Name: Misurazione specifica del ciclo cellulare di zH2AX e Apoptosis Dopo lo stress genotossico da citometria di flusso (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 21 s
Description: Impara a misurare γH2AX e apoptosi specifiche del ciclo cellulare mediante citometria di flusso dopo stress genotossico. Questo metodo combina l'analisi delle rotture del DNA, la distribuzione del ciclo cellulare e l'apoptosi per valutare la riparazione del danno.

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Ringraziamo il team di Flow Cytometry Facility presso il German Cancer Research Center (DKF) per il loro supporto.

<ol><li>Jensen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+non-small+cell+lung+cancer+with+intensity-modulated+radiation+therapy+in+combination+with+cetuximab%3A+the+NEAR+protocol+%28NCT00115518%29%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Treatment of non-small cell lung cancer with intensity-modulated radiation therapy in combination with cetuximab: the NEAR protocol (NCT00115518).</a> BMC Cancer. 6, 122(2006).</li>
<li>Oertel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Glioblastoma+and+Carcinoma+Xenograft+Tumors+Treated+by+Combined+Radiation+and+Imatinib+%28Gleevec%29%5BTitle%5D)+AND+%22Strahlentherapie+und+Onkologie%22%5BJournal%5D)">Human Glioblastoma and Carcinoma Xenograft Tumors Treated by Combined Radiation and Imatinib (Gleevec).</a> Strahlentherapie und Onkologie. 182 (7), 400-407 (2006).</li>
<li>Timke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+of+Vascular+Endothelial+Growth+Factor+Receptor%2FPlatelet-Derived+Growth+Factor+Receptor+Inhibition+Markedly+Improves+Radiation+Tumor+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Combination of Vascular Endothelial Growth Factor Receptor/Platelet-Derived Growth Factor Receptor Inhibition Markedly Improves Radiation Tumor Therapy.</a> Clinical Cancer Research. 14 (7), 2210-2219 (2008).</li>
<li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trimodal+glioblastoma+treatment+consisting+of+concurrent+radiotherapy%2C+temozolomide%2C+and+the+novel+TGF-%CE%B2+receptor+I+kinase+inhibitor+LY2109761%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Trimodal glioblastoma treatment consisting of concurrent radiotherapy, temozolomide, and the novel TGF-β receptor I kinase inhibitor LY2109761.</a> Neoplasia. 13 (6), 537-549 (2011).</li>
<li>Blattmann, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suberoylanilide+hydroxamic+acid+affects+expression+in+osteosarcoma%2C+atypical+teratoid+rhabdoid+tumor+and+normal+tissue+cell+lines+after+irradiation%5BTitle%5D)+AND+%22Strahlentherapie+und+Onkologie%22%5BJournal%5D)">Suberoylanilide hydroxamic acid affects expression in osteosarcoma, atypical teratoid rhabdoid tumor and normal tissue cell lines after irradiation.</a> Strahlentherapie und Onkologie. 188 (2), 168-176 (2012).</li>
<li>Hoeijmakers, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Damage%2C+Aging%2C+and+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">DNA Damage, Aging, and Cancer.</a> New England Journal of Medicine. 361 (15), 1475-1485 (2015).</li>
<li>Rodgers, K., McVey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Error-Prone+Repair+of+DNA+Double-Strand+Breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Error-Prone Repair of DNA Double-Strand Breaks.</a> Journal of Cellular Physiology. 231 (1), 15-24 (2016).</li>
<li>Ciccia, A., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DNA+Damage+Response%3A+Making+It+Safe+to+Play+with+Knives%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">The DNA Damage Response: Making It Safe to Play with Knives.</a> Molecular Cell. 40 (2), 179-204 (2010).</li>
<li>Rothkamm, K., Krüger, I., Thompson, L. H., Löbrich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathways+of+DNA+double-strand+break+repair+during+the+mammalian+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Pathways of DNA double-strand break repair during the mammalian cell cycle.</a> Molecular and Cellular Biology. 23 (16), 5706-5715 (2003).</li>
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<li>Bakr, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+crosstalk+between+DNA+damage+response+proteins+53BP1+and+BRCA1+regulates+double+strand+break+repair+choice%5BTitle%5D)+AND+%22Radiotherapy+and+Oncology%22%5BJournal%5D)">Functional crosstalk between DNA damage response proteins 53BP1 and BRCA1 regulates double strand break repair choice.</a> Radiotherapy and Oncology. 119 (2), 276-281 (2015).</li>
<li>Mladenov, E., Magin, S., Soni, A., Iliakis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+double-strand-break+repair+in+higher+eukaryotes+and+its+role+in+genomic+instability+and+cancer%3A+Cell+cycle+and+proliferation-dependent+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cancer+Biology%22%5BJournal%5D)">DNA double-strand-break repair in higher eukaryotes and its role in genomic instability and cancer: Cell cycle and proliferation-dependent regulation.</a> Seminars in Cancer Biology. 37-38, 51-64 (2016).</li>
<li>Lopez Perez, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage+response+of+clinical+carbon+ion+versus+photon+radiation+in+human+glioblastoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Radiotherapy+and+Oncology%22%5BJournal%5D)">DNA damage response of clinical carbon ion versus photon radiation in human glioblastoma cells.</a> Radiotherapy and Oncology. 133, 77-86 (2019).</li>
<li>Oertel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+of+suberoylanilide+hydroxamic+acid+with+heavy+ion+therapy+shows+promising+effects+in+infantile+sarcoma+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Radiation+oncology%22%5BJournal%5D)">Combination of suberoylanilide hydroxamic acid with heavy ion therapy shows promising effects in infantile sarcoma cell lines.</a> Radiation oncology. 6 (1), 119(2011).</li>
<li>Blattmann, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suberoylanilide+hydroxamic+acid+affects+%CE%B3H2AX+expression+in+osteosarcoma%2C+atypical+teratoid+rhabdoid+tumor+and+normal+tissue+cell+lines+after+irradiation%5BTitle%5D)+AND+%22Strahlentherapie+und+Onkologie%22%5BJournal%5D)">Suberoylanilide hydroxamic acid affects γH2AX expression in osteosarcoma, atypical teratoid rhabdoid tumor and normal tissue cell lines after irradiation.</a> Strahlentherapie und Onkologie. 188 (2), 168-176 (2012).</li>
