Name: Etichettatura metabolica estremamente rapida e specifica dellRNA In Vivo con 4-Thiouracil (Ers4tU) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-22T14:30:00.000+00:00
Duration: 11 s
Description: Scopri un metodo rapido per purificare RNA appena sintetizzato in Saccharomyces cerevisiae usando uracile tiolato. Questa tecnica consente esperimenti pulse-chase con tempi di etichettatura brevi e basso rumore di fondo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Questo lavoro è stato sostenuto dal finanziamento Wellcome per JB [104648]. Il lavoro nel Wellcome Centre for Cell Biology è supportato dal finanziamento del nucleo del Wellcome [092076]. Gli autori riconoscono i membri del laboratorio per il loro aiuto: Bella Maudlin, Emanuela Sani, Susanna De Lucas-Arias e Shiney George. Gli autori ringraziano anche Patrick Cramer per il plasmide YEpEBI31111.

<ol><li>Duffy, E. E., Schofield, J. A., Simon, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gaining+insight+into+transcriptome-wide+RNA+population+dynamics+through+the+chemistry+of+4-thiouridine%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews%3A+RNA%22%5BJournal%5D)">Gaining insight into transcriptome-wide RNA population dynamics through the chemistry of 4-thiouridine.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 10 (1), e1513(2018).</li>
<li>Windhager, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrashort+and+progressive+4sU-tagging+reveals+key+characteristics+of+RNA+processing+at+nucleotide+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Ultrashort and progressive 4sU-tagging reveals key characteristics of RNA processing at nucleotide resolution.</a> Genome Research. 22, 2031-2042 (2012).</li>
<li>Baptista, T., Devys, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Saccharomyces+cerevisiae+Metabolic+Labeling+with+4-thiouracil+and+the+Quantification+of+Newly+Synthesized+mRNA+As+a+Proxy+for+RNA+Polymerase+II+Activity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity.</a> Journal of Visualized Experiments. (140), e57982(2018).</li>
<li>Barrass, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome-wide+RNA+processing+kinetics+revealed+using+extremely+short+4tU+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Transcriptome-wide RNA processing kinetics revealed using extremely short 4tU labeling.</a> Genome Biology. 16, 282(2015).</li>
<li>Burger, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((4-thiouridine+inhibits+rRNA+synthesis+and+causes+a+nucleolar+stress+response%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biology%22%5BJournal%5D)">4-thiouridine inhibits rRNA synthesis and causes a nucleolar stress response.</a> RNA Biology. 10, 1623-1630 (2013).</li>
<li>Mendoza-Ochoa, G. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fast+and+tuneable+auxin-inducible+degron+for+depletion+of+target+proteins+in+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast+%28Chichester+England%29%22%5BJournal%5D)">A fast and tuneable auxin-inducible degron for depletion of target proteins in budding yeast.</a> Yeast (Chichester England). 36 (1), 75-81 (2018).</li>
<li>Barrass, J. D., Mendoza-Ochoa, G. I., Maudlin, I. E., Sani, E., Beggs, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuning+degradation+to+achieve+specific+and+efficient+protein+depletion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Tuning degradation to achieve specific and efficient protein depletion.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2019).</li>
<li>Hobro, A. J., Smith, N. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evaluation+of+fixation+methods%3A+Spatial+and+compositional+cellular+changes+observed+by+Raman+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Vibrational+Spectroscopy%22%5BJournal%5D)">An evaluation of fixation methods: Spatial and compositional cellular changes observed by Raman imaging.</a> Vibrational Spectroscopy. 91, 31-45 (2017).</li>
<li>Gustilo, E. M., Vendeix, F. A. P., Agris, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((tRNA%27s+Modifications+Bring+Order+to+Gene+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">tRNA's Modifications Bring Order to Gene Expression.</a> Current Opinion in Microbiology. 11, 134-140 (2008).</li>
<li>Dolken, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+gene+expression+profiling+for+simultaneous+kinetic+parameter+analysis+of+RNA+synthesis+and+decay%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">High-resolution gene expression profiling for simultaneous kinetic parameter analysis of RNA synthesis and decay.</a> RNA. 14, 1959-1972 (2008).</li>
<li>Miller, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+transcriptome+analysis+measures+rates+of+mRNA+synthesis+and+decay+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">Dynamic transcriptome analysis measures rates of mRNA synthesis and decay in yeast.</a> Molecular Systems Biology. 7, 458(2011).</li>
<li>Schmitt, M. E., Brown, T. A., Trumpower, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+simple+method+for+preparation+of+RNA+from+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">A rapid and simple method for preparation of RNA from Saccharomyces cerevisiae.</a> Nucleic Acids Research. 18, 3091-3092 (1990).</li>
<li>Rädle, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+Labeling+of+Newly+Transcribed+RNA+for+High+Resolution+Gene+Expression+Profiling+of+RNA+Synthesis%2C+Processing+and+Decay+in+Cell+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Metabolic Labeling of Newly Transcribed RNA for High Resolution Gene Expression Profiling of RNA Synthesis, Processing and Decay in Cell Culture.</a> Journal of Visualized Experiments. (78), e50195(2013).</li>
<li>Herzog, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thiol-linked+alkylation+of+RNA+to+assess+expression+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Thiol-linked alkylation of RNA to assess expression dynamics.</a> Nature Methods. 14, 1198-1204 (2017).</li>
<li>Ohrt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+dissection+of+step+2+catalysis+of+yeast+pre-mRNA+splicing+investigated+in+a+purified+system%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Molecular dissection of step 2 catalysis of yeast pre-mRNA splicing investigated in a purified system.</a> RNA. 19, 902-915 (2013).</li>
<li>Alexander, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RiboSys%2C+a+high-resolution%2C+quantitative+approach+to+measure+the+in+vivo+kinetics+of+pre-mRNA+splicing+and+3%E2%80%B2-end+processing+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">RiboSys, a high-resolution, quantitative approach to measure the in vivo kinetics of pre-mRNA splicing and 3′-end processing in Saccharomyces cerevisiae.</a> RNA. 16, 2570-2580 (2010).</li>
<li>Wallace, E. W. J., Beggs, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extremely+fast+and+incredibly+close%3A+cotranscriptional+splicing+in+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Extremely fast and incredibly close: cotranscriptional splicing in budding yeast.</a> RNA. 23, 601-610 (2017).</li>
<li>Adelman, K., Lis, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promoter-proximal+pausing+of+RNA+polymerase+II%3A+emerging+roles+in+metazoans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Promoter-proximal pausing of RNA polymerase II: emerging roles in metazoans.</a> Nature Reviews Genetics. 13, 720-731 (2012).</li>
<li>Preker, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+Exosome+Depletion+Reveals+Transcription+Upstream+of+Active+Human+Promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA Exosome Depletion Reveals Transcription Upstream of Active Human Promoters.</a> Science. 322, 1851-1854 (2008).</li>
<li>Aslanzadeh, V., Huang, Y., Sanguinetti, G., Beggs, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+rate+strongly+affects+splicing+fidelity+and+cotranscriptionality+in+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Transcription rate strongly affects splicing fidelity and cotranscriptionality in budding yeast.</a> Genome Research. 28, 203-213 (2018).</li>
<li>Schofield, J. A., Duffy, E. E., Kiefer, L., Sullivan, M. C., Simon, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TimeLapse-seq%3A+adding+a+temporal+dimension+to+RNA+sequencing+through+nucleoside+recoding%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">TimeLapse-seq: adding a temporal dimension to RNA sequencing through nucleoside recoding.</a> Nature Methods. 15, 221-225 (2018).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questo articolo presenta un protocollo per l'etichettatura 4tU estremamente rapida e specifica, per il recupero dell'RNA nascente e sintetizzato da S. cerevisiae dopo appena 15 s di etichettatura, con contaminazione molto bassa da RNA senza etichetta.
L'utente deve sempre fare attenzione a mantenere l'integrità dell'RNA mediante l'uso di temperature fredde e reagenti trattati con DEPC. La purificazione del tallone Streptavidin è generalmente affidabile; tuttavia, il buffer di perline è difficile da gestire; deve essere fatto fresco, con i suoi componenti aggiunti nel giusto ordine, e non refrigerati o autoclaved. Le carenze più comuni includono l'incompleto dissolvimento dell'RNA dopo le fasi di precipitazione, e quindi non essendo biotinylato o altrimenti perso durante le fasi di lavorazione. C'è un ampio aiuto per la risoluzione dei problemi nel materiale supplementare.
Ci sono alcune limitazioni di cui essere a conoscenza in ers4tU. Uno già menzionato è che 4tU rallenta la crescita del lievito (Figura 1a). A parte gli RNA endogenamente tiolati9, solo gli RNA che sono stati trascritti durante il periodo di etichettatura possono essere purificati con questo metodo. Le polimerasi si sono fermate sui geni per tutto il tempo di tiolazione non produrranno trascrizioni tiolate che possono essere purificate, anche se le trascrizioni che sono parzialmente etichettate a causa di polimerasi che entrano o lasciano uno stato di pausa durante la diiolazione possono essere recuperate. I ceppi che trascrivono male, a causa di mutazioni o condizioni di crescita, producono poco nsRNA, anche se le tecniche qui utilizzate miglioreranno comunque il recupero di nsRNA rispetto ad altri metodi. In questi ceppi e condizioni possono essere necessari tempi più lunghi e volumi di coltura più elevati. Si noti che l'uracile è una buona fonte di azoto e quindi questo metodo dovrebbe essere sperimentato prima di essere utilizzato per studi che coinvolgono la fame di azoto.
Il protocollo ers4tU è particolarmente utile per l'analisi degli RNA di breve durata, molti dei quali sono così rapidamente degradati che non possono essere identificati senza paralizzare i meccanismi di degradazione. Gli esempi includono trascrizioni criptiche instabili (CUT)4e brevi trascrizioni prodotte dalla terminazione prematura o promotrice che si ferma18 e la trascrizione antisenso "a monte" da un promoter (PROMPT)19. Anche gli intermedi prodotti durante la lavorazione di specie di RNA stabili sono transitori, ma possono essere arricchiti utilizzando la trascrizione 4tU4. Il protocollo ers4tU è quindi eccezionale nel permettere alle specie di RNA altamente transitorie di essere analizzate e catturate in condizioni quasi fisiologiche, il che è un enorme vantaggio rispetto ad altri metodi. Questa tecnica è stata utilizzata per studiare la trascrizione e le cineci di elaborazione dell'RNA a valle nei mutanti di rna polimerasi che si allungano più velocemente o più lentamente del normale20.
Thiolation è anche compatibile con RNA-seq e SLAM-seq21, permettendo a tutto l'RNA prodotto in un tempo molto breve di essere caratterizzato in dettaglio squisito.

