Name: Test anticorpale sui recettori anti-RDL e anti-mGlutR1 nelle sezioni del cervello di Honeybee utilizzando CRISPR-Cas9 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-30T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: Scopri come modificare i recettori GABAA e glutammatergici nel cervello dell'ape adulta con CRISPR-Cas9 per studiare apprendimento e memoria. Questo metodo consente di testare la specificità degli anticorpi in immunocitochimica.

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Questo lavoro è stato sostenuto dai seguenti premi a BHS: Human Frontiers Science Program; NIH NIGMS (R01 GM113967); Laboratorio di idee NSF (1556337). Il peptide e anticorpi per DmGluRA sono stati progettati nel laboratorio Dr. Serge Birman (Marsiglia, Luminy, Francia) quando IS è stato supportato dal Programma d'Urgence FRM/Postdocs UFP20060306548 dalla Fondation pour la Recherche Medicale. Siamo grati per Daniela Junqueira Marosi e Alex Hanter di Integrated DNA Technology (IDT) per la progettazione di guide RDL e analisi di drop-off qPCR.

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Caratterizzazione dell'anti-RDL e dell'anti-mGlutR1 In primo luogo, abbiamo caratterizzato gli anticorpi anti-RDL e anti-mGlutR1 da immunoblot e pre-adsorbiente sulle fette di cervelli fissi delle api. Ogni anticorpo è stato fatto per riconoscere tutte le sue isoformi conosciute, e l'analisi occidentale mostra che riconoscono le bande che corrispondono ai loro pesi molecolari previsti. Successivamente, entrambi gli anticorpi sono stati bloccati dal peptide coniugato contro il quale sono stati prodotti su sezioni cerebrali di api melpote.
Uno dei primi obiettivi del nostro studio è stato quello di stabilire che gli anticorpi prodotti contro il peptide coniugato specifico sono specifici per la sua proteina nel tessuto cerebrale fisso. A tale scopo, abbiamo approfittato del sistema CRISPR-Cas9. Abbiamo progettato guide specifiche per honeybee RDL e mGlutR1 e le abbiamo utilizzate per realizzare CRISPR-Cas9 etichettato con la sonda fluorescente ATTO550. Per ogni recettore, abbiamo iniettato una miscela di tre diverse ribonucleoproteine CRISPR-Cas9 negli ocelli per ridurre la quantità di proteine mirate nel cervello delle api adulte eliminando il gene corrispondente nelle cellule che hanno assunto il nostro sistema Cas9 progettato. Nel nostro studio, abbiamo compiuto questo passaggio.
Uno dei primi passi cruciali per il successo di questi esperimenti è la progettazione degli RNA guida appropriati. Si consiglia di progettare fino a cinque RNA guida, situati all'inizio, al centro e alla fine della sequenza genica. Nel nostro lavoro preliminare, li abbiamo testati in varie combinazioni su tre o cinque api. Abbiamo anche provato diverse concentrazioni di iniezioni, così come i tempi dopo l'iniezione, e varie miscele di RNP nelle iniezioni. Abbiamo sezionato i cervelli e li abbiamo elaborati usando anticorpi anti-RDL e anti-mGlutR1. In questi test iniziali, abbiamo stabilito la combinazione appropriata, il tempo di post-iniezione, così come la concentrazione e la quantità di CRISPR-Cas9 per l'iniezione. Questi test iniziali sono stati la base per la creazione degli esperimenti che abbiamo descritto in dettaglio qui.
L'obiettivo era duplice: 1) dimostrare in un'ape che la nostra colorazione anticorpale è stata ridotta dopo il trattamento con CRISPR-Cas9 e 2) per lavorare attraverso le migliori condizioni sperimentali per gli studi comportamentali. Così, mostriamo che se molti nuclei cellulari contengono CRISPR-Cas9 48 h dopo l'iniezione, la riduzione della colorazione anti-RDL e anti-mGlutR1 è significativa. Inoltre, questo dimostra che gli anticorpi testati riconoscono specificamente la proteina mGlut1 e RDL nella preparazione del cervello delle api melfale e che possono essere utilizzati per studi di localizzazione nel cervello delle api.
