Name: Esecuzione di Xenografi muscolari scheletrici umani in topi immunodeficienti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-16T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 48 s
Description: Scopri come creare xenoinnesti di muscolo scheletrico umano in topi immunodeficienti NRG. Questo protocollo chirurgico consente la modellazione in vivo di malattie muscolari e il test preclinico di terapie.

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Questo lavoro è stato sostenuto da The Myositis Association e dalla Peter Buck Foundation. Ringraziamo il Dr. Yuanfan e sprondin per aver condiviso la sua esperienza e la sua formazione nella tecnica chirurgica dello xenotrapianto.

Tutto l'uso di campioni di ricerca da soggetti umani è stato approvato dal Johns Hopkins Institutional Review Board (IRB) per proteggere i diritti e il benessere dei partecipanti. Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal Johns Hopkins University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) in conformità con la Guida dei National Institutes of Health (NIH) per la cura e l'uso degli animali da laboratorio. Maschio NOD-Rag1nullil2r -null topi ospiti (NRG) sono utilizzati per effettuare esperimenti di xenotrapianto. Questi topi sono alloggiati in rack ventilati e ricevono aria filtrata, temperata e umidificata HEPA, nonché acqua iperclorinata filtrata per osmosi inversa. Ai topi viene fornita acqua e una dieta antibiotica irradiata (Tabella dei materiali) al libitum, e la struttura fornisce 14 h di luce a 10 h di scuro come controllato dal timer centrale.
1. Preparazione dell'attrezzatura
<ol><li>Acquisire NOD-Rag1nullIL2r -null (NRG) topi, 8-12 settimane di età.</li>
	<li>Apparecchiature chirurgiche autoclave: forbici, pinpe, portaa ago, cucitrice chirurgica (Tabella dei materiali), clip della ferita, salviette chirurgiche ( Tabelladei materiali) e becher ( Figura1A).</li>
	<li>Preparare 50 mL di mezzi muscolari (20% siero bovino fetale, 2% estratto di embrione di pulcino, 1% antibiotico/antimicotico in Prosciutti F10 Medium). Mantenere tutte le sostanze chimiche / farmaci / soluzioni utilizzati per la chirurgia a temperatura ambiente a meno che non indicato in modo diverso nel protocollo.</li>
	<li>Preparare una siringa da 1 mL con un ago da 26 G lungo 3/8 pollici contenente 2 mg/mL analgesiche (Tabella dei materiali) e posizionare sul ghiaccio. L'analgesico può essere diluito alla giusta concentrazione utilizzando salina tamponata sterile (PBS).</li>
</ol>2. Preparazione chirurgica
<ol><li>Ottenere una biopsia muscolare umana in base a un protocollo approvato dall'IRB da pazienti i cui muscoli mostrano forza &gt; 4-/5 sulla scala MRC (Medical Research Council)12. Collocare il campione di ricerca in una tela Petri da 100 mm x 15 mm contenente supporti muscolari. NOT: La scala MRC viene utilizzata nella pratica clinica come una valutazione della forza muscolare con 0 che non mostra alcuna contrazione, 5 che mostra la potenza normale e 4 (da 4 a 4) che mostra noto movimento contro la resistenza12. Abbiamo scoperto che i muscoli con debolezza da lieve a moderata (MRC &gt; 4-5) in genere mostrano patologia della malattia, ma non sono ampiamente sostituiti da tessuto adiposo o fibrosi, entrambi che impediscono la rigenerazione dello xenotrapianto. Nel caso di tessuto autoptico in cui non è disponibile un recente punteggio MRC, la qualità muscolare è accessibile tramite osservazione lorda. Biopsie muscolari che sono rosa pallido in apparenza o hanno grandi aree di tessuto adiposo non sono suscettibili di xenotrapianto con successo.</li>
	<li>Rimuovere qualsiasi fascia o tessuto adiposo rimanente dal campione con forbici chirurgiche utilizzando un microscopio stereo e una fonte di luce per aiutare la visualizzazione.</li>
	<li>Dissezionare la biopsia muscolare in circa 7 x 3 mm x 3 mm pezzi con forbici chirurgiche utilizzando il microscopio stereo e una fonte di luce. Assicurarsi che le fibre siano disposte longitudinalmente all'interno del campione.</li>
	<li>Posizionare il piatto Petri contenente il muscolo sezionato sul ghiaccio. In media, gli xenografi sono tenuti in media per 4 ore mentre vengono eseguiti interventi chirurgici. Tuttavia, le biopsie sono state conservate nei supporti per 24 h prima dello xenotrapianto, e questo ritardo non sembra avere un impatto negativo sul trapianto o sulla rigenerazione.</li>
	<li>Mettere suture sintetiche non assorbibili (Tabella dei materiali) in una piastra Petri da 100 mm x 15 mm contenente 70% di etanolo.</li>
	<li>Impostare un circuito di anestesia a doppia procedura: organizzare il circuito respiratorio Mapleson E al microscopio stereo e posizionare la camera di induzione in un armadio di biosicurezza (Figura 1A,B).</li>