<li>Thiemann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+efficacy+of+the+histone+deacetylase+inhibitor+suberoylanilide+hydroxamic+acid+in+combination+with+radiotherapy+in+a+malignant+rhabdoid+tumor+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Radiation+Oncology%22%5BJournal%5D)">In vivo efficacy of the histone deacetylase inhibitor suberoylanilide hydroxamic acid in combination with radiotherapy in a malignant rhabdoid tumor mouse model.</a> Radiation Oncology. 7 (1), 52(2012).</li>
<li>Nicolay, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+retain+their+defining+stem+cell+characteristics+after+exposure+to+ionizing+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Radiation+Oncology+Biology+Physics%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells retain their defining stem cell characteristics after exposure to ionizing radiation.</a> International Journal of Radiation Oncology Biology Physics. 87 (5), 1171-1178 (2013).</li>
<li>Nicolay, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+are+resistant+to+carbon+ion+radiotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells are resistant to carbon ion radiotherapy.</a> Oncotarget. 6 (4), 2076-2087 (2015).</li>
<li>Nicolay, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+exhibit+resistance+to+topoisomerase+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+letters%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells exhibit resistance to topoisomerase inhibition.</a> Cancer letters. 374 (1), 75-84 (2016).</li>
<li>Nicolay, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+maintain+their+defining+stem+cell+characteristics+after+treatment+with+cisplatin%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells maintain their defining stem cell characteristics after treatment with cisplatin.</a> Scientific Reports. 6, 20035(2016).</li>
<li>Nicolay, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+are+sensitive+to+bleomycin+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells are sensitive to bleomycin treatment.</a> Scientific Reports. 6, 26645(2016).</li>
<li>Rühle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cisplatin+radiosensitizes+radioresistant+human+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Cisplatin radiosensitizes radioresistant human mesenchymal stem cells.</a> Oncotarget. 8 (50), 87809-87820 (2017).</li>
<li>Münz, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+mesenchymal+stem+cells+lose+their+functional+properties+after+paclitaxel+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Human mesenchymal stem cells lose their functional properties after paclitaxel treatment.</a> Scientific Reports. 8 (1), 312(2018).</li>
<li>Rühle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Radiation+Resistance+of+Human+Multipotent+Mesenchymal+Stromal+Cells+Is+Independent+of+Their+Tissue+of+Origin%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Radiation+Oncology+Biology+Physics%22%5BJournal%5D)">The Radiation Resistance of Human Multipotent Mesenchymal Stromal Cells Is Independent of Their Tissue of Origin.</a> International Journal of Radiation Oncology Biology Physics. 100 (5), 1259-1269 (2018).</li>
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<li>Schipler, A., Iliakis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+double-strand-break+complexity+levels+and+their+possible+contributions+to+the+probability+for+error-prone+processing+and+repair+pathway+choice%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">DNA double-strand-break complexity levels and their possible contributions to the probability for error-prone processing and repair pathway choice.</a> Nucleic Acids Research. 41 (16), 7589-7605 (2013).</li>
<li>Stenerlow, B., Hoglund, E., Carlsson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+fragmentation+by+charged+particle+tracks%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Space+Research%22%5BJournal%5D)">DNA fragmentation by charged particle tracks.</a> Advances in Space Research. 30 (4), 859-863 (2002).</li>
<li>Friedland, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+track-structure+based+evaluation+of+DNA+damage+by+light+ions+from+radiotherapy-relevant+energies+down+to+stopping%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Comprehensive track-structure based evaluation of DNA damage by light ions from radiotherapy-relevant energies down to stopping.</a> Scientific Reports. 7, 45161(2017).</li>
<li>Pang, D., Chasovskikh, S., Rodgers, J. E., Dritschilo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+DNA+Fragments+Are+a+Hallmark+of+Heavy+Charged-Particle+Irradiation+and+May+Underlie+Their+Greater+Therapeutic+Efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Oncology%22%5BJournal%5D)">Short DNA Fragments Are a Hallmark of Heavy Charged-Particle Irradiation and May Underlie Their Greater Therapeutic Efficacy.</a> Frontiers in Oncology. 6, 130(2016).</li>
<li>Böcker, W., Iliakis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+Methods+for+analysis+of+foci%3A+validation+for+radiation-induced+gamma-H2AX+foci+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Radiation+Research%22%5BJournal%5D)">Computational Methods for analysis of foci: validation for radiation-induced gamma-H2AX foci in human cells.</a> Radiation Research. 165 (1), 113-124 (2006).</li>
<li>Löbrich, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B3H2AX+foci+analysis+for+monitoring+DNA+double-strand+break+repair%3A+Strengths%2C+limitations+and+optimization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">γH2AX foci analysis for monitoring DNA double-strand break repair: Strengths, limitations and optimization.</a> Cell Cycle. 9 (4), 662-669 (2010).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il metodo in primo piano è facile da usare e offre una misurazione veloce, accurata e riproducibile della risposta al danno del DNA, tra cui l'induzione e la riparazione a doppio filamento (DSB), effetti del ciclo cellulare e morte delle cellule apoptotiche. La combinazione di questi endpoint fornisce un quadro più completo delle loro interrelazioni rispetto ai singoli saggi. Il metodo può essere ampiamente applicato come un test completo sulla genotossicità nei campi della biologia delle radiazioni, della terapia e dell...

