Trasformazione, editing del genoma e fenotipizzazione dell'azoto-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii

Parasponia è un albero tropicale della famiglia cannabis che è in grado di stabilire una simbiosi azotofissante con il rizobio. Studi comparativi tra Parasponia e legumi potrebbero fornire informazioni sulle reti genetiche principali alla base della simbiosi del rizobio. Con questo protocollo, le linee mutanti transgeniche stabili parasponia andersonii possono essere generate in un periodo di due o tre mesi.

Queste linee possono essere propagate in modo efficiente attraverso la propagazione in vitro. Questo protocollo fornisce una piattaforma sperimentale per studiare la simbiosi rizobiale così come altri aspetti della biologia di questo albero tropicale. Le competenze di base nella coltura tissutale e nella clonazione molecolare sono sufficienti per implementare questo protocollo.

Ciò consente a qualsiasi laboratorio di adattare Parasponia come modello di ricerca. A dimostrare la procedura saranno i dottorandi Titis Wardhani e Yuda Roswanjaya insieme a Marijke Hartog, un tecnico del nostro laboratorio. Per coltivare gli alberi di Parasponia andersonii, inizia germogliando i semi.

Rimuovere i semi dalle bacche di Parasponia strofinandoli contro l'interno di un setaccio del tè o schiacciandoli su un pezzo di carta velina. Disinfettare i semi usando il 4% di candeggina di ipoclorito per 15-20 minuti, quindi lavare i semi sei volte con acqua sterilizzata. Trasferire i semi in tubi PCR sterili da 200 microliter e riempire i tubi con acqua sterilizzata per immergere i semi.

Incubare i tubi per 10 giorni in un termociclo secondo le indicazioni manoscritte. Dopo l'incubazione di 10 giorni, trasferire i semi su piastre SH-0 e chiuderli con due strati di foglio di tenuta elastico per evitare l'essiccazione. Incubare a 28 gradi Celsius con un ciclo di 16 ore al giorno, otto ore-notte per tre o quattro settimane.

Una volta che le piantine sviluppano il loro primo set di foglie vere, trasferiscile in vasi pieni di terreno di invaso commerciale e coprili con una tazza di plastica traslucida per prevenire l'essiccazione. Metti le pentole in una stanza climatica o in una serra di 28 gradi Celsius, 85% di umidità relativa o serra sotto un regime di 16 ore al giorno, otto ore di notte. Dopo una settimana, rimuovere la tazza di plastica.

Innaffiare regolarmente i vasi e integrare con fertilizzante per sostenere la crescita degli alberi. Preparati alla trasformazione raccogliendo giovani rami da cinque a otto centimetri dagli alberi coltivati in serra, assicurandoti di utilizzare solo rami sani e non infetti. Tagliare le foglie, lasciando un centimetro al quadrato di tessuto fogliare alla fine di ogni picciolo.

Disinfettare il tessuto per 15 minuti con candeggina di ipoclorito al 2% contenente alcune gocce di polisorbato 20, quindi sciacquarlo otto volte con acqua autoclavata. Sospendere di nuovo le cellule di Agrobacterium in 25 millilitri di mezzo di infiltrazione fino a una densità ottica di circa cinque. Tagliare il gambo e il tessuto del picciolo in pezzi di un centimetro all'interno della sospensione cellulare.

Rimuovere i tessuti fogliari e incubare il gambo e i pezzi di picciolo nella sospensione cellulare per 10-30 minuti. Asciugare i pezzi di tessuto su un pezzo sterile di carta da filtro e metterli su un supporto di radicamento preparato secondo le indicazioni manoscritte. Incubare le piastre al buio a 21 gradi Celsius per due giorni.

Dopo i due giorni, ispezionare le piastre per la contaminazione fungina o batterica e scartare le piastre contaminate. Trasferire i pezzi di tessuto a 10 millilitri di mezzo SH-10 preparato secondo le indicazioni manoscritte. Lasciare il tessuto nel mezzo per almeno 10 minuti e agitare delicatamente ogni due o tre minuti per lavarlo.

Preparare il supporto di radicamento con cefotaxime e kanamicina secondo le indicazioni del manoscritto e versare le tavole. Asciugare i tessuti su pezzi sterili di carta da filtro e trasferirli sulle piastre. Incubare le piastre per sette giorni a 28 gradi Celsius sotto un regime di 16 ore al giorno, otto ore-notte.

Controllare le piastre per la contaminazione fungina o batterica ogni due giorni. In caso di contaminazione, trasferire i pezzi di tessuto non infetti su una piastra fresca. Dopo sette giorni, trasferire i pezzi di tessuto su un mezzo di propagazione preparato secondo le indicazioni manoscritte e incubare a 28 gradi Celsius sotto un regime di 16 ore al giorno, otto ore-notte.