L'RNA ha una natura dinamica; subito dopo la produzione, molto RNA viene rapidamente elaborato e degradato. Attualmente, la maggior parte degli studi sul metabolismo dell'RNA analizza l'RNA cellulare totale, che è per lo più completamente elaborato e a livello di stato costante. Questo livello dipende dall'equilibrio tra i tassi di trascrizione, la maturazione post-trascrizione e la degradazione. L'analisi dei processi che portano all'equilibrio dello stato costante richiede tecniche specializzate per catturare specie di RNA di breve durata.
L'etichettatura metabolica dell'RNA con analoghi nucleotidici come 4-thiouracil (4tU) o 4-thiouridine (4sU) (vedi Duffy et al.1 per una recensione eccellente), offre la possibilità di isolare gli RNA nascenti e i loro intermedi di elaborazione. Tuttavia, i protocolli pubblicati comportano tempi di etichettatura di diversi minuti2,3, che è lento rispetto al tasso di produzione di molte trascrizioni. Ci vuole nell'ordine di un minuto per trascrivere il gene medio del lievito, quindi l'etichettatura dell'RNA di lievito per meno di un minuto può essere considerata estremamente breve. Il protocollo 4 tiouracil estremamente rapido e specifico (ers4tU) massimizza il rapporto segnale-rumore massimizzando l'incorporazione 4tU e riducendo al minimo il recupero di RNA preesistente senza etichetta rendendo possibili tempi di etichettatura molto brevi4.
La base tio-modificata deve essere importata nelle cellule rapidamente e in quantità sufficiente per etichettare in modo efficiente l'RNA appena sintetizzato (nsRNA). Per promuovere questo, le cellule sono coltivate in mezzo privo di uracil, e l'espressione di una permeasi appropriata aiuta ad aumentare l'assorbimento di 4tU o 4sU (vedi tabella 1 per un elenco di plasmidi che portano geni di permeasi adatti e Figura supplementare 1). La solubilità di 4tU nell'idrossido di sodio evita la necessità di solventi organici tossici richiesti da altri analoghi nucleotidi. Purtroppo, è stato osservato che le colture in crescita per lunghi periodi con nucleosides thio-modificati a concentrazioni superiori a 50 m sono state osservate interrompere i ribosomi5. Tuttavia, la concentrazione (10 M) utilizzata in questo caso, e i tempi di etichettatura estremamente brevi, riducono al minimo gli effetti deleteri5 (Figura1a), pur producendo RNA sufficiente per l'analisi.
Questa tecnica può essere combinata con un rapido e specifico esaurimento mediato dall'auxina di una proteina bersaglio6,7 ( Figura2), indicato come il protocollo "z-est AID 4U", in cui l'espressione regolata estradiolo dell'auxina sistema di degron inducibile (AID) è combinato con l'etichettatura 4tU. Con l'approccio di 8U, una proteina bersaglio può essere esaurita e l'effetto sul metabolismo dell'RNA attentamente monitorato (Figura2). La tempistica è fondamentale; si consiglia di visualizzare il video di accompagnamento e prestare molta attenzione alla figura 2 e la sua forma animata (vedere Figura supplementare 2).
L'elaborazione e la degradazione dell'RNA devono essere interrotte molto rapidamente per una risoluzione precisa del tempo. Questo si ottiene utilizzando il metanolo a bassa temperatura, che fissa il contenuto cellulare molto rapidamente e degrada la membrana cellulare preservando il contenuto di acido nucleico8. L'estrazione dell'RNA deve essere efficiente e non danneggiare l'RNA. La lisi meccanica è efficace in assenza di agenti caotropici (spesso questi contengono gruppi di thio, quindi dovrebbe essere evitato). È preferibile la precipitazione del cloruro di litio dell'RNA, in quanto i tRNA sono precipitati in modo meno efficiente. I tRNA sono rapidamente trascritti e naturalmente tiolati9, quindi la rimozione dei tRNA riduce la concorrenza per il reagente di biotinylazione. Se sono interessanti RNA piccoli e altamente strutturati, si raccomandano metodi di precipitazione dell'RNA a base di alcol.
Per recuperare l'RNA tiolato, la biotina è attaccata covalentmente attraverso i gruppi di thio incorporati nell'RNA con 4tU. L'uso di biotina modificata, che si attacca tramite un'obbligazione disulfide scissione (ad esempio, HPDP-biotin (N-[6-(Biotinamido)hexyl]-3 in quanto consente il rilascio dell'RNA aggiungendo un agente di riduzione. L'RNA biotinylato è purificato su streptavidina accoppiato a perline magnetiche. Questo protocollo è simile ad altri elencati in precedenza10, ma è stato intensamente ottimizzato per ridurre lo sfondo.
Ci sono due tipi di esperimento di thiol-labelling che possono essere eseguiti, l'etichettatura continua e discontinua. Ognuno ha i suoi vantaggi. Nell'etichettatura continua, il 4tU viene aggiunto alla coltura e ai campioni prelevati a intervalli regolari. Questo tipo di esperimento mostra come viene elaborato l'RNA e come i livelli cambiano nel tempo. Gli esempi includono il confronto di mutanti con esperimenti di tipo selvaggio e un esperimento di inseguimento a impulsi. Gli esperimenti illustrati nella figura 3b.c sono di questo tipo. Per l'etichettatura discontinua un cambiamento viene indotto nel sistema e nell'RNA monitorato. Una volta che il cambiamento è stato indotto la cultura deve essere divisa in diverse sotto-culture, e in momenti specifici, ognuno è poi thio-etichettato per un breve periodo. Un esempio è lo stato mostrato nella figura 27. Questo tipo di esperimento è particolarmente utile per monitorare l'effetto di un cambiamento metabolico sull'elaborazione dell'RNA (vedi Figura 3d).
Una rappresentazione grafica di un esperimento di etichette tio è presentata nella figura 4 e Figura 5e un foglio di calcolo che semplifica notevolmente le prestazioni del protocollo è disponibile (vedere modello di esperimento 4tU.xlsx). Oltre a questo, le informazioni supplementari contengono un'ampia guida alla risoluzione dei problemi. Per il protocollo di z-est AID 4U che integra l'etichettatura 4tU con il protocollo di deplezione dell'auxina, vedere Figura 2 e Figura supplementare 2. Vedere Barrass et al.7 per il protocollo dettagliato di esaurimento dell'AID.