	<li>Ottenere il peso del mouse NRG mettendo in un becher autoclaved su una scala, e trasferire alla camera di induzione. Indurre l'anestesia sotto il 3% isoflurane. Una volta raggiunta la profondità anestetica appropriata, come valutato dall'osservazione della frequenza respiratoria, del rilassamento muscolare e della mancanza di movimento volontario, ridurre l'impostazione del vaporizzatore all'1,5% per il resto dell'intervento.</li>
	<li>Trasferire il mouse dalla camera di induzione al circuito respiratorio Mapleson E e applicare unguento oftalmico agli occhi.</li>
	<li>Rimuovere i capelli sovrapposti al tibialis anteriore (TA) dalla caviglia al ginocchio con un trimmer, seguiti da un trattamento di 1 min con lozione per la rimozione dei capelli (Tabella dei materiali) ( Figura2A).</li>
	<li>Disinfettare il sito chirurgico tamponando la gamba con soluzione povidone-iodio. Quindi lavare via il restante povidone-iodio con 70% di etanolo.</li>
	<li>Iniettare il topo sottocutaneo con analgesico, come il carprofene, (Tabella dei materiali) ad una dose di 5 mg/kg.</li>
</ol>3. Chirurgia Xenotrapianto
<ol><li>Nastro lungo la gamba e fare un'incisione dritta sopra il muscolo tibilalis anteriore (TA) con forbici e pinze iride provenienti dai tendini distale e terminando sotto il ginocchio (Figura 2B).</li>
	<li>Separare la pelle dal muscolo utilizzando la dissezione smussata con forbici chirurgiche.</li>
	<li>Tagliare l'epimysio del muscolo TA con le forbici a partire dal tendine e terminando al ginocchio. NOT: Questo è un taglio molto superficiale (meno di 0,5 mm; Figura 2B, linea tratteggiata nera) e la TA sottostante non dovrebbe essere danneggiata nel processo in quanto ciò renderebbe la rimozione più impegnativa. Se eseguite correttamente, le fibre muscolari si rilasseranno visibilmente.</li>
	<li>Tagliare il tendine distale della TA con le forbici, afferrare il tendine con pinze di iride e tirare la TA verso il ginocchio (Figura 2C).</li>
	<li>Tagliare il tendine distale dell'estensore digitorum longus (EDL) con le forbici e tirare l'EDL verso il ginocchio (Figura 2D). Una volta che il tendine prossimale del muscolo peroneso longus (PL) è visibile, rimuovere l'EDL con le forbici (Figura 2D, linea tratteggiata verde).</li>
	<li>Rimuovere la TA con forbici (Figura 2D, linea tratteggiata blu) e utilizzare una salvietta chirurgica bagnata con PBS e una leggera pressione per ottenere l'epitisi (Figura 2E).</li>
	<li>Infilare una sutura attraverso il tendine peroneo longus (PL) prossimale (PL), lasciando circa 1,5 pollici di filo su entrambi i lati del tendine (Figura 2F).</li>
	<li>Eseguire la prima metà di un nodo quadrato chirurgico a due mani, ma non stringere: questo formerà un cerchio. Mettere uno xenotrapianto in questo cerchio e stringere il ciclo per fissare lo xenotrapianto. Completare l'altra metà del nodo quadrato (Figura 2G,H). Questo sutura lo xenotrapianto al tendine prossimale del PL.</li>
	<li>Infilare attraverso tendine PL distale e ripetere la tecnica del nodo quadrato dal passo 3.8 per legare lo xenotrapianto al tendine distale (Figura 2H,I). NOT: L'arteria tarsale mediale e la vena possono trovarsi vicino o sopra il tendine distale del PL. Non posizionare suture attraverso o intorno a queste navi. È facile dire se una sutura è stata posizionata in modo improprio in quanto i vasi saranno sbollentare o sanguinare. In questo caso, rimuovere la sutura e posizionarla in una posizione diversa.</li>
	<li>Tirare la pelle sul muscolo xenotrapianto, sigillare con colla chirurgica e posizionare 2-3 graffette chirurgiche sull'incisione (Figura 2J).</li>
	<li>Posizionare il mouse in una gabbia pulita su un pad riscaldato per recuperare. Monitorare il mouse fino a quando completamente consapevole e periodicamente nei prossimi giorni per segni di infezione sistemica locale e per garantire che il sito chirurgico non viene riaperto. NOT: Una singola dose di analgesico come descritto al passo 2.11 è in genere sufficiente per alleviare il dolore. Tuttavia, i topi devono anche essere monitorati per il dolore persistente (ad esempio zoppia, cappotto arruffato, postura curva), e, se necessario, nuovamente dosato con analgesico a 24 ore post-operatori.</li>
</ol>4. Collezione Xenograft
 NOT: Xenografts sono in genere raccolti tra 4 A 6 mesi post-chirurgia. Tuttavia, le collezioni sono state eseguite fino a 12 mesi dopo l'intervento chirurgico.
<ol><li>Mettere un becher coperto contenente 200 mL di 2 metilbutane in una scatola contenente ghiaccio secco per un minimo di 30 min prima della raccolta dello xenotrapianto.</li>
	<li>Indurre l'anestesia sotto il 3% di isoflurane nella camera di induzione. Una volta raggiunta la profondità anestetica appropriata, ridurre l'impostazione del vaporizzatore all'1,5% per il resto dell'intervento.</li>