Aggiornare le piastre una volta alla settimana fino a quando non si sviluppano germogli transgenici, assicurandosi di trasferire solo pezzi di tessuto non infetti su nuove piastre. Una volta che i germogli transgenici putativi sono lunghi almeno un centimetro, tagliare i germogli e colturarli in modo indipendente nel mezzo di propagazione con antibiotici. Per assicurarsi che i germogli rappresentino trasformatori indipendenti, prendi un solo germoglio da ciascun lato di un'espianto.

Propagare il tessuto posizionando circa 10 germogli su una piastra fresca di mezzo di propagazione e chiudendo la piastra con due strati di foglio di tenuta elastico. Incubare le piastre a 28 gradi Celsius sotto un regime di 16 ore al giorno, otto ore di notte, e ripetere questo passaggio ogni quattro settimane. Quando i germogli raggiungono un centimetro di lunghezza, tagliarli alla loro base e posizionarli sul mezzo di radicamento.

Posizionare i germogli in posizione verticale inserendo la punta basale del germoglio nel mezzo. Circa 10 germogli possono essere posizionati su una singola piastra. Inizia preparando il rhizobium inoculum.

Inoculare 10 millilitri di mezzo YEM liquido da una singola colonia di Mesorhizobium plurifarium BOR2 e incubare a 28 gradi Celsius per due giorni. Utilizzare questa coltura per inoculare un volume maggiore di mezzo YEM liquido. Una volta coltivato, centrifugare la coltura batterica per 10 minuti a 3.500 volte g per raccogliere le cellule.

Sospendere di nuovo il pellet batterico nel mezzo liquido EKM e determinare la densità ottica. Preparare tre litri di mezzo EKM, che è sufficiente per circa 20 vasi, e inocularlo con la sospensione rizobiale. Mescolare il mezzo con 1,25 chilogrammi di perlite e aggiungere 210 grammi di questa miscela a pentole sterili in polipropilene traslucido.

Piantare da una a tre plantlet Parasponia andersonii ad ogni vaso e preparare diversi vasi con plantlet trasformate con il costrutto di controllo. Pesare molti dei vasi e coprire il fondo di ogni pentola per proteggere le radici dall'esposizione alla luce. Incubare i vasi in una sala di crescita climatizzata a 28 gradi Celsius sotto un regime di 16 ore al giorno, otto ore-notte per quattro o sei settimane.

Una volta alla settimana, pesare diverse pentole per determinare la perdita d'acqua. Se la perdita d'acqua supera i 10 millilitri, integrare con acqua ultra pura per compensare la perdita. Dopo l'incubazione, pulire le radici dalla perlite e determinare i numeri dei noduli usando un binocolo.

Questa tecnica è stata utilizzata per trasformare con successo piioli e segmenti di steli Parasponia andersonii con ceppo agrobatterio AGL1. In primo luogo, le espianto tissutali vengono co-coltivate con Agrobacterium per due giorni. La co-coltivazione prolungata si traduce in una sovraco colonizzazione batterica e dovrebbe essere prevenuta.

Poche settimane dopo, piccoli micro-calli verdi si osservano lungo la superficie della ferita originale. Questi calli continuano a crescere e sviluppare uno o più germogli trasformati putativamente a sei-otto settimane dall'inizio della trasformazione. Le efficienze di trasformazione variano dal 10 al 30% per gli espianto tissutale dai rami maturi al 65-75% per le espianto tissutale da rami giovani e in rapida crescita.

I germogli transgenici possono essere moltiplicati attraverso la propagazione in vitro, che dà origine a decine di germogli entro un mese. Questi germogli possono essere posizionati su un mezzo di radicamento che indurrà la formazione di radici in circa due settimane e produrrà piante che possono essere utilizzate per la sperimentazione. Quando si avvia un esperimento di trasformazione stabile, è importante selezionare rami sani come materiale di origine.

Le linee transgeniche Parasponia T0 vengono propagate in vitro. Pertanto, è essenziale genotipare accuratamente le linee transgeniche Parasponia. L'istituzione della Parasponia come modello sperimentale consente l'analisi comparativa tra due lignaggi nodulanti lontanamente correlati, Parasponia e legumi.

Ciò potrebbe identificare le reti genetiche di conservazione alla base della simbiosi del rizobio. La parasponia può anche essere un modello prezioso per studiare altri argomenti di ricerca come la formazione del legno, lo sviluppo di fiori bisessuali o la biosintesi dei metaboliti secondari specifici delle Cannabaceae.