<table><tbody><tr><td>&beta;-mercaptoetanolo (&beta; ME)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td>ATTENZIONE tossico. Le soluzioni madre sono circa 14 M, effettuare a 1/20 diluizione per l'uso</td></tr><tr><td>Cloroformio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>25668</td><td>ATTENZIONE tossico</td></tr><tr><td>Pirocarbonato di dietil (DEPC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5758</td><td>aggiungere 1/1000 volume a una soluzione, lasciare a temperatura ambiente per 24 ore, quindi autoclave</td></tr><tr><td>DMF (N,N-dimetilformammide)</td><td>&nbsp; Sigma-Aldrich</td><td>227056</td><td>ATTENZIONE</td></tr><tr><td>EDTA</td> tossico <td>Sigma-Aldrich</td><td>3609</td><td>Fare 0,5 M e pH a 8,0 con idrossido di sodio</td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>29221</td><td></td></tr><tr><td>EZ-link HPDP Biotina</td><td>Termo scientifico</td><td>21341</td><td>Conservare al riparo dalla luce. Sciogliere tutto il contenuto del flaconcino in 22,7 mL di DMF (per ottenere una soluzione madre da 4 mM). Conservare lontano dall'acqua, al buio e a -20 &deg;C. Controllare la soluzione prima dell'uso, poiché alcuni lotti di HPDP precipitano in magazzino; calore a 42 &deg; C per ririprendere.</td></tr><tr><td>Glucosio</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>G/0500/60</td><td></td></tr><tr><td>Glicogeno [20 mg/mL]</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10901393001</td><td>Conservare a -20 gradi C</td></tr><tr><td>Gel riducente disolfuro TCEP immobilizzato</td><td>Thermo Scientific</td><td>77712</td><td>Soluzione opzionale</td></tr><tr><td>LiCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>793620</td><td>10 M. ATTENZIONE: questo diventa molto caldo man mano che si scioglie e può anche bollire a più di 100 oC, aggiungere lentamente i cristalli di LiCl all'acqua.</td></tr><tr><td>Cloruro di magnesio (MgCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63033</td><td>1 M soluzione. ATTENZIONE: questo diventa molto caldo man mano che si scioglie e può anche bollire a più di 100 oC, aggiungere lentamente i cristalli di MgCl2 all'acqua.</td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>Fisher Scientific</td><td>M/4000/PC17</td><td>ATTENZIONE Tossico e infiammabile</td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3139</td><td>Preparare 1 M di soluzioni di ciascuna e mescolare in quantità uguale per ottenere una soluzione del pH appropriato</td></tr><tr><td>Na2HPO4Sigma-Aldrich</td><td></td> <td>S3264</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888-M</td><td>Soluzione 5 M</td></tr><tr><td>Fenolo, pH basso. &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4682</td><td>Conservare al buio a 4 °C. ATTENZIONE tossico</td></tr><tr><td>Fenolo Cloroformio 5:1 (125:24:1) basso pH.</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1944</td><td>Conservare al buio a 4 &deg;C. ATTENZIONE tossico</td></tr><tr><td>Pierce Spin Columns</td><td>Thermo Scientific</td><td>69702</td><td></td></tr><tr><td>Opzionale SCSM singolo drop-out &ndash; ura</td><td>Formedium&nbsp;</td><td></td><td></td>DSCS101</tr><tr><td>Acetato di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>32318-M</td><td>Preparare una soluzione 3 M e pH a 5,3 con acido acetico</td></tr><tr><td>Idrossido di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>795429</td><td>ATTENZIONE corrosivo</td></tr><tr><td>SDS (Sodio dodecil solfato)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>436143</td><td>ATTENZIONE irritante, non inalare</td></tr><tr><td>Streptavidin Perle magnetiche</td><td>NEB</td><td>1420S</td><td>Conservare a 4 gradi; C&nbsp;</td></tr><tr><td>SUPERasi-In, inibitore della RNasi</td><td>Tecnologie per la vita&nbsp;</td><td>AM2696</td><td>Negozio a -20&deg; C</td></tr><tr><td>Schizosaccharomyces pombe per la spiga</td><td></td><td></td><td>Vedere la sezione 1.7 del protocollo</td></tr><tr><td>4-tiouracile (4tU)&nbsp;</td><td>ACROS ORGANICS</td><td>359930010</td><td>Conservare al buio. Produci 100 mM di stock in 1 milione di NaOH, conserva le soluzioni a -20 gradi C.</td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93362</td><td>1 M soluzioni a vari pH</td></tr><tr><td>tRNA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10109541001</td><td>5mg/ml, conservare a -20 gradi; C</td></tr><tr><td>Uridina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U3750</td><td>Produrre 1 soluzione M in H2O. Dividere in aliquote da 2 mL e conservare a -20 C.</td></tr><tr><td>Lievito base azotata senza aminoacidi con solfato di amnio</td><td>Formedium</td><td>CYN0410</td><td></td></tr><tr><td>Zeba Colonne 0,5ml</td><td>Thermo Scientific</td><td>89882</td><td>Conservare a 4 gradi C&nbsp;</td></tr><tr><td>Perle di zirconia</td><td>Thistle Scientific</td><td>110791052</td><td></td></tr><tr><td>Attrezzature e materiali di consumo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Beadbeater</td><td>Biospec</td><td>112011EUR</td><td>Possono essere utilizzati altri omogeneizzatori; devono essere stabilite le condizioni corrette per ogni omogeneizzatore e ceppo.</td></tr><tr><td>Bioanalizzatore (Agilent) o similare per valutare la qualità dell'RNA. Se questo non è importante, uno spettrofotometro è utile per quantificare l'RNA.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga: in grado di far girare colture a 4 gradi C e almeno 3000 g. Se possibile, pre-raffreddare.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga: in grado di centrifugare fino a 2 mL di provette a velocità variabili fino a 13.000 g e fino a 1000 g.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rack magnetico per separare le perle dal campione. Quello utilizzato nella carta è stampato in 3D, disponibile da Thingiverse (thing:3562952). Esistono rack disponibili in commercio&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Macchina per PCR con coperchio riscaldato che consente l'incubazione al buio.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rotella rotante per ruotare provette da 1,5 mL da un'estremità all'altra&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Si consiglia di agitare il blocco riscaldante (come Eppendorf Thermomixer)&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Provette da centrifuga, a bassa ritenzione, senza RNasi 0,5mL</td><td>Eppendorf</td><td>H179467N</td><td></td></tr><tr><td>Provette da centrifuga, a bassa ritenzione, senza RNasi 1,5mL</td><td>Ambion</td><td>AM12350</td><td></td></tr><tr><td>Tubes, centrifuga, 50 mL&nbsp;</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.004</td><td>Altre provette da centrifuga non sono a prova di gas consentendo a CO2 di dissolversi nel metanolo, questo esce vigorosamente dalla soluzione aggiungendo coltura calda, portando alla perdita di campione</td></tr><tr><td>Provette per centrifuga, 15 mL</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.001</td><td></td></tr><tr><td>Provette, 2 mL, tappo a vite</td><td>Greiner</td><td>723361</td><td></td></tr><tr><td>Provette da 0,2 mL striscia da 8 con coperchi integrati</td><td>Marca</td><td>781332</td><td></td></tr></tbody></table>

