Un robusto teste basato sulla reazione alla catena di polimerasi per quantificare le ripetizioni di Trinucleotide della Citosina-guanina-guanina nel gene del retardation mentale Fragile X
September 16th, 2019
Un accurato e robusto saggio basato sulla reazione basato sulla reazione della catena di polimerasi per quantificare le ripetizioni della trinucleotide della citosina-guanina-guanina nel gene del ritardo mentale Fragile X-1 facilita la diagnosi molecolare e lo screening della sindrome di Fragile X e della Fragile X-correlati con tempi di consegna più brevi e investimenti in attrezzature.
Questo metodo conveniente può trovare ampie applicazioni nella diagnosi molecolare e nello screening di FXS e disturbi fragili correlati all'X. È veloce nel tempo di consegna e meno investimenti in attrezzature. Il nostro test basato su PCR può facilitare la classificazione dell'intero spettro dei disturbi associati a FXS e Fragile X, tra cui intermedio, premutazione e mutazione completa con robustezza e tempi di segnalazione rapidi.
La procedura sarà dimostrata da Weng Chua di PerkinElmer Singapore. Inizia rimuovendo la miscela tampone PCR, il diluente del campione e i campioni di DNA dal congelatore Celsius di 20 gradi e lasciandoli a temperatura ambiente per 20-30 minuti per scongelarli. Prima di usare i reagenti, vortice e farli girare brevemente verso il basso.
Misurare la concentrazione del campione di DNA con uno spettrofotometro e, se necessario, diluirla a 25 nanogrammi per microlitro con diluente del campione. Etichettare i pozzi di una piastra PCR per identificare campioni di DNA di riferimento e testati e calcolare il numero di reazioni necessarie per i campioni di test, riferimento e controllo negativo. Preparare il mix master PCR combinando 15 microlitri di miscela tampone PCR a 0,6 microlitri di diluente campione e 0,4 microlitri di polimerasi per ogni reazione.
Vortice il mix e spin it down. Quindi erogare 18 microlitri della miscela in ogni pozzo. Quindi pipettare due microlitri di ogni DNA nel pozzo appropriato.
Mescolare i reagenti tubazioni su e giù cinque volte, quindi sigillare la piastra. Posizionare la piastra nel termociclo e far funzionare la PCR in base alle indicazioni del manoscritto. Preriscaldare lo shaker dell'incubatore a 65 gradi Celsius e aggiungere 80 microlitri di tampone 1X TE a ciascun prodotto PCR.
Utilizzare una pipetta multicanale per trasferire i campioni su una piastra di pulizia PCR e mettere la piastra nello shaker. Incubarlo a 65 gradi Celsius mentre trema a 1200 giri/min per 10 minuti. Dopo l'incubazione, raffreddare lo shaker dell'incubatore fino a 25 gradi Celsius, impostare lo strumento a vuoto su 250 millibar e aspirare la soluzione attraverso il filtro.
Dopo 15 minuti, i pozzi non dovrebbero avere più liquido. Spegnere il vuoto e aggiungere 50 microlitri di tampone 1X TE a ciascun pozzo. Aspirare la soluzione per 10 minuti utilizzando le impostazioni di vuoto precedenti.
Asciugare la parte inferiore della piastra filtrante premendola saldamente su una pila di tovaglioli di carta e quindi aggiungere 20 microlitri di tampone 1X TE al centro inferiore di ogni pozzo. Posizionare la piastra nello shaker e incubare a 25 gradi Celsius mentre si trema a 1200 giri/min per cinque minuti. Dopo l'incubazione, trasferire almeno 15 microlitri del prodotto PCR purificato su una piastra PCR fresca da 96 po'.
Prima di iniziare, porta il concentrato di colorante del DNA, la matrice del gel di DNA, il marcatore del DNA, la scala del DNA e i campioni di DNA purificati a temperatura ambiente. Impostare la stazione di adescamento sostituendo la siringa e regolando la piastra di base, quindi rilasciare la leva della clip della siringa e farla scorrere nella posizione superiore. Avviare il software di dimensionamento e preparare il mix di coloranti in gel.