Impostazione sperimentale CRISPR-Cas9 per lo studio comportamentale Successivamente, abbiamo impostato gli esperimenti in modo che CRISPR-Cas9 potrebbe essere utilizzato in studi comportamentali. Sono state raccolte otto o nove api melpote per il controllo e i trattamenti sperimentali. Sono stati testati comportamentalmente prima e dopo l'iniezione, e poi i loro cervelli sono stati elaborati per ATTO550 e/o immunocitochimica per determinare le regioni cerebrali che hanno mostrato la riduzione della proteina bersaglio. Qui è essenziale notare che il numero di api prese per una serie di esperimenti è stato limitato a non più di 8-9 api per le condizioni di controllo e sperimentali. In questo modo entrambe le condizioni potrebbero essere testate lo stesso giorno. Inoltre, una volta preparate le miscele CRISPR-Cas9 per l'iniezione, non le abbiamo mai congelate. La miscela CRISPR-Cas9 non ha cambiato la potenza quando viene utilizzata 3 giorni di fila e mantenuta a 4-8 gradi centigradi. Tuttavia, non abbiamo provato dopo 3 giorni.
Come abbiamo descritto nella sezione Risultati per entrambi i set di iniezioni sperimentali e per entrambi gli anticorpi, solo tre api da 16 testate hanno mostrato una grande distribuzione ATTO550 nel corpo del fungo, nel protocerebrum e nei lobi delle antenne. In tutte le altre api, la distribuzione di CRISPR-Cas9 era limitata al corpo del fungo, al complesso centrale e/o al protocerere posteriore. È essenziale capire per qualsiasi studio comportamentale che utilizzando questo metodo di iniezione la riduzione della proteina bersaglio sarà limitata solo al corpo del fungo nella maggior parte delle api. Non si estenderà al lobo dell'antenna o al ganglio subesofageo. Così, la tecnica di iniezione che usiamo è adatta per studiare l'effetto della riduzione dei recettori nel corpo del fungo e complesso centrale in esperimenti comportamentali, mentre un metodo diverso di introduzione CRISPR-Cas9 sarà più appropriato per studiare altre regioni del cervello.
In conclusione, il nostro studio ha dimostrato il successo dell'applicazione di CRISPR-Cas9 come controllo per la colorazione degli anticorpi nel cervello. Per entrambi gli anticorpi (anti-RDL e anti-mGlutR1), quando l'assorbimento di mGlutR1-CRISPR-Cas9 o RDL-CRISPR-Cas9 ha avuto successo, anche il livello di colorazione degli anticorpi corrispondenti è stato ridotto in modo significativo. Inoltre, è essenziale notare che l'iniezione negli ocelli ha portato ad una distribuzione di CRISPR-Cas9 nel cervello che non era omogeneo. La distribuzione variava da un'area minima che circonda il corpo di ocelli e funghi a molte cellule in tutto il cervello. La variabilità dell'assorbimento mGlutR1-o RDL-CRISPR-Cas9 da parte delle cellule era probabilmente dovuta a variazioni nelle iniezioni. I nostri dati mostrano che il sistema CRISPR-Cas9 funziona nelle api, ma il metodo di iniezione deve essere migliorato per ridurre la variabilità dell'assorbimento di CRISPR-Cas9 nei singoli cervelli delle api. All'interno di queste restrizioni, è ora possibile impiegare questa tecnica per manipolare i geni nelle api adulte per esperimenti comportamentali.