etichettatura metabolica estremamente rapida e specifica dell'rna in vivo con 4-thiouracil (ers4tu)

Extremely Rapid and Specific Metabolic Labelling of RNA In Vivo with 4-Thiouracil (Ers4tU)

L'analogo nucleotide, 4-thiouracil (4tU), è prontamente assorbito dalle cellule e incorporato nell'RNA come viene trascritto in vivo, consentendo l'isolamento dell'RNA prodotto durante un breve periodo di etichettatura. Questo viene fatto attaccando una moiety biotina al gruppo thio incorporato e purificando l'affinità, utilizzando perline rivestite di streptavidin. Raggiungere un buon rendimento di RNA puro, appena sintetizzato, privo di RNA preesistente, rende possibili tempi di etichettatura più brevi e consente una maggiore risoluzione temporale negli studi cinetici. Questo è un protocollo per la purificazione molto specifica e ad alto rendimento dell'RNA appena sintetizzato. Il protocollo qui presentato descrive come l'RNA viene estratto dal lievito Saccharomyces cerevisiae. Tuttavia, il protocollo per la purificazione dell'RNA tiolato dall'RNA totale dovrebbe essere efficace usando l'RNA da qualsiasi organismo una volta che è stato estratto dalle cellule. L'RNA purificato è adatto per l'analisi da parte di molte tecniche ampiamente utilizzate, come la trascrizione inversa-qPCR, RNA-seq e SLAM-seq. La specificità, la sensibilità e la flessibilità di questa tecnica consentono una conoscenza senza precedenti del metabolismo dell'RNA.

