cavi standardizzati compatibili con saggi di vitalità basati su marcatori live/dead e fluorescenza.
- Valore operativo: Facilita un'agevole semina cellulare e la perfusione del mezzo, consentendo schermature scalabili del comportamento delle cellule endoteliali.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Supporta la modellizzazione di strutture tubulari rilevanti per le malattie mantenendo lumi perfondibili per periodi prolungati di coltura.
- Valore operativo: Permette una transizione senza interruzioni dalla fabbricazione del supporto all'inclusione cellulare e all'incubazione a lungo termine, senza compromettere la struttura.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nel percorso della scoperta consentendo la produzione precoce di impalcature vascolari, che orienta l'identificazione dei composti promettenti e la validazione preclinica attraverso letture strutturali e funzionali.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi sui percorsi angiogenetici mediante la fabbricazione di un microambiente tubolare controllato.
- Screening: Fornisce impalcature pronte all'uso con integrità quantificabile dei canali cavi per la valutazione dell'efficacia di composti o cellule.
- Analisi: Offre parametri misurabili come la pervietà dei canali e la vitalità cellulare per l'analisi comparativa tra diverse condizioni.
- Ricerca traslazionale: Mantiene continuità strutturale e funzionale dalla fase di scoperta alla validazione preclinica grazie al mantenimento stabile della cavità luminale.
- Riutilizzo aziendale: Rappresenta un sistema modulare di ugelli adattabile a diversi biomateriali e tipi cellulari, finalizzato alla standardizzazione a livello di piattaforma.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella progettazione di costrutti vascolari eliminando gli artefatti derivanti da processi di fabbricazione multi-step.
- Valore operativo: Migliora la riproducibilità e la produttività grazie a un'assemblea di ugelli sterile e compatibile con connettori Luer.
- Valore strategico: Riduce i tempi di de-risking biologico consentendo un'iterazione rapida delle progettazioni di impalcature tubolari.
- Impatto sul portafoglio: Supporta decisioni di avanzamento o interruzione nei programmi di ingegneria dei tessuti vascolari mediante una validazione strutturale precoce.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella reologia degli idrogel e nella cinetica del reticolaggio per la stampa stabile di strutture core/shell.
- È dipendente dalla compatibilità con stampanti 3D a doppia estrusione e da sistemi di gestione sterile dei fluidi.
- Necessita della standardizzazione delle portate e dell'allineamento delle nozzle tra diversi team per garantire coerenza tra i lotti.
- L'adattamento a biomateriali alternativi potrebbe richiedere la ricalibrazione dell'equilibrio tra le viscosità del core e dello shell.
- È limitato dalla risoluzione del diametro interno della nozzle, che vincola le dimensioni minime raggiungibili dei canali.