Il sistema CRISPR/Cas9 recentemente scoperto è un potente strumento che è stato utilizzato per modificare il DNA genomico in vari sistemi modello e organismi. Ha accelerato la ricerca biomedica e importanti scoperte tecnologiche rendendo la modificazione del genoma più efficiente e robusta rispetto ai metodi precedenti1. Originario dei batteri S. pyogenes, il sistema si basa su un endonuclease Cas9, la cui attività porta a rotture a doppio filamento (DSB) nel DNA e a un RNA guida (gRNA) che indirizza la proteina Cas9 verso una posizione specifica dipendente dalla sequenza2. Le rotture a doppio filamento generate da CRISPR/Cas9 possono essere riparate tramite l'unione finale non omologa (NHEJ), un processo soggetto a errori che può portare a frameshift, o riparazione diretta omemologia quando è presente un modello di donatore. Il gRNA stesso è costituito da un RNA CRISPR (crRNA) specifico del bersaglio e da un crRNA transattivauniversale universale (tracrRNA) che può essere sintetizzato chimicamente e consegnato con nuclease Cas9 purificata come complesso di ribonucleoproteina (RNP)2,3. L'etichettatura fluorescente del gRNA o della nuclea leva di Cas9 può consentire il rilevamento e la visualizzazione intracellulare di componenti molecolari tramite microscopia fluorescente4.
Nel nostro lavoro attuale, approfittiamo del sistema CRISPR-Cas9 per ridurre i livelli proteici nel cervello delle api adulte. Abbiamo studiato il recettore del glutammato metabotropico (mGluR) e gli anticorpi recettorianti anti-mGlutR1 e la sottounità del recettore GABAA RDL e anticorpi anti-RDL. Abbiamo sviluppato un metodo semplice per ridurre la quantità di proteine nel cervello dell'ape adulta e l'abbiamo usata per guidare ulteriori test degli anticorpi sviluppati contro le proteine corrispondenti. Il monitoraggio della fluorescenza di CRISPR-Cas9 ci ha permesso di stimare le aree e le cellule coinvolte nella riduzione della proteina.
Utilizzando questo metodo, abbiamo anche caratterizzato gli anticorpi anti-mGlutR1 che sono stati fatti nei conigli contro il peptide coniugato. Il genoma delle api codifica un AmGluRA altamente conservato (chiamato mGlutR1 secondo la nomenclatura NCBI) il recettore del glutammato metabotropico5. Il gene honeybee mGlutR1 ha quattro varianti di giunzione previste secondo il database NCBI. È stato riferito che è espresso nel sistema nervoso centrale (CNS) di entrambi gli stadi pupali e adulti delle api ed è coinvolto nella formazione della memoria a lungo termine5. Gli anticorpi sviluppati contro mGlutR1 possono essere uno strumento essenziale per studiare il sistema glutamategico nel processo di apprendimento e memoria nelle api.
Nei nostri studi, abbiamo anche caratterizzato anticorpi anti-RDL sviluppati in conigli immunizzati con peptidi coniugati dalla sottounità recettore Apis mellifera RDL. Il gene delle api melfale Rdl, AmRdl (XM_006565102.3, database NCBI), ha 14 varianti di giunzione previste. Un frammento parzialmente clonato è stato segnalato nel database NCBI AF094822.1. La funzione del recettore RDL e la sua fisiologia è ben studiata negli insetti6,7,8, comprese le api9,10,11. Anticorpi sviluppati contro anti-RDL può essere uno strumento essenziale per studiare il sistema GABAergic nel processo di apprendimento e memoria nelle api.
Uno studio precedente sul ruolo dei recettori della poltopamina e della tiramina ha usato RNAi iniettato nel cervello con un successivo test della quantità di proteine da macchia occidentale12,13. Tuttavia, l'RNAi presenta alcune limitazioni significative. C'è solo un breve lasso di tempo dopo l'iniezione di RNAi all'interno della quale si verifica una riduzione della proteina13. CRISPR-Cas9 è stato utilizzato molto recentemente negli embrioni di api per cancellare o modificare i geni in tutto l'animale14,15,16. Abbiamo segnalato l'uso di CRISPR-Cas9 per ridurre la quantità di proteine nell'ape adulta. Abbiamo sviluppato questo approccio per le api a causa della capacità di accoppiarlo a studi comportamentali di apprendimento e memoria in condizioni di laboratorio controllate17.