	<li>Trasferire il mouse dalla camera di induzione al circuito respiratorio Mapleson E disposto su un microscopio stereo.</li>
	<li>Rimuovere i capelli sovrapposti al tibialis anteriore dalla caviglia al ginocchio con un trimmer e lozione per la rimozione dei peli. Le suture che tengono lo xenotrapianto in posizione possono essere viste attraverso la pelle (Figura 3A).</li>
	<li>Nastro lungo la gamba e utilizzare forbici e pinze iride per aprire la pelle sopra lo xenotrapianto fino a quando entrambe le suture sono visibili (Figura 3B). La pelle che sovrasta lo xenotrapianto può essere rimossa come dimostrato per facilitare la rimozione dello xenotrapianto.</li>
	<li>Utilizzare un bisturi per tagliare tra lo xenotrapianto e la tibia (Figura 3B, freccia indica il sito iniziale e la direzione di incisione). Questo libererà un lato dello xenotrapianto.</li>
	<li>Utilizzare un bisturi per tagliare tra il muscolo PL e il muscolo gastrocnemio(Figura 3C, incision lungo epimysium etichettato con freccia). Il PL verrà rimosso con lo xenotrapianto.</li>
	<li>Tagliare sotto la sutura distale e attraverso il tendine distale del PL(Figura 3D, tagliata lungo la linea tratteggiata).</li>
	<li>Rimuovere lo xenotrapianto e PL afferrando la sutura con pinze dell'iride e deviandola verso il ginocchio mentre si utilizzano le forbici per tagliarlo lontano dal muscolo sottostante (Figura 3E).</li>
	<li>Tagliare sopra la sutura prossimale con le forbici per rimuovere lo xenotrapianto e PL (Figura 3F, tagliata lungo la linea tratteggiata in 3E).</li>
	<li>Posizionare il campione su un piccolo pezzo di cartone o di plastica e pin il più vicino possibile alle suture. Durante l'pinning del campione, allungare delicatamente il muscolo per garantire che l'orientamento della fibra venga mantenuto durante il processo di congelamento dello snap. Dopo che i perni sono saldamente in posizione, far scorrere il muscolo fino ai perni in modo che poggia appena sopra il cartone. NOT: In alternativa, un'estremità dello xenotrapianto può essere montata in tragacanth su un tappo di sughero, oppure può essere sommersa interamente in un composto di temperatura di taglio ottimale (O.C.T.) in un criomold. Con cura, la conformazione muscolare può essere mantenuta con entrambi i metodi.</li>
	<li>Snap congelare lo xenotrapianto in 2 metilbutane pre-raffreddato.</li>
	<li>Conservare lo xenotrapianto a -80 gradi centigradi.</li>
	<li>Subito dopo la raccolta xenotrapianto, i topi eutanasia in conformità con le linee guida dell'American Veterinary Medical Association:
	<ol>
<li>Collocare i topi in una camera sigillata con un adeguato sistema di scavenging del gas di scarico. Uso isoflurane ad una concentrazione di 3-4% per indurre l'anestesia.</li>
		<li>Una volta raggiunta la profondità anestetica appropriata, come valutato dall'osservazione della frequenza respiratoria, del rilassamento muscolare e della mancanza di movimento volontario, aumentare l'impostazione del vaporizzatore al 5% per indurre la morte. Lasciare i topi nella camera per altri 2 min dopo che la respirazione è cessata. La morte è verificata osservando che i topi non riescono a recuperare entro 10 min dopo sovradosaggio di isoflurane.</li>
		<li>Infine, eseguire lussazione cervicale sui topi. NOT: Nel caso di topi xenotrapianto bilaterali, lo xenotrapianto contralaterale può essere salvato per una raccolta successiva. Per eseguire una raccolta di sopravvivenza, aprire la pelle sovrapposta allo xenotrapianto con un singolo taglio dritto con forbici chirurgiche e rimuovere lo xenotrapianto come descritto nei passi da 4.6 a 4.10. Quindi chiudere la pelle sopra il vano tibiale vuoto utilizzando colla chirurgica e graffette. Trattare il topo con analgesico come descritto al punto 2.11 e posizionare il mouse in gabbia pulita su tampone riscaldato per recuperare. Monitorare il mouse fino a quando completamente consapevole e periodicamente nei prossimi giorni per segni di infezione sistemica locale e per garantire che il sito chirurgico non viene riaperto.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Immunohistochimica Xenotrapianto
<ol><li>Utilizzare un criostato per tagliare da 10 a 12 sezioni m dalle xenogratrine raccolte su vetrini caricati positivamente (Tabella dei materiali).</li>
	<li>Riempire il barattolo di colorazione con metanolo e pre-raffreddare a -20 gradi centigradi per 30 min.</li>
	<li>Mettere i vetrini in metanolo freddo ghiaccio per 10 min per fissare e permeabilizzare le sezioni xenotrapianto.</li>
	<li>Mettere i vetrini in barattolo di colorazione e lavare 3x con salina tampone fosfato (PBS) per 5 min.</li>
