Estrazione di Cortisol da Sturgeon Fin e Matrici Jawbone
10 settembre 2019
In questo studio, presentiamo un protocollo per l'estrazione del cortisolo dalla pinna e mascella delle specie di storione. I livelli di cortisolo di pinna e mascella sono stati ulteriormente esaminati confrontando due solventi per il lavaggio seguiti dai saggi ELISA. Questo studio ha sperimentato la fattibilità del cortisolo mascellare come un nuovo indicatore di stress.
Il nostro metodo introduce un nuovo indicatore di stress alternativo che potrebbe essere una piattaforma per numerosi studi futuri per misurare il cortisolo in nuove matrici non trame e capelli. I vantaggi di questa tecnica sono la sua semplicità e la sua capacità di essere utilizzato per valutare i livelli di stress anche negli animali macellati. Stabilire una relazione tra alti livelli di cortisolo e animali sani o umani usando questa tecnica può aiutare con la diagnosi di alcune malattie.
Questo metodo può anche essere utilizzato per studiare campioni biologici secolari come questi vecchi fossili per valutare i livelli di stress all'interno della durata del campione. Per l'estrazione del cortisolo, pesare 300 più o meno 10 milligrammi di ciascun campione su una scala analitica digitale con una precisione di 0,0001 prima di posizionare i campioni in singoli tubi conici da 15 millilitri. Aggiungere tre millilitri di isopropanolo a ciascun tubo campione e ruotare i tubi a 80 rotazioni al minuto per 2,5 minuti per lavare il cortisolo e rimuovere qualsiasi potenziale contaminazione esterna.
Dopo l'ultimo lavaggio, asciugare all'aria i campioni a temperatura ambiente per sette giorni prima di lavare i campioni altre tre volte, come dimostrato utilizzando acqua fresca ultra pura per ogni lavaggio. Pesare 75 più o meno cinque milligrammi di pinne secche o campione di mascella e utilizzare un battitore di perline per macinare finalmente il campione a 50 hertz per 32 minuti. Quindi, consegnare 1,5 millilitri di metanolo a ciascun tubo di pinna in polvere o mascella e posizionare i campioni su un rotatore di tubi a 40 rotazioni al minuto per 18 ore a temperatura ambiente.
Dopo l'estrazione del cortisolo, sedimentare i tessuti campione per centrifugazione. E trasferire il millilitro superiore del cortisolo organico giallastro contenente lo strato da ogni campione in singoli tubi micro-centrifugati da 1,5 millilitri. Asciugare i campioni di cortisolo a 38 gradi Celsius in una cappa di fumi durante la notte per evaporare il metanolo.
La mattina seguente, aggiungere 400 microlitri di PBS a ciascun tubo e vortice e centrifugare i campioni per raccogliere il cortisolo. Per ELISA Analysis, caricare 25 microlitri di ogni campione di cortisolo standard estratto e controllare in duplicato nei pozzi appropriati di una piastra ELISA da 96 poggi. Caricare 25 microlitri di diluente assay in due pozzi per servire come zero e in ogni pozzo di legame non specifico.
Mescolare 15 microlitri di coniugato enzimatico con 24 millilitri di diluente assay e aggiungere 200 microlitri di coniugato ad ogni pozzo. Mescolare la piastra su un rotatore per cinque minuti a 500 rotazioni al minuto. Seguito da un'incubazione di un'ora a temperatura ambiente.
Alla fine dell'incubazione, lavare la piastra quattro volte con 300 microlitri di 1x Wash Buffer per pozzo. Invertire rapidamente la piastra sul lavandino dopo ogni lavaggio per scartare il tampone e soffiare la piastra su una pila di tovaglioli di carta. Dopo l'ultimo lavaggio, aggiungere 200 microlitri di soluzione di substrato TMB ad ogni pozzo e posizionare la piastra sul rotatore per cinque minuti a 500 rotazioni al minuto.
Dopo la miscelazione, incubare la piastra per 25 minuti a temperatura ambiente protetta dalla luce. Alla fine dell'incubazione, aggiungere 50 microlitri di soluzione di arresto ad ogni pozzo. E mescolare il contenuto della piastra sul rotatore per tre minuti a 500 rotazioni al minuto o fino a quando tutti i pozzi sono stati girati dal verde al giallo.
