Name: Un approccio di alimentazione anticorpale per studiare il traffico di recettori del glutammato nelle culture ippocampali primarie dissociate (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 13 s
Description: Scopri un metodo di alimentazione anticorpale per studiare il traffico dei recettori del glutammato nelle culture ippocampali primarie dissociate. Questa tecnica permette di analizzare l'internalizzazione e il riciclo dei recettori.

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Ringraziamo il Northwestern Center for Advanced Scopy per l'uso del microscopio Nikon A1 Confocal e la loro assistenza nella pianificazione e nell'analisi degli esperimenti. Questa ricerca è stata supportata da NIGMS (T32GM008061) (A. M. C.), e NIA (R00AG041225) e da un NARSAD Young Investigator Grant della Brain & Behavior Research Foundation (#24133) (A. S. -C.).

Il lavoro per la preparazione della cultura primaria dell'ippocampo è stato esaminato e approvato dal Northwestern University Animal Care and Use Committee (protocollo #IS00001151).
1. Preparazione prima dell'etichettatura
<ol><li>
Preparazione e manutenzione delle colture primarie dell'ippocampo
	<ol>
<li>Preparare colture primarie di ippocampali ad una densità di 150.000 cellule placcate su bicchieri di copertura rivestiti in poli-D-lysina (0,1 mg/mL). Eccellenti guide per la preparazione della cultura neuronale dissociata sono disponibili7,8. NOT:</</c5> Se necessario, le colture possono essere trattate con citosina arabinoside (Ara-C, 10 mM da DIV1) per evitare la proliferazione gliale nella preparazione. NOT:</</c6> Reagenti di rivestimento alternativo come fibronectina (1 mg/mL) o laminina (5 mg/mL) possono essere utilizzati al posto di poli-D-lysina.</li>
		<li>Mantenere le colture in un'incubatrice cellulare a 37 e 5% CO2 in 2 mL/po' di supporti neurobasali integrati con B27 e 2 mM L-glutamine. NOT:</</c8> I sostituti per L-glutamine (ad esempio, Glutamax) possono essere utilizzati, se lo si desidera.</li>
		<li>Su base settimanale, rimuovere la metà del volume dei media e sostituire con lo stesso volume di supporti neurobasali integrati.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
OPTIONAL: Trasfezione di recettori mutati e/o marcati epitope NOTA: I neuroni devono essere trafettati almeno 3-4 giorni prima del punto di tempo di analisi per consentire l'espressione del recettore. L'uso di giovani neuroni [Days in vitro 6–9 (DIV6–9)] si traduce in una migliore efficienza di trasfezione rispetto ai neuroni più vecchi (DIV15–20), ma un numero sufficiente di cellule trasfettate (>20) può essere raggiunto indipendentemente dal DIV impiegato.<ol>
<li>Per ogni pozzo di una piastra da 12 pozze, diluire 1,5 g di plasmide contenente il costrutto di interesse in 100 - L di supporti neurobasali freschi senza B27 o il completamento della glutammina in un tubo di microcentrifuga e mescolare vortice rapidamente. NOT:</</c11> Per una trasfezione di successo, è fondamentale che i supporti neurobasali utilizzati sia il più fresco possibile, idealmente meno di 1 settimana dopo l'apertura della bottiglia.</li>
		<li>In un secondo tubo di microcentrifuga, mescolare 1 l di reagente lipofection appropriato in 100 : L di supporti neurobasali freschi e mescolare delicatamente. NOT:</</c12> Non vortice la miscela reagente lipofection. L'uso di reagenti di lipofezione fresco può migliorare l'efficienza della trasfezione.</li>
		<li>Incubare i tubi per 5 min a temperatura ambiente (RT).</li>
		<li>Aggiungere la miscela di reagente lipofection dropwise alla miscela di DNA, mescolare delicatamente e incubare per 20 min a RT.</li>
		<li>Regolare il volume dei supporti in ogni pozzo a 1 mL di supporti condizionati.</li>
		<li>Aggiungere il reagente di lipofection -DNA miscela dropwise al pozzo.</li>
		<li>Riportare le cellule all'incubatrice e attendere almeno 3-4 giorni per l'espressione proteica. NOT:</</c13> Ai fini dei protocolli di internalizzazione e riciclaggio descritti di seguito, i neuroni ippocampali sono stati transinfettati al DIV11–12 con costrutti che esprimono GluN2B taggati con GFP nel dominio extracellulare (GFP-GluN2B) e immagini a DIV15–16.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
OPTIONAL: Incubazione di cellule con farmaci (cronicamente o acutamente) nel supporto condizionato fino alla fissazione. NOTA: Per il trattamento acuto, iniziare a trattare le cellule prima dell'etichettatura. A seconda del protocollo di trattamento farmacologico utilizzato, le cellule possono essere mantenute in supporti contenenti droga durante la sezione 2. Nel nostro esempio, le cellule DIV21 sono state soggette a un protocollo cLTP per aumentare AMPAR9espresso dalla superficie.<ol>
<li>Scambio di supporti condizionati per soluzione extracellulare (ECS).</li>
		<li>Trattare le cellule con 300 m di glicina in ECS per 3 min presso RT. Come controllo, trattare un coverslip sorella con ECS (senza glicina).</li>
		<li>Lavare le cellule 3x con 37 c ECS e riportare le cellule in ECS (senza glicina) all'incubatrice cellulare per 20 minuti prima di continuare con la sezione 2. NOTA: ECS (in mM): 150 NaCl, 2 CaCl2, 5 KCl, 10 HEPES, 30 Glucose, 0.001 TTX, 0.01 strychnine e 0.03 picrotosina a pH 7.4.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Etichettatura live dei recettori espressi dalla superficie
<ol><li>
Preparare i coverlips per l'etichettatura
	<ol>
<li>Per salvare i reagenti e facilitare la manipolazione, trasferire il lato della cella coverlips fino a un vassoio coperto di pellicola di paraffina. NOT:</</c2> È fondamentale non lasciare mai asciugare i campioni.</li>
		<li>Conservare e mantenere i supporti condizionati a 37 gradi centigradi per le fasi di incubazione e lavaggio. NOT:</</c3> Per un coverslip da 18 mm, si raccomanda l'incubazione con 75-100 - L di supporti per l'etichettatura degli anticorpi e 120-150 -L per l'internalizzazione/riciclaggio.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Etichettatura dei recettori superficiali con anticorpi primari
	<ol>
<li>Incubare cellule con anticorpo primario diluito in supporti condizionati per 15 min a RT. NOT:</</c6> Per i recettori marcati GFP, è stato utilizzato l'anticorpo anti-GFP del coniglio con una diluizione di 1:1000. Per GluA1 endogeno, è stato utilizzato il topo anti-GluA1 ad una diluizione 1:200.</li>