	<li>Blocco con IgG antitomouse (Tabella dei materiali) per 2 h a 4 gradi centigradi.</li>
	<li>Blot con anticorpi primari, come la spettrostrina, laminA/C, e la miosina embrionale (Tabella dei materiali) in PBS integrato con il 2% di siero di capra durante la notte a 4 gradi centigradi.</li>
	<li>Mettere i vetrini in un barattolo di colorazione e lavare 3x con salina tampone fosfato (PBS) per 5 min.</li>
	<li>Blot con anticorpi secondari coniugati fluorescente (Tabella dei materiali) in PBS integrati con siero di capra del 2% per 1 h a temperatura ambiente.</li>
	<li>Mettere i vetrini in barattolo di colorazione e lavare 3x con salina tampone fosfato (PBS) per 5 min.</li>
	<li>Posizionare il supporto di montaggio (Table of Materials) sopra le sezioni di xenogri, posizionare coverslip sulla parte superiore e utilizzare lo smalto per sigillare il coperchio.</li>
</ol><img alt="Processo di dissezione muscolare, diagrammi che mostrano l'identificazione dei muscoli EDL, TA e PL nello studio di ricerca." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59966/59966fig02.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> Figura 2: Chirurgia dello Xenotrapianto. (A) I capelli vengono rimossi dal sito chirurgico. (B) Un'incisione viene effettuata sopra il tibialis anteriore (TA). I tendini distale del TA e dell'estensore digitorum longus (EDL) sono contrassegnati con frecce. La linea tratteggiata nera indica dove verrà tagliato l'epimysio al punto 3.3. (C) Il tendine distale della TA viene tagliato e il muscolo viene tirato fino al ginocchio. (D) Il tendine dell'EDL viene tagliato e l'EDL viene tirato fino al ginocchio. Questo espone il tendine prossimale del peroneo longus (PL) contrassegnato con una freccia. Le linee tratteggiate indicano dove tagliare con le forbici per rimuovere l'EDL (verde) e il PL (blu). (E) L'EDL e la TA vengono rimossi. (F) Una sutura viene posta attraverso il tendine prossimale del PL. (G) Lo xenotrapianto viene posto nel compartimento tibiale vuoto e suturato al tendine pISciale PL utilizzando un nodo quadrato chirurgico a due mani. (H) Una sutura viene posta attraverso il tendine distale del PL, contrassegnato con una freccia, e un altro nodo quadrato chirurgico a due mani viene utilizzato per suturare lo xenotrapianto al tendine distale. (I) Lo xenotrapianto è completamente trapiantato e suturato al PL. (J) La pelle è chiusa con colla chirurgica. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59966/59966fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Sequenza di procedure chirurgiche su pelle di ratto, che mostra l'incisione e l'esposizione dei tessuti per la ricerca medica." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59966/59966fig03.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> Figura 3: Collezione Xenotrapianto di 4 mesi. (A) I capelli vengono rimossi dal sito chirurgico. Le suture sono visibili sotto la pelle. (B) La pelle sovrastante lo xenotrapianto viene rimossa. Quindi lo xenotrapianto viene afferrato con le pinze dell'iride alla sutura disal e delicatamente tirato verso l'alto. A partire dalla caviglia, un bisturi viene utilizzato per tagliare lungo la tibia e liberare lo xenotrapianto. La freccia mostra l'inizio dell'incisione lungo la tibia. (C) Tirando il muscolo gastrocnemio di lato, una debole linea bianca di epimysio che separa il muscolo peroneo longus (PL) e il gastrocnemio (mostrato dalla freccia) diventa visibile. Utilizzare il bisturi per tagliare lungo questa linea per separare il PL dagli altri muscoli delle gambe. (D) Il lato destro dello xenotrapianto, e il PL sono ora liberi dagli altri muscoli della gamba e sono pronti per la rimozione. La linea tratteggiata indica dove tagliare con le forbici chirurgiche per iniziare a rimuovere lo xenotrapianto e PL. (E) Dopo il taglio sotto la sutura distale, deviare lo xenotrapianto verso il ginocchio. La linea tratteggiata indica dove tagliare con le forbici chirurgiche per rimuovere lo xenotrapianto e il PL dal vano tibiale. (F) Lo scomparto tibiale vuoto con lo xenotrapianto e il PL sono stati rimossi con successo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59966/59966fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Gli xenografi derivati dal paziente sono un modo innovativo per modellare le malattie muscolari e condurre studi preclinici. Il metodo qui descritto per creare xenogratti muscolari scheletrici è rapido, diretto e riproducibile. Gli interventi chirurgici unilaterali possono essere eseguiti in 15-25 minuti, o bilateralmente in 30 a 40 minuti. Gli xenotrapianto bilaterali possono fornire ulteriore flessibilità sperimentale. Per esempio, i ricercatori possono eseguire il trattamento localizzato di uno xenotrapianto, con l'al...