Le rese tipiche per nsRNA recuperate utilizzando questo protocollo ers4tU sono mostrate nella Figura 1b, questo è stato prodotto da un bioanalizzatore e la traccia mostra la resa di RNA contro dimensione (nucleotidi [nt]). Si noti, sia nel grafico della traccia bio-analizzata che in quella a incisione, il recupero dell'RNA dal punto di tempo 0 è una porzione molto piccola di quella recuperata da periodi di tempo più lunghi - circa 0,3 g di RNA recuperata da circa 109 cellule rispetto a oltre il doppio dopo soli 30 s di etichettatura (0,8 g di nsRNA) dallo stesso numero di cellule. Il recupero di RNA a 15 s è più variabile in quanto piccole differenze nell'esecuzione del campionamento hanno un effetto proporzionalmente maggiore sul recupero dell'RNA. Nella traccia bio-analizzatore, i precursori del rRNA possono essere visti come un picco vicino a 1000 nt e un doppietto di picchi a 1700-1800 nt. L'abbondanza di questi intermedi aumenta man mano che la tiola continua.
L'etichettatura Thio è stata utilizzata per quantificare lo splicing della trascrizione ACT1 (Figura 3). È stata eseguita la lite e sono stati prelevati campioni prelevati a intervalli di 15 s dall'inizio dell'etichettatura e dall'elaborazione dell'RNA ACT1 monitorato (Figura 3a,b). Come si può vedere, il pre-mRNA viene generato (per trascrizione) e le lariats (dal primo passo dello splicing dal pre-mRNA), anche dopo solo 15 s di etichettatura. Dopo circa 45 s a 1 min, le quantità di lariats e pre-mRNA raggiungono l'equilibrio con la maggior parte di queste specie di RNA create dalla trascrizione come vengono elaborate via dalla splicing.
Per produrre i dati mostrati in Figura 3c il ceppo è stato pulsato con 4tU per 25 s e poi inseguito con uridina. La generazione di pre-mRNA e lariati raggiunge un massimo a 1 minuto. Questo si confronta bene con la figura 3b; il massimo raggiunto dopo 45 s per raggiungere l'equilibrio più le 25 s dell'etichettatura. Dopo il picco, i livelli diminuiscono con gli RNA tio-etichettati vengono inseguiti attraverso il processo di giunzione.
La figura 3d mostra l'esaurimento di un fattore di giunzione delle proteine e il suo effetto sul metabolismo dell'RNA, utilizzando il sistema AID 4U6,7. Qui, Prp16p è ridotto da livelli quasi fisiologici al 5% di questo livello dopo 25 min di esaurimento. Prp16p è un fattore di giunzione essenziale per la seconda fase di giunzione15. I lariati vengono rimossi durante la seconda fase della giunzione (Figura 3a), ma qui aumentano al di sopra del livello di pre-mRNA come Prp16 diventa limitante. In tempi di esaurimento successivi, altri fattori diventano limitanti a causa di effetti secondari, in modo che i livelli di diminuzione lariat e i livelli di pre-mRNA aumentino. Il livello di mRNA spliced diminuisce.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59952/59952fig1.jpg"> Figura 1: Crescita nel 4TU e nel recupero dell'RNA. (a) 4-thiouracil influisce sulla crescita. Aumentando la concentrazione di 4tU nel mezzo di crescita drop-out YMM senza uracil aumenta il tempo di raddoppio di S. cerevisiae (BY4741) portando il p4FuiPUp plasmide. La crescita di quattro colture di replica è stata monitorata a 30 gradi centigradi in un Tecan Infinite Pro 200. Tutte le impostazioni cultura erano in fase di log in tutto, con OD600 tra 0.1 e 0.6. Mock è una cultura di controllo con una quantità equivalente di NaOH aggiunto, che di per sé non cambia il tasso di crescita. Questo grafico dimostra che l'etichettatura tio è un compromesso tra l'etichettatura rapida e i danni alla cellula. Le barre di errore sono un errore standard di 4 repliche. (b) la resa di nsRNA aumenta linearmente da circa 15 s di etichettatura. La figura principale mostra le tracce bioanalizzate di nsRNA purificato da 0 (non tiolato) a 2 min dopo l'aggiunta di 4tU a intervalli di 15 s. Si noti che il campione 15 s non viene visualizzato, in quanto non è stato distinguibile dal campione senza etichetta. I due grandi picchi corrispondono agli RNA ribosomici (rRNA). I precursori di rRNA e gli intermedi sono visibili in quanto diversi picchi con un peso molecolare maggiore rispetto ai rRNA maturi. Il recupero di questi precursori e intermedi aumenta con il tempo. Vengono mostrati i risultati di un esperimento rappresentativo. Il grafico a instacono mostra il recupero di nsRNA con incubazione crescente con 4tU. La resa di nsRNA aumenta con l'aumento del tempo di crescita con 4tU. Il recupero è straordinariamente lineare (R2 - 0,934) durante la scala cronologica di questo esperimento e mostra un leggero aumento rispetto allo sfondo anche a 15 s etichettatura con 4tU anche se non distinguibile dal campione senza etichettato a occhio dal bio/analizzatore trovare. Le barre di errore mostrano un errore standard per tre repliche biologiche. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59952/59952fig1large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59952/59952fig2.jpg"> Figura 2: Protocollo grafico 8U 4U 4U AID 4U. Una sintesi grafica del protocollo del protocollo DI zest AID 4U. Il sistema di degron auxina (AID) che a sua volta esaurisce una proteina bersaglio marcata con AID, si riferisce a Barrass et al.7 per un protocollo dettagliato. In questo caso, l'espressione del sistema di degron viene avviata 25 minuti prima dell'inizio della degradazione delle proteine e la diiolazione in ogni punto temporale è per 1 min. Una versione animata viene visualizzata nella Figura 2 supplementare. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59952/59952fig2large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59952/59952fig3v2.jpg"> Figura 3: Precursori e intermedi dello splicing dell'RNA ACT1. L'aglicing delle trascrizioni pre-mRNA ACT1 è stato monitorato dalla trascrizione inversa quantitativa PCR16. I livelli di precursore di ACT1 (pre-mRNA), lariat-exon2 intermedio (Lariat) e prodotto spliced (mRNA) sono mostrati normalizzati rispetto al livello di ACT1 Exon2 e livelli di stato costante di questi RNA. (a) Posizione dei prodotti qPCR nella trascrizione ACT1. Schematico delle posizioni dei prodotti qPCR utilizzati per testare i livelli di precursori, intermedi e prodotti della reazione di giunzione delle trascrizioni ACT1 16. Gli esoni sono rappresentati da scatole, intron come una linea e i prodotti qPCR come linee con diamanti a entrambe le estremità, il colore corrisponde a quelli utilizzati nei grafici. La PCR pre-mRNA è specifica per il pre-mRNA e non per eventuali intermedi dello splicing in quanto questo prodotto attraversa il punto di diramazione che viene interrotto dopo il primo passaggio di giunzione. Lariat PCR rileverà il prodotto della prima fase di giunzione e la lariat eccitata prodotta dopo la seconda. L'mRNA PCR è specifico per il prodotto della giunzione, mRNA. I risultati della PCR esone (presenti in tutti i precursori, intermedi e prodotti, ad eccezione del lariato