Vortice il concentrato di colorante per 10 secondi, quindi girare verso il basso. Quindi, aggiungere 25 microlitri del colorante a una fiala a matrice di gel e vortice la soluzione da mescolare. Trasferire la miscela di coloranti in gel su un filtro di rotazione, posizionarla nella centrifuga e ruotarla per 10 minuti a 1500 volte g.
Quando si è pronti a caricare la miscela di coloranti in gel, inserire un nuovo chip DI DNA nella stazione di adescamento e aggiungere nove microlitri della miscela di coloranti in gel nel pozzo contrassegnato con G.Chiudere la stazione di adescamento e assicurarsi che lo stantuffo sia posizionato a un segno di millilitro. Premere lo stantuffo della siringa verso il basso fino a quando non viene trattenuto dalla clip. Attendere esattamente 30 secondi, quindi rilasciare la clip.
Attendere altri cinque secondi, quindi tirare lentamente lo stantuffo nella posizione di un millilitro. Aprire la stazione di adescamento e aggiungere nove microlitri di miscela di coloranti in gel nei pozzi contrassegnati con G.Aggiungere cinque microlitri di marcatore nel pozzo contrassegnato con un simbolo di scala e ciascuno dei 12 pozzi campione. Aggiungere un microlitro della scala al pozzo con il simbolo della scala e un microlitro del prodotto PCR o dell'acqua ai pozzi campione.
Vortice il chip per un minuto a 2400 giri/min. Inseriscilo nel bioanalizzatore ed esegui il chip entro cinque minuti. Al termine dell'esecuzione, esportare i dati di picco come file di tabella CSV.
Un campione femminile di premutazione e un campione femminile a mutazione completa vengono utilizzati come campioni di riferimento. Un picco marcatore superiore e inferiore sono inclusi nel profilo delle dimensioni del frammento, e di solito c'è un picco complesso di primer a circa 95 coppie di basi. Questi esempi di riferimento vengono utilizzati per costruire una curva standard di regressione.
La curva standard di regressione lineare viene quindi utilizzata per calcolare le dimensioni ripetute di campioni sconosciuti. I campioni clinici normali, intermedi, di premutazione, mutazione completa e mosaico di mutazione completa possono essere classificati correttamente con questo metodo. In alcuni casi, solo un picco viene visualizzato nei risultati dell'elettroforesi microfluidica, che è probabilmente dovuta alla presenza di normali alleli omozigoti.
Un tipo di risultato non ottimale è la distorsione di base, che può essere ambigua o non interpretabile, ed è sospettata di essere causata da malfunzionamento dello strumento. Quando si tenta questa procedura, è importante garantire una quantità appropriata di DNA e qualità prima di iniziare il protocollo. Il sequenziamento genico FMR1 può essere eseguito per identificare il modello di interruzione AGG.
E l'enzima di restrizione sensibile alla metilazione o il saggio di modifica del bisolfito possono essere usati per monitorare lo stato di metilazione. Questa è una tecnica veloce, robusta ed economica. Aiuterà altri ricercatori a condurre uno studio basato sulla popolazione sullo stato portante di FXS e disturbi fragili associati all'X.
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Panoramica
Questo articolo presenta un saggio basato sulla reazione a catena della polimerasi per quantificare le ripetizioni di trinucleotidi citosina-guanina-guanina nel gene Fragile X mental retardation-1. Il metodo migliora la diagnosi molecolare e lo screening della sindrome di Fragile X e dei disturbi correlati con tempi di risposta ridotti e minori investimenti in attrezzature.
Componenti chiave dello studio
Area di Scienza
- Biologia Molecolare
- Genetica
- Diagnostica Clinica
Sfondo
- La sindrome di Fragile X è una condizione genetica causata da mutazioni nel gene FMR1.