È stato riferito che solo 13.8% di tutti i programmi di sviluppo di farmaci in fase di sperimentazione clinica hanno successo e portano a terapie approvate1. Mentre questo tasso di successo è superiore al 10,4% precedentemente riportato2, c'è ancora significativo margine di miglioramento. Un approccio per aumentare il tasso di successo degli studi clinici è quello di migliorare i modelli di laboratorio utilizzati nella ricerca preclinica. La Food and Drug Administration (FDA) richiede studi sugli animali per mostrare l'efficacia del trattamento e valutare la tossicità prima degli studi clinici di fase 1. Tuttavia, c'è spesso una concordanza limitata negli esiti del trattamento tra studi sugli animali e studi clinici3. Inoltre, la necessità di studi sugli animali preclinici può essere una barriera insormontabile per lo sviluppo terapeutico in malattie che non hanno un modello animale accettato, che spesso accade per le malattie rare o sporadiche.
Un modo per modellare la malattia umana è trapiantare il tessuto umano in topi immunodeficienti per generare xenografi. Ci sono tre vantaggi principali per i modelli di xenotrapianto: in primo luogo, possono ricapitolare le complesse anomalie genetiche ed epigenetiche che esistono nella malattia umana che potrebbero non essere mai riproducibili in altri modelli animali. In secondo luogo, gli xenografi possono essere utilizzati per modellare malattie rare o sporadiche se sono disponibili campioni di pazienti. In terzo luogo, gli xenogratto modellano la malattia all'interno di un sistema in vivo completo. Per questi motivi, ipotizziamo che i risultati dell'efficacia del trattamento nei modelli di xenotrapianto siano più propensi a tradursi in sperimentazioni in pazienti. Gli xenografi tumorali umani sono già stati utilizzati con successo per sviluppare trattamenti per tumori comuni, tra cui mieloma multiplo, così come terapie personalizzate per singoli pazienti4,5,6, 7.
Recentemente, gli xenogratto sono stati utilizzati per sviluppare un modello di malattia muscolare umana8. In questo modello, i campioni di biopsia muscolare umana vengono trapiantati negli arti posteriori di topi NRG immunodeficienti per formare xenografi. Le miofibre umane trapiantate muoiono, ma le cellule staminali muscolari umane presenti nello xenotrapianto successivamente si espandono e si differenziano in nuove miofibre umane che ripopolano la lamina basale umana innestata. Pertanto, le miofibre rigenerate in questi xenotrapianto sono interamente umane e vengono spontaneamente vascolarizzate e innervate dall'ospite del topo. è importante sottolineare che il fascio, la distrofia muscolare scapopulohumerale (FSHD) del tessuto muscolare del paziente trapiantato nei topi ricapitola le caratteristiche chiave della malattia umana, vale a dire l'espressione del fattore di trascrizione DUX4 8. La FSHD è causata dalla sovraespressione del DUX4, che è epigeneticamente silenziato nel tessuto muscolare normale9,10. Nel modello xenotrapianto FSHD, il trattamento con un morfolino specifico del DUX4 ha dimostrato di reprimere con successo l'espressione e la funzione di DUX4 e può essere una potenziale opzione terapeutica per i pazienti fsHD11. Questi risultati dimostrano che gli xenogratti muscolari umani sono un nuovo approccio per modellare la malattia muscolare umana e testare potenziali terapie nei topi. Qui, descriviamo in dettaglio il metodo chirurgico per la creazione di xenografi muscolari scheletrici umani in topi immunodeficienti.