		<li>Aspirare con attenzione i supporti contenenti anticorpi utilizzando una pipetta a vuoto e lavare le cellule tre volte con supporti condizionati. NOT:</</c7> Se il supporto condizionato non è disponibile, tutte le fasi di lavaggio possono essere eseguite utilizzando PBS [phosphate buffered saline (PBS) contenente 1 mM MgCl2 e 0,1 mM CaCl2]. L'aspirazione manuale utilizzando una micropipetta può essere eseguita se non è disponibile una leggera aspirazione sottovuoto.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Espressione superficie (Figura 2)
<ol><li>
Etichettatura anticorpale secondaria dei recettori espressi in superficie
	<ol>
<li>Lavare una volta con PBS.</li>
		<li>Fissare le cellule incubando con 4% paraformaldeide (PFA) e 4% di saccarosio in PBS per 7-8 min. NOT:</</c2> A differenza di altri metodi di fissazione come l'incubazione del metanolo, la PFA non permeabilizza la membrana plasmatica ed è quindi adatta per l'analisi dell'espressione superficiale. Per ottenere risultati ottimali, utilizzare PFA appena preparato. Lo stoccaggio a breve termine di PFA a 4 gradi centigradi o a lungo termine (fino a 30 giorni) di stoccaggio a -20 gradi centigradi è permissivo per un'adeguata fissazione. ATTENZIONE: La PFA è un noto cancerogeno. Utilizzare dispositivi di protezione personale adeguati e un cappuccio di sicurezza durante la manipolazione.</li>
		<li>Lavare le cellule tre volte con PBS regolare. NOT:</</c4> In alternativa, la glicina da 0,1 M può essere utilizzata per il lavaggio di PFA invece di PBS, in quanto la glicina placherà qualsiasi fixative rimanente che possa aumentare lo sfondo nella preparazione.</li>
		<li>Bloccare i siti di legame non specifici incubando con il 10% di siero di capra normale (NGS) in PBS per 30 min a RT. NOT:</</c5> Il tempo di blocco può essere esteso senza effetti negativi sull'etichettatura.</li>
		<li>Incubazione con anticorpo secondario con etichettafluenza fluorescente diluita nel 3% NGS in PBS per 1 h a RT per etichettare i recettori primari con etichettatura anticorpo (cioè espressi dalla superficie). NOT:</</c6> In questi esempi, è stata utilizzata una diluizione di 1:500 di anticorpi secondari coniugati ad Alexa 555: capra anti-coniglio per i recettori etichettati GFP e l'antitopo di capra per GluA1.</li>
		<li>Lavare le cellule con PBS 3x.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Etichettatura dei recettori intracellulari
	<ol>
<li>Permeabilize cellule con 0.25% Triton X-100 in PBS per 5-10 min a RT. NOT:</</c9> Per verificare che il round iniziale dell'etichettatura degli anticorpi occupi tutti gli epitopi superficiali, questa fase di permeabilizzazione può essere saltata in una cultura sorella. In questo caso, non dovrebbe essere ottenuto alcun segnale per i recettori intracellulari. Inoltre, per verificare che nessun recettore interno sia stato etichettato nella sezione precedente 2 (cioè, mostrando l'integrità delle membrane plasmatiche nella coltura), la fase di permeabilizzazione può essere saltata in una coltura sorella e un anticorpo primario contro un la proteina intracellulare (ad esempio, PSD-95 o MAP2) può essere utilizzata nel passaggio 2.2.1. Nessun segnale deve essere ottenuto da questo primario in queste condizioni. In questo caso, è stato utilizzato un anticorpo anti-PSD-95 del coniglio (1:500).</li>
		<li>Blocco con 10% NGS in PBS per 30 min a RT.</li>
		<li>Etichettare i recettori intracellulari incubando cellule permeabilizzate con lo stesso anticorpo primario utilizzato nella sezione 2.2 diluito nel 3% NGS in PBS per 1 h a RT. NOT:</</c10> La diluizione degli anticorpi per l'etichettatura dei recettori intracellulari può essere diversa da quella richiesta per l'etichettatura dei recettori espressi dalla superficie. Nell'esempio di GluA1, è stata utilizzata la stessa diluizione dell'anticorpo (1:200).</li>
		<li>Lavare le cellule 3x con PBS.</li>
		<li>Etichetta con secondo anticorpo secondario fluorescente diluito nel 3% NGS in PBS per 1 h a RT. NOT:</</c11> In questi esempi, è stata utilizzata una diluizione 1:500 di capra anti-topo Alexa 647 coniugato anticorpo secondario (per GluA1).</li>
		<li>Lavare le cellule 3x con PBS.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Internalizzazione (Figura 3)
<ol><li>
Internalizzazione dei recettori superficiali con etichettatura anticorpale
	<ol>
<li>Dopo l'etichettatura dei recettori espressi in superficie e del lavaggio degli anticorpi (sezione 2.2), mantenere le cellule in supporti condizionati senza anticorpi e restituirle all'incubatrice (37 gradi centigradi) per consentire l'internalizzazione. NOT:</</c2> Per i recettori NMDA, si raccomanda 30 min per l'internalizzazione. Come controllo, una cultura sorella può essere mantenuta con mezzi di comunicazione condizionati a 4 gradi centigradi durante il processo di internalizzazione. L'internalizzazione minima del recettore dovrebbe avvenire in queste condizioni.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Etichettatura dei recettori di superficie
	<ol>
<li>Lavare le cellule una sola volta con PBS.</li>
		<li>Fissare le celle con 4% PFA e 4% di saccarosio in PBS per 7-8 min. ATTENZIONE: Utilizzare dispositivi di protezione personale adeguati e un cofano di sicurezza durante la movimentazione PFA.</li>
		<li>Lavare le cellule 3x con PBS regolare.</li>
		<li>Blocco con 10% NGS in PBS per 30 min a RT per evitare attacchi non specifici.</li>
		<li>Incubare campioni con anticorpi secondari marcati fluorescentmente diluiti in 3% NGS in PBS per 1 h a RT per etichettare i recettori primari con etichette anticorpo (cioè i recettori espressi dalla superficie che non sono stati internalizzati). NOT:</</c6> Per questo esempio, per l'etichettatura è stato utilizzato l'anticorpo secondario anti-coniglio alexa 555 con una capra coniugata (1:500).</li>
		<li>Lavare le cellule 3x con PBS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Etichettatura dei recettori internalizzati
	<ol>
<li>Permeabilize cellule con 0.25% Triton X-100 in PBS per 5-10 min.</li>
		<li>Bloccare l'associazione non specifica per incubazione con 10% NGS in PBS per 30 min a RT.</li>
		<li>Incubare campioni con anticorpi secondari marcati fluorescentmente diluiti in 3% NGS in PBS per 1 h a RT per etichettare i recettori con etichettatura anticorpo internalizzati. NOT:</</c9> Per questo esempio, per l'etichettatura viene utilizzato l'anticorpo secondario anti-coniglio con capra autenticata Alexa 647 (1:500).</li>
		<li>Lavare le cellule 3x con PBS.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Riciclaggio (Figura 4)
<ol><li>
Internalizzazione dei recettori superficiali con etichettatura anticorpale
	<ol>