L'obiettivo dell'oncologia è quello di uccidere o inattivare le cellule tumorali senza danneggiare le cellule normali. Molte terapie o direttamente o indirettamente inducono stress genotossico nelle cellule tumorali, ma anche ad alcuni si estendono nelle cellule normali. La chemioterapia o i farmaci mirati sono spesso combinati con la radioterapia per migliorare la radiosensibilità del tumore irradiato1,2,3,4, 5, che consente una riduzione di la dose di radiazioni per ridurre al minimo i normali danni ai tessuti.
Le radiazioni ionizzanti e altri agenti genotossici inducono diversi tipi di danni al DNA, tra cui modifiche alla base, collegamenti di filamento e rotture a singolo o doppio filamento. Le rotture del doppio filamento del DNA (DSB) sono le lesioni più gravi del DNA e la loro induzione è fondamentale per l'effetto di uccisione delle cellule delle radiazioni ionizzanti e di vari farmaci citostatici nella radiochemioterapia. I DSB non solo danneggiano l'integrità del genoma, ma promuovono anche la formazione di mutazioni6,7. Pertanto, diversi percorsi di riparazione DSB, e meccanismi per eliminare le cellule irreparabilmente danneggiate come l'apoptosi si sono sviluppati durante l'evoluzione. L'intera risposta al danno del DNA (DDR) è regolata da una complessa rete di percorsi di segnalazione che raggiungono il riconoscimento dei danni del DNA e l'arresto del ciclo cellulare per consentire la riparazione del DNA, la morte cellulare programmata o l'inattivazione in caso di guasto di riparazione8.
Il metodo citometrico del flusso presentato è stato sviluppato per studiare la DDR dopo lo stress genotossico in un test completo che copre l'induzione e la riparazione di DSB, nonché le conseguenze del guasto alla riparazione. Combina la misurazione del marcatore DSB ampiamente applicato: HH2AX con l'analisi del ciclo cellulare e l'induzione dell'apoptosi, utilizzando l'analisi classica subG1 e una valutazione più specifica dell'attivazione della caspase-3.
La combinazione di questi endpoint in un'unica analisi non solo riduce le spese di tempo, manodopera e costi, ma consente anche la misurazione specifica del ciclo cellulare dell'induzione e della riparazione di DSB, nonché l'attivazione della caspase-3. Tali analisi non sarebbero possibili con i saggi condotti in modo indipendente, ma sono molto rilevanti per una comprensione completa della risposta al danno del DNA dopo lo stress genotossico. Molti farmaci anticancro, come i composti citostatici, sono diretti contro la divisione delle cellule e la loro efficienza è fortemente dipendente dallo stadio del ciclo cellulare. La disponibilità di diversi processi di riparazione DSB dipende anche dalla fase del ciclo cellulare e dalla scelta del percorso che è fondamentale per la precisione di riparazione, e a sua volta determina il destino della cella9,10,11, 12. Inoltre, la misurazione specifica del ciclo cellulare dei livelli di DSB è più accurata dell'analisi in pool, perché i livelli di DSB non dipendono solo dalla dose di un composto o radiazione genotosi, ma anche dal contenuto di DNA della cellula.
Il metodo è stato utilizzato per confrontare l'efficacia di diverse radioterapie per superare i meccanismi di resistenza nel glioblastoma13 e per analizzare l'interazione tra radiazioni ionizzanti e farmaci mirati nell'osteosarcoma14,15 e tumori teratoidi atipici16. Inoltre, il metodo descritto è stato ampiamente utilizzato per analizzare gli effetti collaterali della radio e della chemioterapia sulle cellule staminali mesenchymale17,18,19,20,21, 22,23,24, che sono essenziali per la riparazione del danno tissutale normale indotto dal trattamento e hanno una potenziale applicazione nella medicina rigenerativa.