<table><tbody><tr><td>Piastra di Petri da 100 mm x 15 mm</td><td>Fisher</td><td>Scientific FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>2-metilbutano</td><td>Fisher</td><td>O3551-4</td><td></td></tr><tr><td>Vetro di copertura micro da 20 mm x 30 mm</td><td>VWR</td><td>48393-151</td><td></td></tr><tr><td>Bilancia per animali</td><td>Kent Scientific</td><td>SCL-1015</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione antibiotica-antimicotica</td><td>Corning, Cellgro</td><td>30-004-CI</td><td></td></tr><tr><td>Sistema AutoClip</td><td>F.S.T</td><td>12020-00</td><td></td></tr><tr><td>Castroviejo Porta aghi</td><td>F.S.T</td><td>12565-14</td><td></td></tr><tr><td>Estratto di embrione di pollo</td><td>Accurato</td><td>CE650TL</td><td></td></tr><tr><td>CM1860 Criostato UV</td><td>Leica Biosystems</td><td>CM1860UV</td><td></td></tr><tr><td>Vaso di colorazione Coplin</td><td>Thermo Scientific</td><td>19-4</td><td></td></tr><tr><td>Perni di dissezione</td><td>Fisher Scientific</td><td>S13976</td><td></td></tr><tr><td>Ghiaccio secco - pellet</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9584462</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo della miosina embrionale</td><td>DSHB</td><td>F1.652</td><td>concentrazione consigliata 1:10</td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>Fisher Scientific</td><td>459836</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30071.01</td><td></td></tr><tr><td>Fiber-Lite MI-150</td><td>Dolan-Jenner</td><td>Mi-150</td><td></td></tr><tr><td>Pinze</td><td>F.S.T</td><td>11295-20</td><td></td></tr><tr><td>Capra anti-topo IgG1, Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-21121</td><td>concentrazione consigliata 1:500</td></tr><tr><td>Capra anti-topo IgG2b, AlexaFluor 594</td><td>Invitrogen</td><td>A-21145</td><td>concentrazione consigliata 1:500</td></tr><tr><td>Gomma adragante</td><td>Sigma</td><td>G1128</td><td></td></tr><tr><td>Prosciutti F-10 Medium</td><td>Corning</td><td>10-070-CV</td><td></td></tr><tr><td>Histoacryl Blue Topical Skin Adhesive</td><td>Sigillo tissutale</td><td>TS1050044FP</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo A/C specifico per la lamina umana</td><td>Abcam</td><td>ab40567</td> concentrazione <td>consigliata 1:50-1:100</td></tr><tr><td>Anticorpo specifico per spettro umano</td><td>Leica Biosystems</td><td>NCLSPEC1</td><td>concentrazione consigliata 1:20-1:100</td></tr><tr><td>Camera di induzione</td><td>VetEquip</td><td>941444</td><td></td></tr><tr><td>Pinze per iride</td><td>F.S.T</td><td>11066-07</td><td></td></tr><tr><td>Irradiated Global 2018 (Uniprim 4100 ppm)</td><td>Envigo</td><td>TD.06596</td><td>Antibiotica dieta per roditori per proteggere nuovamente le infezioni respiratorie</td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>MWI Veterinary Supply</td><td>502017</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34155</td><td>salviette chirurgiche</td></tr><tr><td>Mapleson E Breathing Circuit</td><td>VetEquip</td><td>921412</td><td></td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>Fisher Scientific</td><td>A412</td><td></td></tr><tr><td>Macchina per anestesia mobile</td><td>VetEquip</td><td>901805</td><td></td></tr><tr><td>Mouse on Mouse Kit di base</td><td>Vector Laboratories</td><td>BMK-2202</td><td>mouse IgG blocking reagente</td></tr><tr><td>Smalto per unghie</td><td>Microscopia elettronica Sciences</td><td>72180</td><td></td></tr><tr><td>NAIR Lozione/olio per la rimozione dei peli</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0132811</td><td></td></tr><tr><td>NOD-Rag1null IL2rg null (NRG) topi</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>007799</td> 2 <td>a 3 mesi</td></tr><tr><td>O.C.T. Compound</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-730-571</td><td></td></tr><tr><td>Oxygen</td><td>Airgas</td><td>OX USPEA</td><td></td></tr><tr><td>PBS (soluzione salina tamponata con fosfato)</td><td>Fisher Scientific</td><td>4870500</td><td></td></tr><tr><td>Povidone Iodio Soluzione di preparazione</td><td>Dynarex</td><td>1415</td><td></td></tr><tr><td>ProLong&trade; Montante Oro Antisbiadimento</td><td>Fisher Scientific</td><td>P10144 (no DAPI); P36935 (con DAPI)</td><td></td></tr><tr><td>Unguento oftalmico Puralube</td><td>Dechra</td><td>17033-211-38</td><td></td></tr><tr><td>Rimadyl (carprofene) iniettabile</td><td>Patterson Veterinario</td><td>10000319</td><td>analgesico chirurgico, somministrato per via sottocutanea alla dose di 5 mg/kg</td></tr><tr><td>Lame per bisturi - #11</td><td>FST</td><td>10011-00</td><td></td></tr><tr><td>Manico per bisturi - #3</td><td>FST</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>Stereo Microscopio</td><td>Accu-scope</td><td>3075</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus Vetrini per microscopio</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Sutura, sintetica, non assorbibile, 30 pollici di lunghezza, ago CV-11</td><td>Siringa Covidien</td><td>VP-706-X</td><td></td></tr><tr><td>da 1 ml (calibro 26, ago da 3/8 di pollice)</td><td>BD Biosciences</td><td>329412</td><td></td></tr><tr><td>Trimmer</td><td>Kent Scientific</td><td>CL9990-KIT</td><td></td></tr><tr><td>Forbici a molla Vannas, tagliente da 8,0 mm</td><td>F.S.T</td><td>15009-08</td><td></td></tr><tr><td>Filtro a carboni attivi VaporGaurd</td><td>VetEquip</td><td>931401</td><td></td></tr><tr><td>Clip per ferite, 9 mm</td><td>F.S.T</td><td>12022-09</td><td></td></tr></tbody></table>