<li>Dopo l'etichettatura dei recettori espressi in superficie e del lavaggio degli anticorpi (sezione 2.2), mantenere le cellule in supporti condizionati senza anticorpi e restituirle all'incubatrice (37 gradi centigradi) per consentire l'internalizzazione. NOT:</</c2> Per i recettori NMDA, si raccomanda 30 min per l'internalizzazione.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Blocco dei recettori espressi di superficie stabile
	<ol>
<li>Per bloccare gli epitopi sull'anticorpo primario attaccato ai recettori espressi in superficie che non sono stati internalizzati, incubare le cellule con frammenti di anticorpi Fab anti-IgG (H-L) non coniugati (contro il primario utilizzato nella sezione 2.2) diluiti nei supporti condizionati ( 20 g/mL) per 20 min presso RT. Questo trattamento previene l'interazione futura con gli anticorpi secondari. NOT:</</c5> Per questo esempio sono stati utilizzati frammenti di Fab anti-coniglio Capra. NOT:</</c6> Esperimento di controllo: per garantire che si sia verificato il blocco completo dei recettori espressi in superficie, i coprigemelli sorella possono essere incubati con e senza Fab. Le colture devono essere fissate immediatamente dopo il trattamento Fab, ed entrambe le culture vengono incubate con anticorpo secondario coniugato ad Alexa 555. Nessun segnale Alexa 555 nelle cellule incubate Fab indica il corretto blocco degli anticorpi.</li>
		<li>Lavare le cellule 3x con supporti condizionati.</li>
		<li>Incubare cellule con supporti condizionati contenenti 80 diadore M per prevenire ulteriori internalizzazioni e restituire le cellule all'incubatrice (37 gradi centigradi) per consentire il riciclaggio dei recettori internalizzati. Dynasore è un inibitore GTPase che inibisce la dinamina e quindi impedisce l'internalizzazione. NOTA: si consiglia noto 45 min per il riciclo nmDAR. Si noti che Dynasore blocca in modo esclusivo il processo di internalizzazione dipendente dalla dinamina (ad esempio, l'internalizzazione di NMDAR). Tuttavia, l'internalizzazione di altre proteine sinaptiche (indipendenti dalla dinastia) può ancora verificarsi in presenza di Dynasore.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Etichettatura dei recettori riciclati
	<ol>
<li>Lavare le cellule una sola volta con PBS.</li>
		<li>Fissare le celle con 4% PFA e 4% di saccarosio in PBS per 7-8 min. ATTENZIONE: Utilizzare dispositivi di protezione personale adeguati e un cofano di sicurezza durante la movimentazione PFA.</li>
		<li>Lavare le cellule 3x con PBS.</li>
		<li>Blocco con 10% NGS in PBS per 30 min a RT per evitare attacchi non specifici.</li>
		<li>Etichettare le cellule con il primo anticorpo secondario con etichettafluere fluorescentmente diluite nel 3% NGS in PBS per 1 h a RT. NOT:</</c11> Per questo esempio, per l'etichettatura è stato utilizzato l'anticorpo anti-coniglio di capra racchiuso tra Alexa 555 (1:500) per l'etichettatura.</li>
		<li>Lavare le cellule 3x con PBS. NOT:</</c12> I fumi più lunghi con PBS (5-10 min) possono contribuire a ridurre lo sfondo nella preparazione.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Etichettatura dei recettori internalizzati
	<ol>
<li>Permeabilize cellule con 0.25% Triton X-100 in PBS per 5-10 min.</li>
		<li>Blocco con 10% NGS in PBS per 30 min a RT.</li>
		<li>Etichetta con secondo anticorpo secondario fluorescente diluito nel 3% NGS in PBS per 1 h a RT. NOT:</</c15> Per questo esempio, per l'etichettatura è stato utilizzato l'anticorpo anti-coniglio con capra Alexa 647 (1:500).</li>
		<li>Lavare le cellule 3x con PBS.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Montaggio e imaging di campioni
<ol><li>Montare le celle posizionando delicatamente il lato della cella coverlips verso il basso su 12-15 mL del supporto di montaggio appropriato. NOT:</</c0> L'aspirazione di supporti in eccesso migliorerà la qualità delle immagini.</li>
	<li>Cellule di immagine su un microscopio confocale appropriato. NOT:</</c1> Si consiglia di immaginare uno z-stack a un ingrandimento di 60x con passi di 0,35 m, che comprende l'intero spessore del neurone.</li>
</ol>7. Considerazioni sul tempo
<ol><li>Si tratta di un protocollo lungo che può essere interrotto in diversi punti. Se lo si desidera, eseguire le fasi di blocco e di incubazione dell'anticorpo primario durante la notte a 4 gradi centigradi in una camera umida.</li>
	<li>
In alternativa, se lo si desidera, utilizzare un processore di tessuto a microonde per accelerare notevolmente i tempi di incubazione post-fissazione. Per tutti i passaggi, utilizzare 150 W a 30 gradi centigradi per le impostazioni "On".
	<ol>
<li>Per bloccare, eseguire il processore a 2 min "On", 1 min "Off" e 2 min "On".</li>
		<li>Per i passaggi di incubazione anticorpi primari e secondari, eseguire il processore a 3 min "On", 2 min "Off" e 3 min "On". NOT:</</c2> Non osserviamo alcuna differenza di qualità apportando le modifiche di cui sopra al protocollo.</li>
	</ol>
</li>
</ol>8. Analisi dell'immagine
<ol><li>Si consiglia di utilizzare FIJI <https://fiji.sc/> per condurre l'analisi delle immagini, in quanto è compatibile con più formati di file. Per i nostri dati, sono state acquisite immagini nel formato di file Nikon ND2.</li>
	<li>Viene fornito uno script macro per facilitare la quantificazione batch di diversi parametri preselezionati da FIJI. Nella macro sono inclusi i seguenti passaggi: NOT:</</c0> Per questi esempi è stata misurata l'"intensità integrata".</li>
	<li>Aprire i file di immagine in FIJI e canali separati.</li>
	<li>Ogni stack di canali viene proiettato a z come proiezione di intensità massima.</li>
	<li>Impostare una soglia inferiore per ogni canale. NOT:</</c1> Le soglie devono essere determinate empiricamente per ogni set di dati sperimentali. Sebbene ogni canale possa avere un valore di soglia inferiore separato, è fondamentale che i valori di soglia del canale vengano mantenuti in modo coerente per tutte le immagini dello stesso set di dati.</li>
	<li>Selezionare da tre a cinque dendriti secondari o terziari e salvarli come aree di interesse (ROI).</li>
	<li>Misurare la densità integrata di ogni ROI nei canali di superficie e intracellulari.</li>
	<li>Normalizzare il segnale per ogni ROI dividendo il valore di densità integrato del canale di superficie per il canale intracellulare.</li>
	<li>Ripetere le misurazioni per tutte le immagini di controllo e sperimentali e normalizzare i valori sperimentali per controllare i valori (ad esempio, GluN2B WT o condizioni no-glycine).</li>
</ol>