<table><tbody><tr><td>1.000 &micro; L punte filtranti</td><td>Nerbe plus</td><td>07-693-8300</td><td></td></tr><tr><td>100-1.000 &micro; L pipetta</td><td>Eppendorf</td><td>3123000063</td><td></td></tr><tr><td>provette da 12 mm x 75 mm con tappo filtrante per cellule, 35 &; micro; m dimensione dei pori a maglia</td><td>BD Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>provette da 15 mL</td><td>BD Falcon</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>200 &micro; L punte filtranti</td><td>Nerbe plus</td><td>07-662-8300</td><td></td></tr><tr><td>20-200 &; L pipetta</td><td>Eppendorf</td><td>3123000055</td><td></td></tr><tr><td>4',6-Diamidin-2-fenilindol (DAPI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td>Sciogliere in acqua a 200 &; micro; g/mL e conservare le aliquote a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 anti-H2A.X Phospho (Ser139) Anticorpo, RRID: AB_2248011</td><td>BioLegend</td><td>613406</td><td>Diluire 1:20</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Anticorpo anti-caspasi-3 di coniglio, AB_1727414</td><td>BD Pharmingen</td><td>560626</td><td>Diluire 1:20</td></tr><tr><td>BD FACSCleansolution</td><td>BD Biosciences</td><td>340345</td><td>Per la routine di pulizia del citometro dopo la misurazione</td></tr><tr><td>BD FACSRinse solution</td><td>BD Biosciences</td><td>340346</td><td>Per la routine di pulizia del citometro dopo la misurazione</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)</td><td>Biochrom</td><td>L 182</td><td>Sciogliere in acqua fino a una concentrazione 1x</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium con glutammina stabile</td><td>Biochrom</td><td>FG 0415</td><td>Materiale di coltura cellulare di routine per la linea cellulare di esempio utilizzata nel protocollo</td></tr><tr><td>Etanolo assoluto</td><td>VWR</td><td>20821.330</td><td></td></tr><tr><td>Software Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FBS Superior (siero fetale bovino)</td><td>Biochrom</td><td>S 0615</td><td>Materiale di coltura cellulare di routine per la linea cellulare di esempio utilizzata nel protocollo</td></tr><tr><td>FlowJo v10 software</td><td>LLC</td><td>ordine</td><td></td>online</tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-01</td><td>Terreno di inclusione per la preparazione opzionale di vetrini microscopici da campioni colorati</td></tr><tr><td>Filtri in cellulosa piegata, grado 3hw</td><td>NeoLab</td><td>11416</td><td></td></tr><tr><td>LSRII o LSRCitometro a base</td> di <td>acqua BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MG132</td><td>Calbiochem</td><td>474787</td><td>farmaco opzionale per il controllo positivo dell'apoptosi</td></tr><tr><td>Multifuge 3SR+</td><td>Heraeus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>AppliChem</td><td>A3813</td><td>Preparare una soluzione fresca al 4,5%. Diluire in PBS riscaldando a 80 &deg; C con agitazione lenta sotto la cappa aspirante. Coprire il pallone con un foglio di alluminio per evitare la perdita di calore. Lasciare raffreddare la soluzione a temperatura ambiente e regolare il volume finale. Passare la soluzione attraverso un filtro di cellulosa.</td></tr><tr><td>Fosfo-istone H3 (Ser10) (D2C8) XP Coniglio mAb (Alexa Fluor® 555 Conjugate) RRID: AB_10694639</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>#3475</td><td>Diluire 3:200</td></tr><tr><td>PIPETBOY acu 2</td><td>Integra Biosciences</td><td>155 016</td><td></td></tr><tr><td>Pipette sierologiche, 10 mL</td><td>Corning</td><td>4488</td><td></td></tr><tr><td>Pipette sierologiche, 25 mL</td><td>Corning</td><td>4489</td><td></td></tr><tr><td>Pipette sierologiche, 5 mL</td><td>Corning</td><td>4487</td><td></td></tr><tr><td>SuperKillerTRAIL (ligando modificato-induttore dell'apoptosi correlato al TNF)</td><td>Biomol</td><td>AG-40T-0002-C020</td><td>farmaco opzionale per il controllo positivo dell'apoptosi</td></tr><tr><td>Fiasche per colture cellulari T25</td><td>Greiner bio-one</td><td>690160</td><td>Materiale di coltura cellulare di routine per la linea cellulare di esempio utilizzata nel protocollo</td></tr><tr><td>Tripsina/EDTA</td><td>PAN Biotech</td><td>P10-025500</td><td>Materiale di coltura cellulare di routine per la linea cellulare di esempio utilizzata nel protocollo</td></tr><tr><td>Cellule di glioblastoma U87 MG</td><td>ATCC</td><td>ATCC-HTB-14</td><td>Linea cellulare di esempio utilizzata nel protocollo</td></tr></tbody></table>