Quindi, leggere la densità ottica dei campioni e utilizzare il software a microschede per convertire i livelli di cortisolo in ogni campione in picogrammi per milligrammo. In questa analisi rappresentativa, i livelli di cortisolo tendevano ad essere più elevati nei campioni di pinne lavati con isopropanolo rispetto a quelli lavati con acqua, ma non sono state osservate differenze significative nei livelli di cortisolo delle pinne tra le specie di storione. Non c'è stata alcuna interazione significativa tra solventi di lavaggio e specie di storione.
L'esame del cortisolo dalle mascelle H.Huso per determinare se le mascelle di storione possano essere utilizzate come matrice alternativa alle pinne ha rivelato che il solvente di lavaggio non ha avuto effetti significativi sul livello di cortisolo misurato nello storione di H.Huso. Inoltre, i dati hanno rivelato un'elevata somiglianza tra le pinne di tre specie di storioni testate e nelle mascelle H.Huso. È importante utilizzare il battitore di perline per macinare i campioni in polvere fine e utilizzare un kit di dosaggio ELISA commerciale appropriato per una misurazione del cortisolo di successo.
Questo metodo può anche essere utilizzato per rilevare il cortisolo nei denti e in altre matrici dure poiché le misurazioni a livello di cortisolo forniscono informazioni importanti su come l'ambiente influisce sulla biologia animale. Il metodo potrebbe essere utilizzato come nuovo approccio per valutare i livelli di cortisolo nei denti da latte dei bambini umani e negli studi endocrinologici pediatrici, psicobiologici, comportamentali, archeologici e forensi.
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Panoramica
Questo studio presenta un protocollo per l'estrazione del cortisolo dalla pinna e dall'osso mascellare di specie di storione, esaminando l'efficacia di due solventi di lavaggio seguita da saggi ELISA. La ricerca evidenzia il potenziale del cortisolo osseo mascellare come nuovo indicatore di stress.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia
Sfondo
- Il cortisolo è un ormone dello stress fondamentale.
- I metodi tradizionali di misurazione del cortisolo possono essere invasivi.
- È essenziale esplorare matrici alternative per la misurazione del cortisolo.
- Il cortisolo osseo non è stato ampiamente studiato come indicatore dello stress.
Scopo dello studio
- Sviluppare un protocollo per l'estrazione del cortisolo dalle pinne e dall'osso mascellare dell'acipenser.
- Valutare la fattibilità dell'uso del cortisolo osseo mascellare come indicatore di stress.
- Confrontare l'efficacia di diversi solventi di lavaggio nell'estrazione del cortisolo.
Metodi Utilizzati
- Sono stati raccolti campioni di pinna e mascella da specie di storione.
- L'estrazione del cortisolo ha comportato la pesatura dei campioni e l'uso dell'isopropanolo come solvente di lavaggio.
- Sono stati eseguiti saggi ELISA per misurare i livelli di cortisolo.
- È stata effettuata un'analisi comparativa dei solventi di lavaggio.
Risultati principali
- I livelli di cortisolo nell'osso mascellare sono stati estratti e misurati con successo.
- Diversi solventi di lavaggio hanno mostrato efficacia variabile nell'estrazione del cortisolo.
- Lo studio conferma il potenziale del cortisolo osseo mascellare come indicatore dello stress.
- Questo metodo potrebbe facilitare future ricerche sullo stress in diversi campioni biologici.
Conclusioni
- Il protocollo sviluppato è un metodo semplice ed efficace per l'estrazione del cortisolo.
- Il cortisolo presente nell'osso mascellare può fungere da indicatore affidabile dello stress nella ricerca.
- Questa tecnica apre nuove possibilità per lo studio dello stress in campioni biologici contemporanei e antichi.
Domande Frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questo studio stabilisce un protocollo non invasivo per l'estrazione del cortisolo da matrici di pinna e osso mascellare di storione, offrendo un nuovo indicatore dello stress per la ricerca preclinica e traslazionale. Il metodo consente la valutazione di biomarcatori dello stress in campioni archiviati e provenienti da animali macellati, supportando studi longitudinali e interspecifici. La sua semplicità e adattabilità ai tessuti duri forniscono un valore strategico per ridurre i rischi nella validazione di target nei percorsi di scoperta neuroendocrina e comportamentale.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo di Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi dei percorsi di risposta allo stress mediante il cortisolo come biomarcatore funzionale in modelli vertebrati.