Nel presente lavoro, abbiamo sviluppato anticorpi contro due recettori e li abbiamo testati sulle sezioni adulte del cervello delle api dopo che la proteina è stata ridotta con l'iniezione CRISPR-Cas9. Allo stesso tempo, abbiamo stabilito un progetto sperimentale che permette l'uso del metodo per esperimenti comportamentali.

<table><tbody><tr><td>Acido acetico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6283_100 mL</td><td>western blotting</td></tr><tr><td>Acrilammide-bis Acrilammide</td><td>Bio-Rad</td><td>500 mL 1610156</td><td>western blotting</td></tr><tr><td>Agarosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0169-250g</td><td>utilizzato con acqua distillata per fissare il cervello dell'ape mellifera in blocchi</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')2 Frammento Asino Anti-coniglio IgG (H+L)</td><td>Jackson Laboratori di ricerca</td><td>711-546-152</td><td>anticorpo secondario per rivelare gli anticorpi primari dal coniglio</td></tr><tr><td>Alt-R CRISPR-cas9 tracrRNA-5'ATTO</td><td>IDT</td><td>1075934</td><td>con RNA guida deinged, crea gRNA</td></tr><tr><td>Alt-R S.p. Cas9 nucleasi V3</td><td>IDT</td><td>1081058</td><td>enzima utilizzato per produrre ribonucleoproteina per il sistema CRISPR</td></tr><tr><td>Persolfato di ammonio</td><td>Bio-RAD</td><td>10 g 1610700</td><td>western blotting</td></tr><tr><td>Anticorpi anti-mGlutR1</td><td>Covalab (FRANCIA)/21st Century Biochemical</td><td>caratterizzato dagli autori nel presente articolo</td><td>Utilizzato per l'incubazione primaria di mGlut 1 nelle api mellifere Anticorpi</td></tr><tr><td>anti-RDL</td><td>21st Century Biochemical</td><td>caratterizzato dagli autori nel presente articolo</td><td>Utilizzato per l'incubazione primaria di RDL nelle api mellifere</td></tr><tr><td>Aprotinina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0001154</td><td>inibitore della proteasi</td></tr><tr><td>Forbici per iride Barraquer Lama da 7 mm Punta affilata</td><td>World Precision Instruments</td><td>14128-G</td><td>utilizzato per la dissezione cervello d'api</td></tr><tr><td>Benzamidina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>12072</td><td>inibitore della proteasi</td></tr><tr><td>Lama (frangibile) per il portalama</td><td>Fine Science Tool</td><td>10050-00</td><td>dissezione per western blotting</td></tr><tr><td>Supporto lama e demolitore</td><td>Fine Science Tool</td><td>15309</td><td>dissezione per western blotting</td></tr><tr><td>Capillari in vetro borosilicato</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100 F</td><td>per procedura iniettabile</td></tr><tr><td>Substrato di rilevamento di western blot chemiluminescente</td><td>Bio-Rad</td><td>1705062</td><td>western blotting</td></tr><tr><td>Cloroformio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>472476-50mL</td><td>Isolamento dell'RNA</td></tr><tr><td>Ditiotreitolo</td><td>Bio-Rad</td><td>1610611</td><td>western blotting</td></tr><tr><td>Kit facile per il DNA</td><td>QIAGEN</td><td>69504</td><td>Estrazione del DNAUJkit</td></tr><tr><td>senza DNA</td><td>INVITROGEN</td><td>AM1907</td><td>Utilizzato per rimuovere il DNA</td></tr><tr><td>Pipetta Eppendorf Research plus, confezione da 3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z683884</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 24 pozzetti Polistirene Multiwell</td><td>Falcon</td><td>351147</td> Capsule di inclusione a fondo piatto <td>multiwell</td></tr><tr>, microscopia elettronica<td>in