misurazione specifica del ciclo cellulare di zh2ax e apoptosis dopo lo stress genotossico da citometria di flusso

Cell Cycle-specific Measurement of &#947;H2AX and Apoptosis After Genotoxic Stress by Flow Cytometry

Il metodo presentato o versioni leggermente modificate sono state ideate per studiare risposte specifiche al trattamento e gli effetti collaterali di vari trattamenti anti-cancro utilizzati nell'oncologia clinica. Consente un'analisi quantitativa e longitudinale della risposta al danno del DNA dopo lo stress genotossico, come indotto dalla radioterapia e da una moltitudine di farmaci anti-cancro. Il metodo copre tutte le fasi della risposta al danno del DNA, fornendo endpoint per l'induzione e la riparazione di rotture a doppio filamento del DNA (DSB), l'arresto del ciclo cellulare e la morte cellulare per apoptosi in caso di guasto di riparazione. La combinazione di queste misurazioni fornisce informazioni sugli effetti di trattamento dipendenti dal ciclo cellulare e consente quindi uno studio approfondito dell'interazione tra la proliferazione cellulare e i meccanismi di coping contro il danno al DNA. Poiché l'effetto di molte terapie contro il cancro, tra cui agenti chemioterapici e radiazioni ionizzanti, è limitato o varia fortemente in base a specifiche fasi del ciclo cellulare, le analisi correlate si basano su un metodo robusto e fattibile per valutare gli effetti del trattamento sul DNA in modo specifico per il ciclo cellulare. Questo non è possibile con i saggi a endpoint singolo e un importante vantaggio del metodo presentato. Il metodo non è limitato a nessuna linea cellulare particolare ed è stato accuratamente testato in una moltitudine di linee tumorali e normali delle cellule tissutali. Può essere ampiamente applicato come un test completo di genotossicità in molti campi dell'oncologia oltre alla radio-oncologia, tra cui la valutazione del fattore di rischio ambientale, lo screening farmacologico e la valutazione dell'instabilità genetica nelle cellule tumorali.