asforsato) non sono mostrati nei grafici in quanto questi sono stati utilizzati per normalizzare i dati ed è quindi sempre uguale a 1. (b) Tiolabelling continuo. La quantità di pre-mRNA aumenta con il tempo come 4tU è incorporata dalla trascrizione e, dopo un breve ritardo, lo splicing lo converte in prodotti intermedi e spliced lariat-els. I livelli di queste specie pre-mRNA e lariat sono rilevabili sopra lo sfondo dopo appena 15 s di crescita con 4tU e raggiungono un massimo dopo circa 45 s di etichettatura continua con 4tU, a quel punto la loro produzione è bilanciata dalla conversione in giunzione mRNA e/o degradazione. I valori vengono normalizzati allo stato stazionario (punto più a sinistra del grafico) e i livelli di exon 2 per mostrarne l'aspetto e l'elaborazione rispetto alla trascrizione dell'esone 2. Poiché lo splicing di RNA di ACT1 è in gran parte co-trascrizione4,17 mRNA spliced diventa rapidamente la specie più abbondante, il suo livello è simile a quello di exon 2. Errore standard di tre repliche biologiche, ognuna saggiata in triplice copia. (c) Impulso/inseguimento. Thiolation impulso di 25 secondi seguito da inseguimento con uridina. Rispetto ai livelli di stato costante di questi RNA (punto più a sinistra), sono inizialmente molto abbondanti nel pool appena sintetizzato. I livelli diminuiscono gradualmente man mano che vengono trasformati in mRNA (o degradati), avvicinandosi a livelli molto simili a quelli dello stato costante di 5 min. (d) nsRNA e esaurimento proteico. Splicing di trascrizioni pre-mRNA ACT1 monitorate dalla trascrizione inversa quantitativaPCR come nel pannello (a ) dopo l'esaurimento della proteina Prp16 utilizzando il sistema di degron di auxina come descritto nella Figura 2. I livelli di proteina Prp16 vengono visualizzati anche nel grafico tracciato rispetto al secondo asse Y come percentuale dei livelli precedenti all'esaurimento dell'auxina. La Prp16 è una componente vitale dello spliceosome, particolarmente importante perla seconda fase di giunzione mostrata nel pannello (a ), dopo di che i lariati vengono degradati. Quando questo passaggio diventa lariats limitante si accumulano inizialmente. In momenti successivi lo splicing fallisce completamente, i lariati non vengono più prodotti e i livelli pre-mRNA aumentano. Le barre di errore sono un errore standard di tre repliche biologiche, ognuna delle quali è stata saggiata in triplice copia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59952/59952fig3large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59952/59952fig4.jpg"> Figura 4: Riepilogo grafico delle sezioni di protocollo da 1 a 3. Le cellule sono tiolate con 4tU e hanno permesso di crescere per incorporare il nucleotide modificato nell'RNA. È possibile aggiungere un picco S. pombe tiolato per consentire la normalizzazione attraverso punti temporali ed esperimenti. L'impulso di 4tU può essere inseguito utilizzando uridina non thiolated. L'etichettatura può essere eseguita continuamente dall'aggiunta di 4tU o da un cambiamento alle condizioni di crescita, la divisione culturale e 4tU viene aggiunta alle culture in tempi crescenti a partire dal cambiamento della condizione di crescita, ma ogni etichettatura solo per un breve periodo di tempo. Le cellule vengono raccolte e l'RNA preparato dalle cellule, preferibilmente utilizzando un omogeneizzatore e metodi a base di fenolo. L'RNA è biotinylato e quindi l'RNA biotinylato purificato dalla biotina non incorporata utilizzando una colonna di esclusione delle dimensioni. Il nsRNA è ora pronto per la purificazione con perline di streptavidina (sezione 4, Figura 5). I numeri in rosso corrispondono ai numeri di passo nel protocollo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59952/59952fig4large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59952/59952fig5.jpg"> Figura 5: Riepilogo grafico della sezione 4 del protocollo. A seguito delle sezioni da 1 a 3 (Figura 4), le perle di streptavidina vengono bloccate e il campione di RNA biotinylato viene aggiunto alle perline preparate. L'RNA biotinylato si lega alle perle di streptavidina e all'RNA non biotinylated rimosso e lavato. L'RNA biotinylato viene eluito dalle perline utilizzando il file .ME e precipitato pronto per ulteriori ricerche. I numeri in rosso corrispondono ai numeri di passo nel protocollo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59952/59952fig5large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Figura supplementare 1: Miglioramento del recupero di nsRNA da cellule di lievito con e senza copie aggiuntive dell'importatore a 1 e 3 minuti di tio-etichettatura. Si noti che Fui1 è il promotore del lievito espresso da un plsmide di 2 m. La copia genomica di questo gene è presente in entrambi questi ceppi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59952/Figure_S1.ai">Fare clic qui per scaricare questo file.</a>
Supplementare Figura 2: Versione animata del protocollo grafico AID 4U 4U 4U. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59952/Figure_S2_Best-AID_4U.mp4">Fare clic qui per scaricare questo file.</a>
File supplementare 1: 4tU_experiment_template.xltx. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59952/4tU_experiment_template.xltx">Fare clic qui per scaricare questo file.</a> 
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Nome Plasmid</td>
			<td>Importatore/permeasi</td>
			<td>pennarello</td>
			<td>commento</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>p4Fui</td>
			<td>
S. cerevisiae Fui1</td>
			<td>URA3</td>
			<td rowspan="2">Fui1 importa Uracil e Uridina, rendendolo ideale per esperimenti pulse/chase.</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>pAT2</td>
			<td>
S. cerevisiae Fui1</td>
			<td>LEU2</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>p4Fui -- PEST</td>
			<td>
S. cerevisiae Fui1</td>
			<td>URA3</td>
			<td>Il motivo PEST di Fui1 è stato disattivato, quindi la permeasi non è degradata quando c'è sufficiente uracile intracellulare per le esigenze della cellula. Funziona bene negli esperimenti di etichettatura e migliora le prestazioni di impulso/inseguimento.</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>p4Fur</td>
			<td>
S. cerevisiae Pelliccia4</td>
			<td>URA3</td>
			<td>Uracil permeasi</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">YEpEBI311</td>
			<td>H. Sapiens ENT1</td>
			<td rowspan="2">LEU2</td>
			<td rowspan="2">Miller etal. Contiene anche un gene della chinasi della timina.</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>(trasportatore nucleoside equilibrato)</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">Tutti i plasmidi sono a base di 2 m. Tutti i plasmidi p4 e pAT sono basati sul pRS16 serie di plasmidi. FUI1 e FUR4 sono espressi dai propri promotori endogeni.</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1: Plasmidi utilizzati con questo protocollo.