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<li>Bailey, D. M., Kovtun, O., Rosenthal, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody-Conjugated+Single+Quantum+Dot+Tracking+of+Membrane+Neurotransmitter+Transporters+in+Primary+Neuronal+Cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Antibody-Conjugated Single Quantum Dot Tracking of Membrane Neurotransmitter Transporters in Primary Neuronal Cultures.</a> Methods in Molecular Biology. 1570, 165-177 (2017).</li>
<li>Trussell, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recording+and+analyzing+synaptic+currents+and+synaptic+potentials%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience.+Chapter+6%2C+Unit%22%5BJournal%5D)">Recording and analyzing synaptic currents and synaptic potentials.</a> Current Protocols in Neuroscience. Chapter 6, Unit. , Chapter 6, Unit 6 10 (2001).</li>
<li>Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+Imaging+of+Cortical+Neurons+using+Fura-2+AM%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Calcium Imaging of Cortical Neurons using Fura-2 AM.</a> Journal of Visualized Experiments. (23), e1067(2009).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

L'interazione tra una cellula e il suo ambiente (ad esempio, la comunicazione con altre cellule, la risposta a diversi stimoli, ecc.), si basa fortemente sulla corretta espressione dei recettori sulla superficie cellulare. La regolazione rapida e messa a punto nel contenuto del recettore espresso in superficie consente una risposta cellulare adeguata a un ambiente in continua evoluzione. Nel caso particolare dei neuroni, le alterazioni del numero, la localizzazione e la composizione delle sottounità di recettori sinatici...