Le cellule glioblastoma umane U87 o LN229 sono state irradiate con 4 Gy di radiazione fotonica o ionica di carbonio. I livelli e l'apoptosi specifici del ciclo cellulare sono stati misurati in diversi momenti fino a 48 h dopo l'irradiazione utilizzando il metodo citometrico del flusso , qui presentato (Figura 3). In entrambe le linee cellulari, gli ioni di carbonio indottero livelli di picco più alti di H2AX che diminuirono più lentamente e rimasero significativamente elevati a 24 a 48 h ris...

Il metodo presentato combina l'analisi quantitativa delle interruzioni del DNA a doppio filamento (DSB), la distribuzione del ciclo cellulare e l'apoptosi per consentire la valutazione specifica del ciclo cellulare dell'induzione e della riparazione di DSB, nonché le conseguenze del fallimento della riparazione.

Misurazione specifica del ciclo cellulare di zH2AX e Apoptosis Dopo lo stress genotossico da citometria di flusso

The presented method or slightly modified versions have been devised to study specific treatment responses and side effects of various anti-cancer ...

Il metodo fornisce informazioni sugli effetti del trattamento dipendente dal ciclo cellulare e consente e lo studio approfondito dell'interazione tra proliferazione cellulare e meccanismi di coping contro i danni al DNA. Questo metodo combina endpoint importanti dalla risposta ai danni del DNA tra cui il riconoscimento e la riparazione della frattura a doppio filamento, gli effetti del ciclo cellulare e l'eventuale morte cellulare per apoptosi in un unico test completo. Abbiamo utilizzato questa tecnica principalmente per indagare risposte terapeutiche specifiche ed effetti collaterali dei trattamenti radiochemoterapici in oncologia clinica.Il saggio è molto utile per studi correlativi nei campi della radiobiologia e della radioterapia, ma può anche essere applicato a varie altre aree dell'oncologia. Dopo aver raccolto le cellule dalla coltura secondo le procedure standard di raccolta cellulare, rimorsi il pellet in un millilitro di PBS. E trasferire le cellule in due millilitri di soluzione di fissaggio in un cappuccio.Dopo un'incubazione di 10 minuti a temperatura ambiente, raccogliere le cellule per centrifugazione e decantare il supernatante. È importante fissare le celle come una singola sospensione cellulare e mantenere costante il tempo di fissazione per tutti i campioni. Dare alle cellule aderenti abbastanza tempo per staccarsi per ottenere cellule ben arrotondate per l'analisi.Quindi allentare il pellet toccando e rimosi le cellule in tre millilitri di 70%etanolo. Per lavare le cellule prima della colorazione, sedimentare le cellule mediante centrifugazione e allentare il pellet toccando. Quindi rimescolare le celle con due lavaggi consecutivi con tre millilitri di soluzione di lavaggio e un lavaggio con un millilitro di soluzione di lavaggio.Scartare il supernatante tra ogni lavaggio. Dopo l'ultimo lavaggio, aspirare con cura il supernatante senza disturbare il pellet e rimescolare il pellet lucente in 100 microlitri del cocktail anticorpale di interesse. Dopo un'ora a temperatura ambiente, raccogliere le cellule per centrifugazione e aspirare con cura il supernatante senza disturbare il pellet.Quindi, rimescolare il pellet allentato in 100-250 microlitri di soluzione di colorazione del DNA e distribuire le cellule attraverso il tappo del filtro cellulare di un tubo campione con una dimensione dei pori a rete da 35 micrometri. Per analizzare le celle in base alla citometria del flusso, aprite la scheda parametri nella finestra del citometro e selezionate i parametri come indicato nella tabella. Aprire quindi la finestra del foglio di lavoro e creare grafici come indicato.Caricare un campione di controllo nel citometro e premere il pulsante esegui. Selezionate il primo tubo nella finestra del browser e fate clic sul nome del tubo. Regolare le tensioni del rivelatore per la dispersione avanti e laterale e DAPI nella scheda parametri della finestra di ispezione.Premere il pulsante standby per continuare con la configurazione del foglio di lavoro nel software. Utilizzare lo strumento porta poligono per definire la popolazione delle celle nell'area di dispersione in avanti rispetto al tracciato dell'area di dispersione laterale e utilizzare lo strumento cancello rettangolo per definire la popolazione delle singole celle nel tracciato di area DAPI con rispetto a DAPI. Premere il controllo G per visualizzare la gerarchia di popolazione e fare clic sui nomi predefiniti