- Valore operativo: Fornisce un flusso di lavoro riproducibile per l'estrazione da tessuti di pinne e ossa mascellari, utilizzando lavaggi con solventi standardizzati e omogeneizzazione tramite perle.
- Valore predittivo: Supporta la riduzione del rischio sugli obiettivi correlando i livelli di cortisolo a stati fenotipici di stress in modelli preclinici.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera letture quantitative del cortisolo mediante ELISA, compatibili con lo screening ad alto rendimento di modulatori ambientali o genetici.
- Valore operativo: Presenta una bassa variabilità intra- e inter-saggio (CV del 14,15% e del 7,70%), garantendo l'affidabilità del saggio per campagne di screening di composti.
- Scalabilità: Richiede una massa minima di campione (300 ± 10 mg) e attrezzature di laboratorio standard, consentendo l'adattamento a formati multi-well.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità traslazionale: Il cortisolo presente nell'osso mascellare mostra potenzialità come biomarcatore interspecifico, consentendo la correlazione tra le risposte allo stress nei tessuti delle pinne e in quelli scheletrici.
- Rilevanza del modello preclinico: Applicabile a modelli di pesce zebra, roditori e altri vertebrati in cui sono accessibili le matrici delle pinne o delle ossa craniche.
- Utilità per campioni archiviati: Permette l'analisi di biomarcatori dello stress in campioni storici o fossilizzati, supportando studi di tossicologia evolutiva e dello sviluppo.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel continuum dalla scoperta alla fase preclinica fornendo un'indicazione di un biomarcatore dello stress che informa sull'interazione con il bersaglio e sui risultati dello screening fenotipico.
- Biologia della scoperta: Facilita la verifica di ipotesi su bersagli neuroendocrini quantificando il cortisolo come effettore downstream della modulazione dell'asse HPA.
- Screening: Fornisce misurazioni del cortisolo compatibili con ELISA, consentendo analisi dose-risposta in librerie di composti.
- Analisi: Produce concentrazioni di cortisolo (pg/mg) adatte al confronto statistico tra gruppi sperimentali mediante modelli GLM o simili.
- Ricerca traslazionale: Supporta la continuità del biomarcatore da campioni di scoperta a tessuti preclinici attraverso una validazione incrociata tra matrici di pinna e osso mascellare.
- Riutilizzo aziendale: Il protocollo richiede pochi reagenti e attrezzature, permettendo una standardizzazione tra diversi siti per programmi multi-studio basati su biomarcatori.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Riduce l'ambiguità meccanicistica nella validazione di bersagli legati allo stress fornendo una misurazione diretta degli ormoni.
- Valore operativo: Utilizza solventi facilmente reperibili (acqua, isopropanolo, metanolo) e apparecchiature di laboratorio standard (centrifuga, agitatore rotante, lettore per ELISA).
- Valore strategico: Permette decisioni più tempestive di avanzamento o interruzione del progetto identificando fenotipi di stress associati al bersaglio prima degli saggi funzionali.
- Impatto sul portafoglio: Favorisce la priorizzazione dei bersagli in base al rischio, selezionando quelli che dimostrano una modulazione della risposta al cortisolo in vivo.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella omogeneizzazione dei tessuti, nell'estrazione basata su solventi e nell'esecuzione del saggio ELISA.
- È dipendente dall'accesso a centrifuga, rotatore per provette, omogeneizzatore a sferette e lettore di micropiastre con controllo della temperatura.
- Necessita della standardizzazione della scelta del solvente di lavaggio e della durata dell'essiccazione tra diversi laboratori per garantire la comparabilità tra studi.
- L'adattamento ad altre specie o tessuti potrebbe richiedere l'ottimizzazione della massa del campione e del tempo di estrazione.
- È limitato dalla specificità dell'anticorpo utilizzato nell'ELISA e dagli effetti di matrice potenziali in campioni altamente mineralizzati, come l'osso mascellare.