Le cellule utilizzano il processo attivo di traffico per mobilitare le proteine a specifiche localizzazioni subcellulari ed esercitare una rigorosa regolazione spatiotemporale sulla loro funzione1. Questo processo è particolarmente importante per i recettori transmembrani, poiché le risposte cellulari a diversi stimoli ambientali si basano su cascate intracellulari innescate dall'attivazione del recettore. Le cellule sono in grado di modificare queste risposte alterando la densità, la localizzazione e la composizione delle sottounità dei recettori espressi sulla superficie cellulare tramite il regolamento del traffico subcellulare del recettore2 . L'inserimento di nuovi recettori sintetizzati nella membrana plasmatica, insieme all'endocitosi e al riciclaggio dei recettori esistenti sono esempi di processi di traffico che determinano il pool netto di recettori espressi in superficie2. Molti meccanismi molecolari cooperano per regolare il traffico di proteine, comprese le interazioni proteina-proteina e le modifiche post-traduzionali come il fosforo, l'ubiquitinazione o il palmitoylation2.
La regolazione del traffico dei recettori è particolarmente necessaria in cellule fortemente polarizzate con strutture altamente specializzate. L'esempio paradigmatico è il controllo della funzione neuronale mediante traffico regolato di recettori del glutammato (GluR)3,4. Glutamate, il principale neurotrasmettitore eccitatorio, lega e attiva GluR espressi in superficie per controllare le funzioni neuronali fisiologiche fondamentali come la neurotrasmissione sinaptica e la plasticità sinaptica. Il fatto che il traffico alterato di GluR sia stato osservato in un ampio spettro di neuropatie, che vanno dai disturbi del neurosviluppo alle malattie neurodegenerative, evidenzia l'importanza di questo processo5. Pertanto, comprendere gli eventi molecolari che controllano il traffico di GluR è di interesse in molte aree di ricerca.
In questo protocollo, viene utilizzato un metodo basato sull'alimentazione degli anticorpi per quantificare il livello di GluR espressi in superficie nei neuroni ippocampali primari, nonché per valutare come i cambiamenti nell'internalizzazione e nel riciclo si traducano nell'espressione della superficie netta osservata. L'uso di farmacologia e/o sovraespressione di recettori esogeni che ospitano mutazioni specifiche rende questo protocollo un approccio particolarmente potente per studiare i meccanismi molecolari alla base dell'adattamento neuronale a diversi stimoli ambientali. Un ultimo esempio dell'utilità di questo protocollo è lo studio di come i cambiamenti multifattoriali nell'ambiente (come in un modello di malattia) influenzino il traffico di GluR attraverso l'esame dell'espressione superficiale in tali modelli.
Utilizzando esempi specifici, è inizialmente dimostrato come una manipolazione farmacologica che imita la stimolazione sinaptica fisiologica [LTP chimico (cLTP)] aumenti l'espressione superficiale della sottounità endogena GluA1 del tipo AMPA dei GluR (AMPAR) 6.Il traffico di una forma fosforo-mimetica sovraespressa della sottounità GluN2B di NLUDA-tipo di GluRs (NMDAR) viene analizzato anche per esemplificare come questo protocollo può essere utilizzato per studiare la regolazione del traffico di GluR da parte di specifiche post-traslazionali Modifiche. Anche se questi esempi specifici sono utilizzati, questo protocollo può essere facilmente applicato ad altri GluR e altri recettori e proteine che possiedono domini extracellulari antigenici. Nel caso in cui non siano disponibili anticorpi per i domini extracellulari, la sovraespressione delle proteine con etichettatura epitope extracellulare (ad esempio, Flag-, Myc-, GFP-tagged, ecc.) può aiutare nell'etichettatura delle proteine.
L'attuale protocollo fornisce istruzioni per quantificare la densità e il traffico specifici di sottotipi di GluR utilizzando anticorpi specifici. Questo protocollo può essere utilizzato per studiare 1) espressione di superficie GluR totale, 2) internalizzazione GluR e 3) riciclaggio di GluR. Per studiare ogni processo singolarmente, si consiglia di iniziare con le sezioni 1 e 2 e continuare con le sezioni 3, 4 o 5. In tutti i casi, terminare con le sezioni 6 e 8 (Figura 1).