dei gate per rinominarli.Successivamente, fare clic con il pulsante destro del mouse su tutti gli istogrammi per selezionare mostra popolazioni e singole celle dal menu di scelta rapida. Acquisire campioni di controllo e trattati per ottimizzare le tensioni del rivelatore per i fluorofori accoppiati agli anticorpi per coprire l'intera gamma dinamica del segnale. Per misurare i campioni, premere il pulsante esegui sul citometro e utilizzare il dashboard di acquisizione nel software per misurare i campioni.Selezionare quindi file, esportare ed esperimenti per selezionare l'esportazione della directory nella finestra di dialogo per salvare i dati come file FCS punto. Per valutare i dati, trascinare e rilasciare i file FCS punto nel browser di esempio del software di analisi citometrica del flusso. E usate lo strumento poligono per definire la popolazione delle cellule nel grafico dell'area di dispersione avanti rispetto a quella laterale e per escludere i detriti dall'analisi.Nel grafico ad area DAPI con rispetto a DAPI, utilizzare lo strumento rettangolo per definire la popolazione delle singole celle ed escludere dall'analisi eventuali doppietti o grumi di celle. Nell'istogramma dell'area DAPI, utilizzare lo strumento bisettore per distinguere singole cellule con un normale contenuto di DNA da cellule apoptotiche con DNA degradato. Selezionate la biologia degli utensili e il ciclo cellulare per aprire lo strumento di modellazione del ciclo cellulare e selezionate Dean-Jett Fox per stimare la frequenza delle cellule nelle fasi G uno S e G due M.Creare porte di fase G uno S e G due e M nel grafico di fase DAPI con rispetto a DAPI della popolazione del ciclo cellulare per consentire una misurazione gamma H due A X specifica del ciclo cellulare. Utilizzare lo strumento bisettore per distinguere la fosfohistone H tre cellule positive e negative nell'istogramma dell'area Di Alexa 555 della popolazione del ciclo cellulare e per distinguere la base CAS di tre cellule positive e negative nell'istogramma dell'area Di Alexa 647 della popolazione delle singole cellule. Premere il controllo T per aprire l'editor di tabelle e configurare la tabella come indicato.Quindi selezionare A file per impostare il formato e la destinazione nella sezione di output della barra multifunzione del menu ed esportare i dati in un foglio di diffusione. Gli ioni di carbonio inducono livelli di picco gamma H due AX più elevati nelle cellule di glioblastoma che diminuiscono più lentamente e rimangono significativamente elevati in 24-48 ore rispetto alla radiazione fotonica alla stessa dose fisica. Sia per gli ioni di carbonio che per la radiazione fotone, i due livelli di gamma H due AX erano più alti nelle cellule di una fase G probabilmente perché la riparazione della rottura del doppio filamento del DNA è limitata alla via dell'unione finale non disomologa in questa fase del ciclo cellulare.In linea con il più alto tasso di induzione di rottura a doppio filamento e la cinetica di riparazione più lenta, gli ioni di carbonio inducono un arresto del ciclo cellulare più forte e più duraturo in fase G due e un tasso di apoptosi più elevato rispetto ai fotoni. A seconda della forza dell'effetto di trattamento, la risoluzione delle diverse fasi del ciclo cellulare può essere impegnativa. In alcune linee cellulari, la concentrazione di DAPI ha un grande impatto sulla qualità del profilo del ciclo cellulare e deve essere regolata.Le diapositive possono essere preparate dai campioni rimanenti dopo la citometria del flusso per valutare il numero, le dimensioni e la forma della gamma H due focolai AX e per distinguere tra gamma focale e parnucleare H due colorazioni AX. Usando il nostro metodo, potremmo dimostrare che le cellule staminali mesenchimali sono relativamente resistenti alle radiazioni ionizzanti e all'inibizione della topoisomerasi ma sensibili alla gliomicina. Poiché i fumi PFA sono tossici, utilizzare sempre una cappa aspirante durante la preparazione della soluzione di fissazione e durante la fase di fissazione.Ricorda anche di indossare guanti durante la manipolazione di DAPI.

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La quantificazione di DNA a doppio filamento striature formazione γH2AX utilizzando come marcatore molecolare è diventata uno strumento prezioso nel campo della biologia delle radiazioni. Qui mostriamo l'utilizzo di un test di immunofluorescenza per la quantificazione della γH2AX focolai dopo l'esposizione delle cellule alle radiazioni.