esecuzione di xenografi muscolari scheletrici umani in topi immunodeficienti

Performing Human Skeletal Muscle Xenografts in Immunodeficient Mice

Gli effetti del trattamento osservati negli studi sugli animali spesso non vengono riassunti negli studi clinici. Mentre questo problema è multiforme, uno dei motivi di questo fallimento è l'uso di modelli di laboratorio inadeguati. È difficile modellare malattie umane complesse negli organismi di laboratorio tradizionali, ma questo problema può essere aggirato attraverso lo studio degli xenografi che si possono fare attraverso l'uomo. Il metodo chirurgico che descriviamo qui permette la creazione di xenogratti muscolari scheletrici umani, che possono essere utilizzati per modellare la malattia muscolare e per effettuare test terapeutici preclinici. In base a un protocollo approvato dall'IRB (Institutional Review Board), i campioni muscolari scheletrici vengono acquisiti dai pazienti e poi trapiantati in topi ospiti NOD-Rag1nullIL2r . Questi topi sono ospiti ideali per gli studi di trapianto a causa della loro incapacità di fare linfociti maturi e sono quindi in grado di sviluppare risposte immunitarie adattative mediate dalle cellule e morali. I topi ospiti sono anestetizzati con isoflurane e i muscoli del tibialis anteriore ed estensore del digitalum vengono rimossi. Un pezzo di muscolo umano viene quindi collocato nello scomparto tibiale vuoto e suturato ai tendini prossimali e distali del muscolo longus peroneo. Il muscolo xenotrapianto è spontaneamente vascolarizzato e innervato dall'ospite del topo, risultando in un muscolo umano robustamente rigenerato che può servire come modello per gli studi preclinici.

Come dimostrato da Yuanfan e altri, questo protocollo chirurgico è un metodo semplice per produrre xenografi muscolari scheletrici umani8. Gli xenogratto rigenerati diventano spontaneamente innervati e mostrano contrattilità funzionale. Inoltre, lo xenotrapianto muscolare da parte dei pazienti affetti da FSHD riassume i cambiamenti nell'espressione genica osservati nei pazienti affetti da FSHD8.
Nella nostra esperienza, circa 7 degli 8 xenografti...

Le malattie umane complesse possono essere difficili da modellare nei sistemi di modelli di laboratorio tradizionali. Qui, descriviamo un approccio chirurgico per modellare la malattia muscolare umana attraverso il trapianto di biopsie muscolari scheletriche umane in topi immunodeficienti.

Esecuzione di Xenografi muscolari scheletrici umani in topi immunodeficienti

Treatment effects observed in animal studies often fail to be recapitulated in clinical trials. While this problem is multifaceted, one reason for this ...

Questo protocollo è significativo perché può essere utilizzato per creare xenografti muscolari scheletrici umani, che possono essere utilizzati per modellare le malattie muscolari e per effettuare test terapeutici preclinici. Questo modello di xenoinnesto consente ai ricercatori di studiare il muscolo umano in vivo per comprendere meglio la biologia delle cellule muscolari umane e sviluppare nuovi modelli per malattie muscolari rare o acquisite. Dopo aver ottenuto una biopsia muscolare umana, posizionare il campione in una piastra di Petri di 100 x 15 millimetri contenente mezzo muscolare e utilizzare un microscopio stereo e forbici chirurgiche per rimuovere qualsiasi fascia o tessuto adiposo rimanente.Sezionare la biopsia muscolare in pezzi di circa sette per tre per tre millimetri, facendo attenzione che le fibre siano disposte longitudinalmente all'interno del campione. Successivamente, trasferire la piastra di Petri contenente il muscolo sezionato sul ghiaccio e posizionare suture sintetiche non assorbibili in una piastra di Petri da 100 per 15 millimetri del 70% di etanolo. Dopo aver confermato una mancanza di risposta al dito del piedino in un topo NOD-Rag-gamma anestetizzato

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Research

Ricerca

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia dello sviluppo

Monitoraggio Dinamica di attecchimento muscolare nei piccoli animali da In Vivo Fluorescente Imaging

Un metodo affidabile per l'innesto luciferasi-tagged umani maligni dei nervi periferici cellule tumorali della guaina nel nervo sciatico di topi immunodeficienti è descritto. L'uso di immagini bioluminescenza per dimostrare corretta predisposizione degli innesti del tumore ed i criteri per la segregazione casuale di animali in gruppi di studio vengono anche discussi.

