Sintesi gerarchica e programmabile di Oligosaccaride
6 settembre 2019
Questo protocollo dimostra come utilizzare il software Auto-CHO per la sintesi gerarchica e programmabile di oligosaccharides. Descrive anche la procedura generale per gli esperimenti di determinazione RRV e la glicosilazione di SSEA-4.
Dimostriamo come utilizzare il nostro software di nuova sviluppo, Auto-CHO, per la sintesi gerarchica e programmabile di oligosaccaridi one-pot. Auto-CHO include algoritmi su blocchi predefiniti espansi, con valori di reattività relativi previsti attraverso l'apprendimento automatico. Il software Auto-CHO fornisce una preziosa linea guida per la selezione dei blocchi di costruzione e un progetto gerarchico per la sintesi multipla di un vaso di glicani più complessi attraverso la composizione dei frammenti.
Le implicazioni di questa tecnica si estendono verso la terapia di tumori o malattie infettive da parte di terapie a base di carboidrati. Prima di usare Auto-CHO, assicurati che Java Runtime Environment sia stato installato in un PC o mac. La dimostrazione visiva della manipolazione del software Auto-CHO e il relativo esperimento di determinazione del valore di reattività aiuteranno i chimici a seguire il protocollo e a procedere rapidamente con l'esperimento.
Per eseguire l'inizializzazione software di Java Runtime Environment, visitare il sito Web Auto-CHO e scaricare il software in base al sistema operativo. Attualmente, Auto-CHO supporta Windows, macOS e Ubuntu. L'ultima guida per l'utente PDF è disponibile sul sito Web Auto-CHO.
Per gli utenti Windows, decomprimere il Windows Auto-CHO. zip e fare doppio clic su Auto-CHO. nella cartella Auto-CHO di Windows per avviare il programma.
Inserire la struttura glica desiderata. Scegliere di disegnare una struttura glica o leggere un file di struttura esistente. Per inserire disegnando, fare clic su modifica glica di GlycanBuilder, o l'area di clic qui per modificare la destinazione sintetica per disegnare e modificare la struttura di query di GlycanBuilder.
Le informazioni sul collegamento e sulla chiralità non devono essere ignorate. Fare clic sui pulsanti Globo-H, SSEA-4 o OligoLacNAc per visualizzare gli esempi. Chiudere il dialogo GlycanBuilder per completare la modifica.
Definire i parametri di ricerca nella scheda impostazioni parametro per ottenere risultati di ricerca ragionevoli. Clicca sul pulsante ok per abilitare nuove impostazioni. L'impostazione predefinita è solo per la ricerca nella libreria sperimentale.
Se si desidera eseguire ricerche sia nelle librerie sperimentali che virtuali, selezionare la scheda libreria di blocchi edifici virtuali. Selezionare Usa librerie sperimentali e virtuali e applicare il filtro per visualizzare blocchi predefiniti virtuali con determinati criteri. Elementi costitutivi sperimentali e virtuali possono lavorare insieme per migliorare la capacità di ricerca di Auto-CHO.
Attualmente, Auto-CHO fornisce più di 50.000 blocchi predefiniti virtuali, conrrv previsti nella libreria. Controllare uno o più blocchi predefiniti virtuali desiderati che l'utente desidera utilizzare per la ricerca. Fare clic sul pulsante mostra blocchi predefiniti virtuali selezionati per visualizzare solo i blocchi predefiniti virtuali selezionati.
Fare clic sul pulsante Mostra blocchi predefiniti virtuali filtrati per visualizzare solo i blocchi predefiniti virtuali con determinati criteri definiti dall'utente. Fare clic sul pulsante mostra tutti i blocchi predefiniti virtuali per visualizzare tutti i blocchi predefiniti virtuali disponibili e reimpostare il filtro. Selezionare la scheda struttura query e fare clic sul pulsante della raccolta blocchi predefinito di ricerca per trovare le soluzioni sintetiche one-pot per la struttura di query.
Confermare quindi le impostazioni dei parametri. Eseguire una ricerca nel visualizzatore dei risultati. Il risultato della ricerca viene visualizzato nella scheda visualizzazione dei risultati.
Gli accettori finali riducenti di diversi numeri di residui vengono visualizzati nella colonna dell'accettore finale riducente. Selezionare quindi un accettore finale riducente. Le soluzioni vengono visualizzate nell'elenco delle soluzioni sintetiche.
I frammenti sono mostrati nell'elenco dei frammenti per suggerire quanti frammenti dovrebbero essere usati nella sintesi. Il sistema fornisce informazioni dettagliate su ogni frammento, incluso l'RRV del frammento, la resa computazionale, così come quale gruppo protettivo dovrebbe essere deprotetto per l'uso del frammento nella reazione di un vaso. Vengono visualizzati anche i blocchi predefiniti utilizzati per assemblare il frammento selezionato e le informazioni sulla connessione del frammento.