L'uso di uracil tiolato per purificare in modo sensibile e specifico l'RNA appena trascritto dal lievito Saccharomyces cerevisiae.

Etichettatura metabolica estremamente rapida e specifica dell'RNA In Vivo con 4-Thiouracil (Ers4tU)

The nucleotide analogue, 4-thiouracil (4tU), is readily taken up by cells and incorporated into RNA as it is transcribed in vivo, allowing isolation of ...

Questo metodo è significativo perché nessun altro protocollo permette di analizzare l'RNA appena sintetizzato in una scala di tempo così breve, e consente esperimenti di inseguimento a impulsi con un impulso così breve. Questo protocollo funziona bene con l'esaurimento proteico, come il protocollo Best AID 4U. Il vantaggio principale è che lo sfondo è basso.Ciò consente tempi di etichettatura brevi, rimuovendo quasi tutti gli RNA non teolati. Il protocollo scritto descrive anche molti tipi diversi di esperimenti che potrebbero essere eseguiti e come integrarli in questa tecnica. Per iniziare questa procedura, coltivare lievito in mezzo YMM a un OD 600 compreso tra 0,6 e 0,8.In una cappa aspirante aggiungere un metanolo equivalente al 30-50% del volume del campione previsto in un tubo da 50 millilitri. Chiudere saldamente i tubi, etichettarli e metterli sul ghiaccio secco per raffreddare. Successivamente, etichettare due tubi millilitro per la conservazione a lungo termine dei campioni e posizionare sul ghiaccio per raffreddare.Aggiungere perline di zirconia ai due tubi millilitro. Raffreddare almeno un millilitro di acqua per campione sul ghiaccio. Se si deve aggiungere un picco S.pombe alla coltura, posizionare un'aliquota di cellule S.pombe tiolate sul ghiaccio per scongelarsi.Vortice l'aliquota scongelata e aggiungerla alla cultura. Quindi aggiungere 4tU alla coltura ad una concentrazione di 10 micromolare e mescolare vigorosamente. Thio-label per un periodo di tempo compreso tra 15 secondi e cinque minuti.Prelevare campioni della coltura a intervalli regolari fino alla fine del corso di tempo. Aggiungere ogni campione a uno dei tubi di centrifuga preparati contenenti metanolo. Sigillare ogni tubo, agitare per mescolare accuratamente e posizionare sul ghiaccio secco.Una volta prelevati tutti i campioni, metterli tutti sul ghiaccio. Assicurarsi che nessuno dei campioni si sia congelato. Se qualcuno si è congelato, scaldarli delicatamente nella mano mentre si inverte costantemente.Centrifugare le cellule a 3.000 volte g e a quattro gradi Celsius per due minuti per pellettare le cellule. Versare il liquido e rimescolare il pellet in almeno un millilitro di acqua ghiacciata tubazione vigorosa su e giù. Trasferire la sospensione sul tubo del tappo a vite preparato e posizionare il tubo sul ghiaccio.Centrifugare brevemente i campioni ad una velocità superiore a 13.000 volte g per ri-pellettare le cellule. Quindi rimetterli sul ghiaccio e rimuovere il liquido. In primo luogo, aggiungere 400 microlitri di tampone AE, 40 microlitri di SDS e 800 microlitri di fenolo a basso pH.Resuspend con vortice per 10 secondi. Quindi lisci le cellule in un omogeneizzatore per tre raffiche di due minuti all'impostazione di potenza più bassa. Lasciare i campioni sul ghiaccio per due minuti tra gli impulsi di omogeneizzazione.Posizionare le cellule lisci sul ghiaccio secco per cinque minuti fino a quando non si solidifica. Quindi, utilizzare un microcentrifugo per far girare le cellule a una velocità superiore a 13.000 volte g per cinque minuti a temperatura ambiente. Successivamente, eseguire l'estrazione cloroformio del fenolo e l'estrazione cloroformio come delineato nel protocollo di testo.Aggiungere tra 1/3 e 1/2 del volume di 10 cloruro di litio molare e mescolare per far precipitare l'RNA. Centrifuga a una velocità superiore a 13.000 volte g per cinque minuti. Rimuovere il fluido e ri-ruotare brevemente il campione per rimuovere le feccia.Quindi, lavare il pellet con da 300 a 500 microlitri di 70%etanolo. Centrifugare brevemente il pellet lavato e rimuovere l'etanolo rimanente. Sciogliere di nuovo il pellet di RNA in 90 microlitri di TE a un pH 7.0 riscaldandosi a 65 gradi Celsius mentre si trema.Dopo aver controllato la solubilizzazione completa dell'RNA, trasferire la sospensione in un tubo da 0,2 millilitri. Per iniziare, biotinilato aggiungendo 10 microlitri di soluzione di HPDP-biotina all'RNA e mescolare accuratamente. Incubare al buio a 65 gradi Celsius per 15-30 minuti.Quindi, preparare un piccolo volume di resina, colonna di esclusione delle dimensioni per escludere la biotina non incorporata. Rimuovere l'etichetta inferiore della colonna, allentare il cappuccio e posizionare la colonna in un tubo di centrifuga a due millilitri. Centrifuga a 1.500 volte g per un minuto per stanare il tampone e scartare il flusso.Quindi aggiungere delicatamente 0,3 millilitri di TE nella parte superiore della colonna e ruotare di nuovo usando le stesse condizioni. Trasferire la colonna lavata in un tubo fresco da 1,5 millilitri. Al termine dell'incubazione del campione, aggiungere il campione nella parte superiore della colonna.Centrifuga a 1.500 volte g per due minuti, lasciando il campione di RNA biotinilato nella parte inferiore del tubo. Scartare la colonna. E aggiungere da 1/3 a 1/2 volume di 10 cloruro di litio molare al tubo contenente il campione.Mescolare per far precipitare di nuovo l'RNA. In primo luogo, sciogliere di nuovo l'RNA in 200 microlitri di acqua trattata con DEPC. Misurare la concentrazione di RNA e calcolare i volumi per ogni campione che darà uguali quantità di RNA per tutti i campioni.Aggiungere questa quantità di RNA a un tubo fresco e aggiungere acqua trattata con DEPC fino a un volume totale di 200 microlitri. Quando un campione è a temperatura ambiente, aggiungere 25 microlitri di tampone NaTM 10 x, 25 microlitri di un fosfato di sodio molare e 2,5 microlitri di 10%SDS. Mescolare accuratamente e centrifugare delicatamente a circa 100 volte g per meno di 30 secondi.Preparare due millilitri di tampone di perline per ogni campione con un tampone natm x, 0,1 fosfato di sodio molare e 0,1%SDS. Aggiungere 50 microlitri di perline di streptavidina a un tubo a bassa ritenzione da 1,5 millilitri. Posizionare il tubo sul rack magnetico e attendere che le perline si sistemino.Quindi, rimuovere il fluido per aspirazione. Per lavare le perline, aggiungere 200 millilitri di tampone di perline e vortice fino a quando il pellet di perline non viene completamente rimorsinato. Centrifugare il tubo a circa 100 volte g per un massimo di cinque secondi.Posizionare il tubo nel rack magnetico per consentire alle perline di essere catturate dal magnete. Rimuovere il fluido per aspirazione se ci sono un piccolo numero di campioni. Versare il fluido e quindi aspirare se ci sono molti campioni.Blocco con 200 microlitri di tampone di perline, 10 microlitri di glicogeno e 2,5 microlitri di tRNA. Incubare a temperatura ambiente per 20 minuti ruotando fine su fine a velocità moderata. Successivamente, rimuovere il fluido e lavarlo di nuovo, come indicato nel protocollo di testo.Riprestare le perline nel campione e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti durante la rotazione. Durante questa incubazione, preparare un tubo fresco da 1,5 millilitri per ogni campione. Aggiungere 1/10 volume di tre acetati molari di sodio a pH 5.3 e 20 microgrammi di glicogeno.Centrifuga a circa 100 volte g per tre secondi. Rimuovere l'RNA non associato dalle perline e lavarlo come indicato nel protocollo di testo. Per eludere l'RNA, aggiungere 50 microlitri di 0,7 beta mercaptoetanolo molare appena preparato alle perline.Dopo il vortice e la centrifugazione, posizionare il liquame nel rack magnetico. Pipettare l'RNA contenente la soluzione nei tubi di centrifuga da 1,5 millilitri preparati. Elute ancora una volta come descritto in precedenza.Quindi, riposizionare il campione nel rack magnetico per rimuovere le perline residue dall'RNA eluitato e trasferire il fluido in un tubo di centrifuga fresco e a basso legame da 0,5 millilitri. Mescolare il campione. E poi aggiungere 2,5 volumi di etanolo per far precipitare l'nsRNA.Dopo la miscelazione e l'incubazione, centrifugare ad una velocità di almeno 13.000 volte g e a quattro gradi Celsius per 20 minuti. Le rese tipiche per lo snRNA recuperato utilizzando questo protocollo sono mostrate qui. Si noti che il recupero dell'RNA al punto zero del tempo è una porzione molto piccola di quella recuperata da punti di tempo più lunghi con solo 0,3 microgrammi di RNA recuperati da circa 30 miliardi di cellule.Dopo soli 30 secondi di etichettatura, tuttavia, oltre il doppio dell'RNA viene raccolto dallo stesso numero di cellule. Nella traccia del bioanalyzer, i nostri precursori dell'RNA possono essere visti come un picco vicino a 1.000 nucleotidi e un farseto di picchi a 1.700 a 1.800 nucleotidi. L'abbondanza di questi intermedi aumenta man mano che la tiolazione continua.La tiolazione viene quindi eseguita con campioni prelevati a intervalli di 15 secondi dall'inizio dell'etichettatura tio e viene monitorata l'elaborazione della trascrizione dell'RNA ACT1. Come si può vedere pre-mRNA e lariat vengono generati anche dopo soli 15 secondi di etichettatura. Dopo circa 45 secondi a un minuto, la quantità di lariat e pre-mRNA raggiunge l'equilibrio con la stessa quantità di queste specie di RNA create dalla trascrizione che vengono elaborate mediante splicing.I passaggi più difficili sono quelli che coinvolgono le perline, il lavaggio e il blocco. Fai attenzione a non perdere le perline o a lasciarle asciugare. Una volta purificato l'RNA appena sintetizzato, è possibile utilizzare qualsiasi procedura di analisi dell'RNA tradizionale.Si consiglia di eseguire l'RNA su un bioanalizzatore o simili. Successivamente, normalmente usiamo QPCR e RNA-Seq per analizzare l'RNA. Questo metodo si dimostrò ideale per analizzare la cinetica dell'elaborazione dell'RNA.I passaggi più pericolosi sono quelli che utilizzano fenolo e cloroformio nell'estrazione dell'RNA. Ogni volta che usi queste sostanze chimiche in un contenitore non sigillato, fallo in un cappuccio dei fumi e indossa indumenti protettivi appropriati, un camice da laboratorio e guanti. Prestare particolare attenzione al fatto che non ci siano perline di zirconia nel filo del tubo del tappo a vite, in quanto ciò porterà a una perdita.