<table><tbody><tr><td>Occhiali copritutto spessi 18 mm Ø #1,5</td><td>Neuvitro</td><td>GG181.5</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 555-capra coniugata anti-topo secondaria</td><td>Life Technologies</td><td>A21424</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 555-capra coniugata anti-coniglio secondaria</td><td>Life Technologies</td><td>A21429</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 647-capra coniugata anti-topo secondaria</td><td>Life Technologies</td><td>A21236</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 647-capra coniugata anti-coniglio secondario</td><td>Life Technologies</td><td>A21245</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar Piastre per colture cellulari a fondo piatto</td><td>Corning</td><td>3513</td><td></td></tr><tr><td>Dynasore</td><td>Tocris</td><td>2897</td><td></td></tr><tr><td>Glucosio</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Tocris</td><td>0219</td><td></td></tr><tr><td>Capra anti-coniglio Fab frammenti Sigma</td><td></td><td>SAB3700970</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H7006</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutammina</td><td>Sigma</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamina 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>Topo anticorpo anti-GluA1</td><td>Millipore</td><td>MAB2263</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S6546</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal Media</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>NGS</td><td></td><td>Abcam Ab7481</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>PM999</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Pelco BioWave</td><td>Ted Pella</td><td>36500</td><td></td></tr><tr><td>PFA</td><td>Alfa Aesar</td><td>43368</td><td></td></tr><tr><td>Picrotossina</td><td>Tocris</td><td>1128</td><td></td></tr><tr><td>Bromidrato di poli-D-lisina</td><td>Sigma</td><td>P7280</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant</td><td>Life Technologies</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-GFP di coniglio</td><td>Invitrogen</td><td>A11122</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-PSD-95 di coniglio</td><td>Segnalazione cellulare</td><td>2507</td><td></td></tr><tr><td>Strychnine</td><td>Tocris</td><td>2785</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost plus vetrini per microscopio</td><td>Fisher</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>TTX</td><td>Tocris</td><td>1078</td><td></td></tr></tbody></table>

un approccio di alimentazione anticorpale per studiare il traffico di recettori del glutammato nelle culture ippocampali primarie dissociate

An Antibody Feeding Approach to Study Glutamate Receptor Trafficking in Dissociated Primary Hippocampal Cultures

Le risposte cellulari agli stimoli esterni si basano fortemente sull'insieme di recettori espressi sulla superficie cellulare in un dato momento. Di conseguenza, la popolazione di recettori espressi in superficie è costantemente adattandosi e soggetta a rigidi meccanismi di regolazione. L'esempio paradigmatico e uno degli eventi di traffico più studiati in biologia è il controllo regolato dell'espressione sinaptica dei recettori del glutammato (GluRs). I GluR mediano la stragrande maggioranza della neurotrasmissione eccitatoria nel sistema nervoso centrale e controllano i cambiamenti funzionali e strutturali dipendenti dall'attività fisiologica a livello sinaptico e neuronale (ad esempio, plasticità sinaptica). Le modifiche nel numero, posizione, e la composizione delle sottounità di superficie espressi GluRs influenzano profondamente la funzione neuronale e, infatti, le alterazioni in questi fattori sono associate a diverse neuropatie. Presentato qui è un metodo per studiare il traffico di GluR nei neuroni primari ippocampali dissociati. Un approccio di "alimentazione anticorpale" viene utilizzato per visualizzare in modo differenziale le popolazioni di GluR espresse nelle membrane superficiali e interne. Etichettando i recettori di superficie sulle cellule vive e fissandoli in momenti diversi per consentire l'endocitosi e/o il riciclaggio dei recettori, questi processi di traffico possono essere valutati e studiati in modo selettivo. Questo è un protocollo versatile che può essere utilizzato in combinazione con approcci farmacologici o sovraespressione di recettori alterati per ottenere informazioni preziose sugli stimoli e sui meccanismi molecolari che influenzano il traffico di GluR. Allo stesso modo, può essere facilmente adattato per studiare altri recettori o proteine espresse dalla superficie.

Questo protocollo per studiare il traffico dei recettori del glutammato si basa sull'etichettatura differenziale dei recettori espressi sulla superficie cellulare e su quelli espressi nelle membrane interne. La segregazione si ottiene etichettando i recettori prima e dopo la permeabilizzazione della membrana, utilizzando lo stesso anticorpo primario ma un anticorpo secondario coniugato a un fluoroforo diverso. Come delineato dalle fasi facoltative incluse il protocollo, questo è un metodo...

Questo articolo presenta un metodo per studiare il recettore del glutammato (GluR) nel traffico di cellule ippocampali primarie dissociate. Utilizzando un approccio anticorpale-alimentazione per etichettare i recettori endogeni o sovraespressi in combinazione con approcci farmacologici, questo metodo consente l'identificazione di meccanismi molecolari che regolano l'espressione della superficie di GluR modulando processi di internalizzazione o riciclaggio.

Un approccio di alimentazione anticorpale per studiare il traffico di recettori del glutammato nelle culture ippocampali primarie dissociate

Cellular responses to external stimuli heavily rely on the set of receptors expressed at the cell surface at a given moment. Accordingly, the population ...