Per gli elementi costitutivi sperimentali, visualizzare e controllare le strutture chimiche degli elementi costitutivi selezionati nella struttura chimica della regione del blocco predefinito e vedere il browser dettagliato dei blocchi predefiniti delle informazioni. In un pallone inferiore rotondo da 10 millilitri, unire i due donatori di tioglicoside, metanolo assoluto e drierite in DCM. Quindi mescolare a temperatura ambiente per un'ora.
Prendere un'aliquota di 30 microliter di questa miscela e iniettare la miscela in cromatografia liquida ad alte prestazioni in tre iniezioni separate. Misurare il coefficiente tra l'assorbimento e la concentrazione della molecola donatrice nelle condizioni di separazione di base. Aggiungere una soluzione di N-Iodosuccinimide molare 0,5 nell'acetonitrile nella miscela di reazione, seguita dall'aggiunta di una soluzione di acido trifluorometanolfonico molare 0,1.
Mescolare la miscela a temperatura ambiente per due ore. Successivamente, diluire la miscela di reazione con quattro millilitri di DCM. Filtrare e lavare la reazione con tiosolfato di sodio acquoso saturo, contenente carbonato di idrogeno al 10%.
Ora estrarre lo strato acquoso tre volte con cinque millilitri di DCM. Unire tutti gli strati organici e lavare con cinque millilitri di salamoia. Quindi asciugare gli strati combinati con circa 200 milligrammi di solfato di magnesio anidro.
Agitare leggermente la miscela per 30 secondi e filtrarla attraverso un imbuto con una carta filtrante scanalata per rimuovere il solfato di magnesio. Quindi raccogliere il filtrato in un pallone inferiore rotondo da 25 millilitri. Rimuovere il solvente, utilizzando un evaporatore rotante.
Sciogliere il residuo in un millilitro di DCM. Prendere un'aliquota di 30 microliter di questa miscela e iniettarla nella cromatografia liquida ad alte prestazioni in tre iniezioni separate. Misurare le concentrazioni dei donatori rimanenti da parte dell'HPLC, nelle stesse condizioni di separazione.
Misurare la reattività relativa. In base al valore relativo di reattività di DR4, il valore relativo di reattività di DX1 è tre. Il risultato della ricerca Auto-CHO basato sulle impostazioni predefinite dei parametri indica che SSEA-4 può essere sintetizzato da una reazione di due più uno più tre un-pot.
Quando è selezionato un accettore finale che riduce il trisaccharide, vengono mostrate quattro potenziali soluzioni per la query. La prima soluzione ha un frammento e la sua resa calcolata è di circa il 94%Il frammento può essere sintetizzato da due blocchi predefiniti. L'RRV del primo blocco predefinito disaccaride è 1462, e l'RRV del secondo monosaccaride è 32.0.
Viene mostrata anche la struttura chimica del primo blocco predefinito suggerito utilizzato nella reazione a un vaso. L'esperimento one-pot mostra che SSEA-4 può essere sintetizzato correttamente con una resa del 43% da questo suggerimento. SSEA-4 può essere sintetizzato da tre unità suggerite da Auto-CHO.
Queste unità includono il blocco predefinito disaccaride silele uno, il blocco predefinito monosaccaride due e la riduzione dell'accettore finale tre. Per le impostazioni dei parametri, si consiglia di impostare parametri con criteri più rigorosi all'inizio. Per la selezione della libreria dei blocchi di costruzione, si consiglia di cercare la libreria sperimentale solo all'inizio.
Attraverso questa dimostrazione, speriamo che i glicani più importanti, come gli antigeni di carboidrati associati al tumore, possano essere sintetizzati dall'approccio one-pot per ulteriori studi. Seguendo questa procedura, la sintesi di tutti questi antigeni può essere eseguita al fine di progettare vaccini contro il cancro a base di carboidrati. Speriamo anche che l'intelligenza artificiale e gli algoritmi informatici possano facilitare la sintesi glica automatizzata a beneficio del trattamento e della prevenzione delle malattie.
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Panoramica
Questo protocollo illustra l'uso del software Auto-CHO per la sintesi gerarchica e programmabile in un unico reattore di oligosaccaridi. Include una dimostrazione visiva della manipolazione del software e degli esperimenti di determinazione del RRV.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Sintesi di oligosaccaridi
- Sviluppo di software
- Applicazioni dell'apprendimento automatico
Sfondo
- Il software Auto-CHO facilita la sintesi degli oligosaccaridi.
- Algoritmi predicono i valori di reattività relativa utilizzando l'apprendimento automatico.
- Sono fornite linee guida per la selezione dei building block.
- Implicazioni per applicazioni terapeutiche nel trattamento del cancro e delle malattie infettive.
Scopo dello studio
- Dimostrare la funzionalità del software Auto-CHO.
- Fornire un protocollo per la glicosilazione in un unico reattore.
- Facilitare la sintesi di glicani complessi attraverso la composizione di frammenti.
Metodi Utilizzati
- Sintesi gerarchica di oligosaccaridi.
- Algoritmi di apprendimento automatico per la previsione di valori di reattività.
- Dimostrazioni visive dell'utilizzo del software.
- Esperimenti di determinazione del RRV.
Risultati principali
- Dimostrazione riuscita della sintesi degli oligosaccaridi in un unico reattore.