extremely-rapid-specific-metabolic-labelling-rna-vivo-with-4

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biochemistry

Biochimica

Trascrizioni di RNA sono soggetti ad ampie regolamentazione posttranscriptional che è mediato da una moltitudine di trans-acting RNA-binding proteins (RBPs). Qui vi presentiamo un metodo generalizzabile per identificare con precisione e trascrittoma su scala i siti di legame di RNA RBPs.

PAR-Clip - un metodo per identificare trascrittoma livello i siti di legame delle proteine ​​RNA binding

L'RNA cellulare totale fornisce un modello povero per studiare variazioni a breve termine in sintesi dell'RNA e il decadimento nonché la cinetica di RNA processing. Qui, descriviamo marcatura metabolica di RNA trascritto recente con 4 thiouridine seguito da biotinylation tiolo-specifica e purificazione dell'RNA trascritto appena consentano di superare queste limitazioni.

Marcatura metabolica di RNA recentemente trascritto per Alta Risoluzione profili di espressione genica di RNA di sintesi, trattamento e Decay in coltura cellulare

Questo protocollo descrive l'uso combinatoria di ChIP-seq, 4sU-seq, totale RNA-seq e profilatura per linee cellulari e cellule primarie del ribosoma. Esso consente di tenere traccia delle modifiche in fattore di trascrizione binding, trascrizione de novo , elaborazione di RNA, fatturato e traduzione nel corso del tempo e la visualizzazione il corso generale degli eventi in cellule attivate e/o cambiare rapidamente.

In tempo reale analisi del fattore di trascrizione associazione, trascrizione, traduzione e fatturato per visualizzare eventi globali durante l'attivazione cellulare

Descriviamo un'originale piattaforma di analisi del RNA di trasferimento denominata SPOt (snella piattaforma per l'osservazione del tRNA). Punto misura contemporaneamente i livelli cellulari di tutti i tRNAs nei campioni biologici, in solo tre passi e in meno di 24 ore.

Etichettatura metabolica e profilatura di RNA di trasferimento utilizzando Macroarrays

Questo metodo può essere utilizzato per misurare la sintesi del RNA. 5-Bromouridine è aggiunto alle cellule e integrare nel RNA sintetizzato. Sintesi di RNA viene misurata mediante estrazione di RNA immediatamente dopo la marcatura, seguita da 5-Bromouridine-mirati immunoprecipitazione di etichettati RNA e analisi di trascrizione inversa e reazione a catena della polimerasi quantitativa.

Indagine della sintesi di RNA usando 5-Bromouridine di etichettatura e di immunoprecipitazione

Il protocollo qui descritto si basa sulla quantificazione genoma di nuova sintesi mRNA purificato da cellule di lievito etichettate con 4-tiouracile. Questo metodo permette di misurare la sintesi di mRNA disinserita dalla degradazione del mRNA e, quindi, fornisce una misurazione accurata della trascrizione del RNA polimerasi II.

Saccharomyces cerevisiae Metabolica etichettatura con 4-tiouracile e la quantificazione di nuova sintesi mRNA come Proxy per attività di RNA polimerasi II

Questo articolo descrive la marcatura a due colori di RNA lunghi in posizione terminale e la loro immobilizzazione superficiale tramite incapsulamento in vescicole fosfolipidiche per applicazioni di microscopia FRET TIRF a singola molecola. La combinazione di queste tecniche consente una visualizzazione e un'analisi precise della dinamica dell'RNA a livello di singola molecola.

Marcatura terminale fluorescente e incapsulamento di RNA lunghi per microscopia FRET-TIRF a singola molecola

Questo protocollo descrive la quantificazione rapida e altamente sensibile di Förster trasferimento di energia di risonanza (FRET) i dati dei sensori utilizzando un analizzatore portatile FRET su misura. Il dispositivo è stato utilizzato per rilevare maltosio in un intervallo di temperatura critica che massimizza sensibilità di rilevamento, consentendo valutazione pratica ed efficiente del contenuto di zucchero.

Altamente sensibile e rapido fluorescenza Detection con un portatile FRET Analyzer

L'adsorbimento di peptidi su plastica durante le tradizionali diluizioni seriali basate su puntali può avere un impatto significativo sulla determinazione della potenza e confondere la comprensione delle relazioni struttura-attività utilizzate per l'identificazione del piombo e le fasi di ottimizzazione del piombo della scoperta di farmaci. Qui vengono descritti i metodi per la diluizione seriale acustica automatizzata senza contatto di campioni di peptidi.

Automated acustico di erogazione per la diluizione seriale di Peptide Agonisti in potenza Determinazione Assays

Descriviamo un protocollo per identificare le proteine RNA-leganti e mappare loro regioni di RNA-binding in cellule vive utilizzando photocrosslinking UV-mediati e spettrometria di massa.

Preparazione dei campioni per l'identificazione basati sulla spettrometria di massa di RNA-binding Regions

Scopri un metodo rapido per purificare RNA appena sintetizzato in Saccharomyces cerevisiae usando uracile tiolato. Questa tecnica consente esperimenti pulse-chase con tempi di etichettatura brevi e basso rumore di fondo.

Etichettatura metabolica estremamente rapida e specifica dell'RNA In Vivo con 4-Thiouracil (Ers4tU)

Esplora altri video