Le risposte cellulari agli stimoli esterni si basano fortemente sull'insieme di proteine che si esprimono sulla superficie cellulare in un dato momento. Di conseguenza, il numero, la localizzazione subcellulare e la composizione subunità di queste proteine sono controllati dinamicamente. Qui, useremo un approccio di alimentazione degli anticorpi per quantificare il livello di recettori espressi in superficie nelle colture cellulari, purché riprenda l'internalizzazione e il riciclaggio.Si tratta di un protocollo molto versatile, che fornisce informazioni meccaniche sulla regolazione delle proteine espresse in superficie. Nel nostro esempio, studieremo i recettori della glutammina nei neuroni ippocampali primari. Questo protocollo può essere adattato a qualsiasi proteina che possiede un epitopo extracellulare anagenico, se gli anticorpi non sono disponibili, la trasvezione di costrutti taggati può essere utile sia per l'etichettatura che per lo studio di mutazioni specifiche.Nei nostri esempi, usiamo anticorpi contro il GluA1 endogeno, e taggato Glu12 B.To iniziamo questa procedura, trasferiamo il lato cellulare della copertura fino a un vassoio coperto di pellicola di paraffina, per salvare i reagenti e facilitare la manipolazione. Salvare e mantenere i supporti condizionati a 37 gradi Celsius per le fasi di incubazione e lavaggio. Incubare le cellule con anticorpi primari diluiti in mezzi condizionati, a temperatura ambiente, per 15 minuti.Successivamente, utilizzare una pipetta sottovuoto per aspirare con cura l'anticorpo contenente mezzi e lavare le cellule tre volte con mezzi condizionati. Se si studia l'espressione del recettore della superficie rispetto a quella intracellulare, fissare le cellule con paraformaldeide dopo questo passaggio, come delineato nel protocollo di testo. Mantenere le cellule in mezzi condizionati senza anticorpi e restituirle all'incubatrice a 37 gradi Celsius per consentire l'internalizzazione.Se si studia il processo di internalizzazione, correggere le celle con paraformaldeide dopo questo passaggio, come indicato nel protocollo di testo. Per bloccare gli epitopi sull'anticorpo primario attaccato alla superficie espresso recettori che non sono stati internalizzati, incubare cellule con frammenti anticorpali Fab anti-IgG non coniugati diluiti in mezzi condizionati, per 20 minuti a temperatura ambiente. Dopo questo, lavare le cellule tre volte con mezzi condizionati.Incubare i pozzi lavati con mezzi condizionati contenenti 80 micromolare Dynasore, a 37 gradi Celsius, per consentire il riciclo dei recettori internalizzati. Dopo aver terminato le modifiche sulle cellule vive, lavare le cellule una volta con PBS plus. Aggiungere alle cellule una soluzione di paraformaldeide e 4% di saccarosio in PBS e incubare in una cappa aspirante a temperatura ambiente per sette-otto minuti, per fissare le cellule.Quindi lavare le cellule tre volte con PBS normale. Aggiungere una soluzione di siero di capra normale al 10% in PBS alle cellule e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti per bloccare siti di legame non specifici. Successivamente, incubare le cellule con anticorpi secondari contrassegnati fluorescentmente diluiti in 3%NGS in PBS a temperatura ambiente per un'ora, per etichettare i recettori delle etichette degli anticorpi primari.Dopo questo, lavare le cellule tre volte con PBS. Per iniziare a etichettare i recettori intracellulari, aggiungere una soluzione dello 0,25%TritonX in PBS e incubare a temperatura ambiente per cinque-10 minuti, per permeabilizzare le cellule. Quindi blocca con 10%NGS a temperatura ambiente per 30 minuti.Se si studiano superficie rispetto al totale, incubare le cellule con lo stesso anticorpo primario utilizzato in precedenza, diluite con 3%NGS in PBS, a temperatura ambiente per un'ora, per etichettare i recettori intracellulari. Quindi, lavare le cellule tre volte con PBS. Etichetta con secondo anticorpo secondario contrassegnato fluorescentmente, diluito in 3%NGS in PBS, a temperatura ambiente per un'ora.Dopo questo lavare le cellule tre volte con PBS. Posizionare prima delicatamente i coperchi, lato cella verso il basso, su 12-15 microlitri del supporto di montaggio appropriato per montare le celle. Quindi immagini le celle sul microscopio confocale appropriato e analizza le celle come delineato nel protocollo di testo.Questo protocollo per studiare il traffico del recettore del glutammato si basa sull'etichettatura differenziale dei recettori, espressa sulla superficie cellulare, e di quelli espressi nelle membrane interne. Dopo aver acquisito immagini confocali, il segnale fluorescente può essere facilmente quantificato per mostrare un aumento dell'espressione superficiale, rispetto alla popolazione intracellulare, a seguito di LTP chimico. Nessun segnale per PSD-95 può essere ottenuto in cellule non permeabilizzate, dimostrando l'integrità della membrana plasmatica.Ciò indica che il segnale ottenuto per la superficie GluA1 corrisponde effettivamente ai recettori espressi in superficie. È importante sottolineare che un segnale minimo per il GluA1 interiorizzato può essere osservato in condizioni di non permeabilizzazione, dimostrando che tutti gli epitopi superficiali sono occupati dal ciclo iniziale di etichettatura degli anticorpi. Vengono quindi identificati i recettori che sono stati internalizzati.Questo esempio evidenzia che la fosforilazione GluN2B a S1480 promuove l'internalizzazione del recettore. Poiché il mutante fosfomimetico S1480E mostrava un rapporto di internalizzazione molto più elevato rispetto ai recettori di tipo selvaggio. Come previsto, non viene ottenuto alcun segnale per i recettori internalizzati nel controllo.Successivamente, vengono identificati recettori riciclati e recettori internalizzati. Il rapporto di riciclaggio generato mostra che GluN2B S1480E non ha alcun effetto sul riciclaggio NMDAR. Nel controllo, un segnale forte può essere osservato per la superficie espressa GluN2B in assenza di blocco Fab.Questo segnale scompare nelle colture trattate da Fab, dimostrando che il protocollo di blocco è sufficiente per bloccare completamente gli epitopi espressi in superficie, e che i segnali superficiali osservati dopo il riciclaggio corrispondono effettivamente ai recettori trafficati verso la membrana plasmatica. L'attuale protocollo è solo uno dei metodi disponibili per studiare la regolazione delle proteine espresse in superficie. Altri approcci possono essere adottati per espandere o verificare i dati ottenuti qui.Questi includono metodi biochimici, come la biotinylation, le tecniche di imaging della vita o approcci funzionali, come l'elettrofisiologia o l'imaging del calcio. Usiamo pfa per congelare la localizzazione dei recettori, tuttavia PFA è un noto cancerogeno, quindi è fondamentale eseguire passaggi utilizzando PFA sotto una cappa aspirante, mentre si indossano DPI appropriati.