- Linee guida efficaci per la selezione dei precursori.
- Istruzioni visive chiare per i chimici.
- Applicazioni terapeutiche potenziali evidenziate.
Conclusioni
- Il software Auto-CHO è uno strumento prezioso per la sintesi degli oligosaccaridi.
- L'apprendimento automatico migliora il processo di sintesi.
- Il protocollo consente un'esecuzione rapida degli esperimenti.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La sintesi programmabile in un unico reattore di oligosaccaridi consente un assemblaggio rapido di glicani complessi per la validazione di bersagli terapeutici, riducendo i tempi di sviluppo per candidati farmaceutici a base di carboidrati. Il software Auto-CHO fornisce una selezione predittiva dei blocchi costitutivi e una pianificazione gerarchica della sintesi, supportando la riduzione dei rischi meccanicistici nelle fasi iniziali della scoperta. Questo approccio migliora la selezione del portafoglio aumentando la fiducia nelle relazioni struttura-attività dei glicani prima dell'investimento preclinico.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche attraverso la sintesi rapida di strutture glicaniche definite, come SSEA-4, per la validazione di marcatori delle cellule staminali.
- Valore operativo: Supporta la riduzione del rischio biologico generando lotti omogenei di oligosaccaridi per saggi di validazione funzionale delle proteine bersaglio.
- Valore predittivo: Facilita la mappatura delle relazioni struttura-attività al fine di selezionare epitopi glicanici con potenziale terapeutico nei bersagli del cancro e delle malattie infettive.
Sviluppo di screening e saggi
- Prontezza del saggio: Produce preparazioni standardizzate di glicani adatte allo sviluppo di microarray di carboidrati e saggi di legame.
- Risultati quantitativi: Fornisce rese misurabili e profili di purezza che consentono uno screening affidabile di composti contro proteine leganti i glicani.
- Riutilizzo della piattaforma: Permette un'affinazione iterativa delle librerie di unità costitutive tramite il feedback degli utenti sui blocchi virtuali, migliorando la scalabilità a lungo termine degli screening.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Rilevanza per le malattie: La sintesi dimostrata di SSEA-4, un marcatore delle cellule staminali pluripotenti, supporta l'allineamento dei biomarcatori nella medicina rigenerativa e nel targeting delle cellule staminali tumorali.
- Continuità traslazionale: Fornisce un percorso dalla sintesi su scala scoperta alla valutazione preclinica di antigeni carboidrati associati ai tumori per lo sviluppo di vaccini.
- Avanzamento proporzionato al rischio: Permette la produzione di glicani con struttura definita per ridurre l'ambiguità nella valutazione dell'efficacia immunologica e del profilo di sicurezza.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nei flussi di lavoro delle fasi iniziali di scoperta consentendo la sintesi di glicani guidata da ipotesi, fornendo strutture antigeniche definite per l'identificazione dei composti promettenti e sostenendo la validazione preclinica attraverso la produzione riproducibile di glicani.
- Biologia della scoperta: Supporta la riduzione del rischio meccanicistica chiarificando i percorsi biosintetici e validando bersagli glicanici attraverso sintesi chimica definita.
- Screening: Genera pannelli di glicani pronti per saggi con rese quantificate per lo screening ad alto rendimento delle interazioni glicani-proteine.
- Analisi: Fornisce valori di reattività relativi e rese computazionali come letture quantitative per confrontare l'efficienza dei percorsi sintetici e prevedere il successo.
- Ricerca traslazionale: Si collega a studi preclinici permettendo la sintesi di antigeni carboidratici associati ai tumori per la valutazione di candidati vaccini.
- Riutilizzo aziendale: Funziona come capacità riutilizzabile grazie all'espansione virtuale guidata dal feedback di Auto-CHO, riducendo la pianificazione ridondante della sintesi tra diversi progetti.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione degli obiettivi riducendo l'ambiguità meccanicistica nella funzione dei glicani.
- Valore operativo: Migliora la riproducibilità e la scalabilità della produzione di oligosaccaridi attraverso protocolli standardizzati in un unico reattore.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di proseguimento o interruzione consentendo un'esplorazione rapida delle relazioni struttura-attività, riducendo il rischio di fallimento biologico in fasi avanzate.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione basata sul rischio dei candidati glicano-mediati attraverso previsioni definite di accessibilità sintetica e resa.
Considerazioni sull'Implementazione
- Richiede competenze in chimica dei carboidrati e nell'interpretazione della struttura dei glicani per una selezione efficace dei building block.
- Necessita dell'accesso a HPLC e a infrastrutture standard per la sintesi organica per la determinazione dei RRV e il monitoraggio delle reazioni.
- Richiede una standardizzazione intersettoriale della nomenclatura dei glicani e dei formati strutturali di input per interrogazioni Auto-CHO coerenti.
- Comporta considerazioni di adattamento quando si estende a building block non basati su tioglicosidi o a strategie alternative di protezione dei gruppi funzionali.
- È limitato dall'accuratezza dei RRV predetti tramite apprendimento automatico per nuovi building block, richiedendo una validazione sperimentale per previsioni ad alta affidabilità.