Quantificazione dei γH2AX Foci in risposta alle radiazioni ionizzanti

La quantificazione di DNA a doppio filamento sulla base di γH2AX focolai è diventato uno strumento prezioso, in particolare in biologia radiazione, per la valutazione della radiosensibilità dei tessuti e gli effetti dei composti radiazione modificando. Qui mostriamo l'utilizzo di un test di immunofluorescenza per la quantificazione del γH2AX focolai in campioni di tessuto.

ΓH2AX quantificazione dei Foci, a campioni di tessuto

In questo video, descriviamo la tecnica di microscopia a immunofluorescenza per rilevare specifiche proteine di risposta al danno del DNA localizzate nei siti di rottura del doppio filamento di DNA nelle cellule mononucleate umane. Le proteine sono riconosciute da specifici anticorpi primari, che a loro volta si legano agli anticorpi secondari marcati con fluorofori che emettono fluorescenza durante la visualizzazione microscopica, consentendo la visualizzazione delle proteine come focolai...

Microscopia a immunofluorescenza per l'analisi delle rotture del DNA a doppio filamento

Questo protocollo descrive l'uso di bromodeossiuridina (BrdU) uptake per consentire il monitoraggio temporale di cellule che erano in fase S in un determinato momento. L'aggiunta di coloranti DNA e l'etichettatura degli anticorpi facilita l'analisi dettagliata del destino delle cellule in fase S in tempi successivi.

Monitoraggio temporale del ciclo cellulare progressione citometria a flusso, senza la necessità di sincronizzazione

Viene presentato un protocollo per valutare i cambiamenti nei livelli di danno al DNA e nella capacità di riparazione del DNA che possono essere indotti dall'irradiazione cronica in vivo a basse dosi nei linfociti della milza di topo, misurando l'istone fosforilato H2AX, un marcatore di rotture del doppio filamento del DNA, utilizzando la citometria a flusso.

Misurazione danno al DNA e ripristina in mouse Splenociti Dopo cronica<em&gt; In Vivo</em&gt; L&#39;esposizione a dosi molto basse di beta e gamma Radiazioni

Questo manoscritto fornisce un protocollo per l'analisi delle rotture del doppio filamento di DNA da microscopia di immunofluorescenza di γH2AX e 53BP1.

Microscopia di immunofluorescenza di γH2AX e 53BP1 per analizzare la formazione e la riparazione di rotture a doppio filamento del DNA

In seguito al danno al DNA, le cellule umane attivano percorsi di riparazione essenziali per ripristinare l'integrità del loro genoma. Qui, descriviamo il metodo dell'immunofluorescenza indiretta come mezzo per rilevare le proteine di riparazione del DNA, analizzare il loro reclutamento spaziale e temporale e contribuire a interrogare l'interazione proteina-proteina nei siti di danno al DNA.

Visualizzazione dell'interazione delle proteine di riparazione del DNA per immunofluorescenza

Questo protocollo presenta la preparazione del vetrino e il punteggio automatico del test dei fuochi γ-H2AX sui linfociti del sangue periferico. Per illustrare il metodo e la sensibilità del test, i linfociti isolati sono stati irradiati in vitro. Questo metodo automatizzato di rilevamento del DNA DSB è utile per applicazioni di dosimetria biologica rapida e ad alto rendimento.

Un metodo di punteggio microscopico automatizzato per il test foci γ-H2AX nei linfociti del sangue periferico umano

Qui presentiamo un metodo basato sulla citometria a flusso per la visualizzazione e la quantificazione di più marcatori associati alla senescenza in singole cellule.

Imaging simultaneo e rilevamento basato sulla citometria a flusso di marcatori di senescenza fluorescenti multipli in cellule tumorali senescenti indotte dalla terapia

Questo protocollo presenta un metodo per valutare la formazione e la riparazione delle rotture a doppio filamento del DNA attraverso la rilevazione simultanea di focolai di γH2AX e 53BP1 nei nuclei interfase dei linfociti periferici umani trattati con bleomicina.

Doppia immunofluorescenza di γH2AX e 53BP1 nei linfociti periferici umani

Qui, presentiamo un protocollo semplice e rapido per il rilevamento dell'interazione proteica nei siti di danno al DNA.

Saggio del ligando di prossimità per localizzare le proteine nei siti di danno al DNA

Impara a misurare γH2AX e apoptosi specifiche del ciclo cellulare mediante citometria di flusso dopo stress genotossico. Questo metodo combina l'analisi delle rotture del DNA, la distribuzione del ciclo cellulare e l'apoptosi per valutare la riparazione del danno.

Misurazione specifica del ciclo cellulare di zH2AX e Apoptosis Dopo lo stress genotossico da citometria di flusso

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