- I metodi diagnostici tradizionali possono essere lunghi e costosi.
- C'è la necessità di tecniche di screening efficienti e affidabili.
- Questo studio introduce un saggio basato sulla PCR per affrontare queste sfide.
Obiettivo dello studio
- Sviluppare un saggio robusto per quantificare le ripetizioni di trinucleotidi nel gene FMR1.
- Facilitare la classificazione della sindrome di Fragile X e dei disturbi correlati.
- Ridurre il tempo e i costi associati alla diagnosi molecolare.
Metodi utilizzati
- Preparazione del mix di buffer PCR e campioni di DNA.
- Scongelamento dei reagenti a temperatura ambiente.
- Vortex e centrifugazione dei campioni prima dell'uso.
- Applicazione del saggio PCR per classificare FXS e i disturbi correlati.
Principali risultati
- Il saggio ha dimostrato robustezza nel rilevare varie mutazioni.
- I risultati sono stati riportati rapidamente, migliorando il processo decisionale clinico.
- Ha classificato efficacemente l'intero spettro dei disturbi associati a Fragile X.
- Il metodo si è dimostrato conveniente con requisiti minimi di attrezzature.
Conclusioni
- Il saggio basato sulla PCR è un significativo avanzamento nella diagnostica di Fragile X.
- Offre un'alternativa affidabile ed efficiente ai metodi tradizionali.
- Questo approccio può migliorare gli esiti dei pazienti attraverso una diagnosi tempestiva.
Domande Frequenti
Executive Industry Relevance
Quantitative assessment of CGG trinucleotide repeats in the FMR1 gene is critical for early-stage target validation and risk stratification in neurogenetic disorder pipelines. This robust PCR-based assay enables reproducible, scalable, and cost-effective measurement of repeat expansions, supporting confident classification and triage of Fragile X-associated genetic liabilities. Its rapid turnaround and broad dynamic range facilitate integration into high-throughput screening and translational research workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables precise quantification of FMR1 CGG repeat expansions for genetic target validation.
- Supports mechanistic de-risking by distinguishing normal, intermediate, premutation, and full mutation alleles.
- Facilitates portfolio triage by providing actionable genetic classification data.
Screening & Assay Development
- Delivers validated, reproducible PCR-based outputs suitable for downstream molecular screening.
- Standardizes fragment sizing and repeat quantification using reference standards and regression analysis.
- Enables scalable, high-throughput screening of population or cohort samples for carrier status.
Translational & Preclinical Research
- Aligns genetic classification with disease-relevant models for translational biomarker studies.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by enabling robust genotyping.
- Reduces biological ambiguity in preclinical model selection and risk-adjusted advancement.
Pipeline & Workflow Integration
This PCR-based quantification method fits from early discovery through preclinical research, enabling seamless integration into genetic screening, target validation, and translational biomarker workflows.
- Discovery Biology: Provides quantitative, hypothesis-driven assessment of FMR1 repeat expansions for mechanistic studies.
- Screening: Offers reproducible, standardized outputs for assay development and population screening.
- Analytics: Generates quantitative fragment sizing and regression-based repeat number determination for robust data comparison.
- Translational Research: Supports alignment of genetic findings with disease models and biomarker strategies.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, cost-effective platform for ongoing genetic screening and research applications.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in genetic target validation.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable assay performance with rapid turnaround.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency by enabling early, accurate genetic classification.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of neurogenetic disorder programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in PCR, capillary electrophoresis, and data analysis software.
- Needs access to thermocyclers, microfluidic capillary electrophoresis instruments, and validated reference standards.
- Demands cross-team standardization of sample preparation and data interpretation protocols.
- Adaptable to various sample types but dependent on DNA quality and quantity.
- Instrument malfunction or suboptimal sample quality can affect data interpretability and require troubleshooting.