Xenotrapianto ortotopico di Human-luciferasi con tag cellule maligne del tumore della guaina dei nervi periferici per In vivo Test di agenti terapeutici candidati

Qui, descriviamo una metodologia per fornire cordone umano derivati ​​dal sangue umano endoteliali che formano colonie cellule (ECFCs) e dal midollo osseo le cellule staminali mesenchimali (MSCs), inserita in un collagene / fibronectina gel, per via sottocutanea in topi immunodeficienti. Questa cella / gel combinazione genera una rete umana vascolare che collega con la vascolarizzazione del mouse.

Bioingegneria reti umane in topi immunodeficienti microvascolari

Questo video mostra un metodo per innestare pelle umana su un topo immunodeficiente con una risposta neutrofila soppressa. Il metodo prevede l'applicazione di pelle umana a spessore diviso sul letto di innesto del topo, sigillandolo e coprendolo per il recupero. Alla fine, la pelle umana aderisce alla pelle del topo, stabilendo la vascolarizzazione e la circolazione, con conseguente xenotrapianto cutaneo di successo.

Una tecnica per l'innesto di pelle umana in un modello murino

Questo video mostra un test per generare un modello murino di xenotrapianto umanizzato. A un topo immunocompromesso viene iniettata ciclofosfamide per causare la deplezione delle cellule immunitarie. Le cellule tumorali derivate dal paziente mescolate con cellule mononucleate del sangue periferico umano (PBMC) in un idrogel vengono iniettate per via sottocutanea nel topo, formando un tumore con cellule T infiltranti.

Una tecnica per generare un modello murino di xenotrapianto umanizzato innestato con PBMC umano

I progenitori miogenici derivati da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) sono promettenti candidati per le strategie di terapia cellulare per il trattamento delle distrofie muscolari. Questo protocollo descrive i trapianti e le misurazioni funzionali necessarie per valutare l'innesto e la differenziazione dei mesoangioblasti derivati dall'iPSC (un tipo di progenitori muscolari) nei modelli di topo di rigenerazione muscolare acuta e cronica.

Trapianto di progenitori miogenici pluripotenti derivati da cellule staminali indotte simili a mesoangioblasti nei modelli di topo di rigenerazione muscolare

Xenotrapianti tumorali umani in topi immunodeficienti sono strumenti preziosi per studiare biologia del cancro. Sono descritti i protocolli specifici per generare xenotrapianti sottocutanei e intraepatiche da cellule di carcinoma epatocellulare umani o frammenti di tumore. Rigenerazione epatica indotta da epatectomia parziale in topi riceventi si presenta come una strategia per facilitare l'attecchimento intraepatica.

Generazione di sottocutaneo e intraepatica umane carcinoma epatocellulare xenotrapianti in topi immunodeficienti

Descriviamo una tecnica sperimentale che chiamiamo minimamente invasiva muscolo Embedding (MIME), che si basa sull'evidenza che il tessuto muscolare scheletrico contiene cellule miogeniche vitali che possono facilitare la miogenesi donatore-cellula-mediata quando impiantato nel un muscolo di host.

Minimamente invasiva muscolo incorporamento (MIME) - una nuova tecnica sperimentale per facilitare la miogenesi donatore-cellulo-mediata

Presentiamo tecniche per isolare, coltivare, caratterizzare e differenziare le cellule progenitrici muscolari primarie umane (hMMP) ottenute dal tessuto della biopsia muscolare scheletrica.  Gli hMPC ottenuti e caratterizzati attraverso questi metodi possono essere utilizzati per affrontare successivamente le domande di ricerca relative alla miogenesi umana e alla rigenerazione muscolare scheletrica.

Isolamento, cultura, caratterizzazione e differenziazione delle cellule del progenitore muscolare umano dalla procedura di biopsia muscolare scheletrica

Il presente protocollo descrive come innestare la pelle umana su topi del recettore della catena gamma (NSG) diabetici non obesi (NOD)-scid. Una descrizione dettagliata della preparazione della pelle umana per il trapianto, la preparazione di topi per il trapianto, il trapianto di pelle umana a spessore diviso e la procedura di recupero post-trapianto sono inclusi nella relazione.

Modello cutaneo di xenotrapianto per manipolare le risposte immunitarie umane in vivo

Le iniezioni intrafemorali consentono l'attecchimento di un piccolo numero di cellule staminali e progenitrici ematopoietiche (HSPC), posizionando le cellule direttamente nella cavità del midollo osseo. Qui descriviamo un protocollo sperimentale di iniezione intrafemorale di HSPC umane in topi immunodeficienti.

Iniezione intrafemorale di cellule staminali e progenitrici ematopoietiche umane in topi immunocompromessi 

Scopri come creare xenoinnesti di muscolo scheletrico umano in topi immunodeficienti NRG. Questo protocollo chirurgico consente la modellazione in vivo di malattie muscolari e il test preclinico di terapie.

Esecuzione di Xenografi muscolari scheletrici umani in topi immunodeficienti

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