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Questo video dimostra un approccio di alimentazione anticorpale per studiare il traffico dei recettori del glutammato nelle colture neuronali primarie dell'ippocampo. Questo approccio consente l'osservazione delle popolazioni di recettori sia nel plasma che nelle membrane interne. La discriminazione tra questi sottogruppi si ottiene marcando i recettori prima e dopo la permeabilizzazione della membrana, utilizzando lo stesso anticorpo primario ma anticorpi secondari coniugati a diversi...

Una tecnica in vitro per studiare il traffico del recettore del glutammato nei neuroni dell'ippocampo

Descriviamo un metodo per etichettare proteina sulla superficie dei neuroni viventi utilizzando un anticorpo policlonale specifico per epitopi extracellulari. Proteina legata per l'anticorpo sulla superficie cellulare e successivamente internalizzato tramite endocitosi può essere distinta dalla proteina rimanente, o trafficate, la superficie durante l'incubazione.

Etichettatura differenziale di Cell-superficie e interiorizzato Proteine ​​dopo Antibody Alimentazione dal vivo colture di neuroni

Qui mostriamo l'uso di colorante fluorescente Alexa accoppiato ad α-bungarotossina per misurare GABA A localizzazione superficiale recettore e endocitosi nei neuroni dell'ippocampo. Attraverso l'uso di costrutti recanti un breve tag extracellulare che lega α-bungarotossina, analisi di proteine ​​di membrana plasmatica traffico endocitico può essere raggiunto.

L&#39;utilizzo di un α-bungarotossina Binding Tag sito per studiare GABA un recettore di membrana localizzazione e il traffico

I meccanismi molecolari che coordinare la formazione di sinapsi inibitorie GABAergici durante l'ontogenesi sono in gran parte sconosciuti. Per studiare questi processi, abbiamo sviluppato un sistema di co-coltura modello che incorpora embrionali i neuroni GABAergici di medie spinosa coltivate insieme stabilmente trasfettate rene embrionale umano 293 (HEK293), le cellule che esprimono i recettori GABA A funzionali.

Inibitorio formazione di sinapsi in un co-coltura modello che incorpora GABAergici di medie spinosa neuroni e cellule HEK293 che esprimono stabilmente GABA A Recettori

Le colture a bassa densità di neuroni primari dell'ippocampo di solito richiedono uno strato di alimentazione della glia per fornire fattori neurotrofici e sostenere la longevità. Descriviamo qui un metodo semplificato per coltivare neuroni a bassissima densità su vetrini coprioggetti in presenza di uno strato di alimentazione neuronale ad alta densità, che facilita lo studio di specifici meccanismi neuronali-autonomi.

Un metodo semplificato per Ultra-Low Density, Long-Term primaria ippocampale Neuron Cultura

Questo articolo illustra come l'espressione dei recettori dei neurotrasmettitori possa essere quantificata e il pattern analizzato nelle sinapsi con elementi pre e postsinaptici identificati utilizzando una combinazione di trasduzione virale di strumenti optogenetici e la tecnica di immunomarcatura della replica della frattura da congelamento.

Combinato optogenetic e Freeze-frattura Replica immunomarcatura per esaminare specifica disposizione-Input di glutammato recettori nell&#39;amigdala mouse

Qui, descriviamo l'installazione, software di navigazione, e l'analisi dei dati per un metodo spazialmente e temporalmente precisa misurazione toniche e fasiche cambiamenti glutammato extracellulare in vivo utilizzando matrici di microelettrodi enzimatico (MEA).

Utilizzando biosensori a base di enzimi misurare Tonic e Phasic glutammato in modelli murini di Alzheimer

L'obiettivo del presente protocollo è quello di facilitare lo studio dei recettori NMDA (NMDAR) a scala più ampia e consentire l'esame degli effetti modulatory di piccole molecole e le loro applicazioni terapeutiche.

Un'analisi di flusso di calcio High-throughput per studiare i recettori NMDA con sensibilità al glutammato e glicina/D-serina

Eccitabilità di un neurone può essere modulata attraverso un processo dinamico di endo - ed esocitosi dei ricevitori ionotropici eccitanti del glutammato. Descritto qui è un test accessibile, ad alto contenuto per la quantificazione del recettore di superficie e interno popolazione piscine.

Un'analisi ad alto contenuto per monitoraggio AMPA traffico recettoriale

L'encefalite autoimmune è una nuova categoria di malattie mediate da anticorpi del sistema nervoso centrale. I neuroni ippocampali possono essere utilizzati per scoprire e caratterizzare questi anticorpi. Questo articolo fornisce un protocollo per la coltura cellulare primaria e l'immunocolorazione per determinare gli autoanticorpi nel siero e nel liquido cerebrospinale dei pazienti.

Colture neuronali ippocampali per rilevare e studiare nuovi anticorpi patogeni coinvolti nell'encefalite autoimmune

Scopri un metodo di alimentazione anticorpale per studiare il traffico dei recettori del glutammato nelle culture ippocampali primarie dissociate. Questa tecnica permette di analizzare l'internalizzazione e il riciclo dei recettori.

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