polietilene</td><td> Science</td><td>70021</td><td>cestello per sezioni cerebrali</td></tr><tr><td>Pinze Dumont #5 (coppia)</td><td>Fine Science Tool</td><td>11254-20</td><td>per la dissezione del cervello delle api dalla testa</td></tr><tr><td>Pinze Dumont #5S (coppia)</td><td>Fine Science Tool</td><td>11252-00</td><td>per ripulire il cervello dalla trachea prima della dissezione</td></tr><tr><td>Gene Expression Master Mix</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>1055770</td><td>qPCR drop off assay</td></tr><tr><td>Glutaraldeide</td><td>EMS</td><td>16220</td><td>utilizzato per la preparazione di coniugati peptidici per il controllo del peassorbimento</td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516-500 mL</td><td>western blotting, terreno di inclusione</td></tr><tr><td>Glicina</td><td>Bio-Rad</td><td>1610718</td><td>western blotting</td></tr><tr><td>Rete di nylon filtrata idrofobica</td><td>Spectrum Labs</td><td>145910</td><td>per il fondo del cestello per sezioni cerebrali</td></tr><tr><td>Isopropilico alcol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9030-50mL</td><td>RNA isolamento</td></tr><tr><td>patella buco serratura emocianina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7017</td><td>utilizzato per la preparazione di coniugati per il</td></tr><tr><td>controllo LSM800 microscopio cofocale</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>mGlu_Guide 1</td><td>IDT</td><td></td><td>progettato RNA guida per CRISPR-Cas 9. Le sequenze del genoma mGlutR1</td></tr><tr><td>target mGlu_Guide 2</td> RNA guida progettato da <td>IDT</td><td></td><td>per CRISPR-Cas 9. Le sequenze del genoma mGlutR1</td></tr><tr><td>target mGlu_Guide 3</td> RNA guida progettati da <td>IDT</td><td></td><td>per CRISPR. Sequenze del genoma target mGlutR1</td></tr><tr><td>metanolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860</td><td>western blotting</td></tr><tr><td>Micropiastra PCR a 96 pozzetti</td><td>Biosistema applicato</td><td></td><td>Saggio di drop off qPCR 4346907 e micropiastra qRT-PCR</td></tr><tr><td>a 384 pozzetti</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z374911</td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>Olio minerale</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5904_500mL</td><td>per procedura iniettabile</td></tr><tr><td>Modello p87 Estrattore per micropipette marrone fiammante</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td></td><td>Preparazione capillare</td></tr><tr><td>Mowiol 4-88</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>81381</td><td>per soluzione di inclusione</td></tr><tr><td>Nanoliter 2000</td><td>World Precision Instruments Apparecchio</td> per <td>iniezione</td>di nanolitri <td></td></tr><tr><td>Siero d'asino normale</td><td>Jackson Research Laboratories</td><td>AB_2337258</td><td>agente bloccante per immunocitochimica</td></tr><tr><td>Siero di capra non immune</td><td>Invitrogen</td><td>50-062Z 100 mL</td><td>agente bloccante per l'immunoblotting</td></tr><tr><td>Tampone privo di nucleasi</td><td>IDT</td><td>1072570</td><td>Tampone privo di nucleasi utilizzato nella preparazione dell'iniezione di CRISPR-Cas9</td></tr><tr><td>Acqua priva di nucleasi</td><td>IDT</td><td>AM9337</td> acqua <td>priva di nucleasi utilizzata nella preparazione del sistema CRISPR-Cas 9</td></tr><tr><td>OrbitalShaker Mp4</td><td>Genemate</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127-500 g</td><td>utilizzato con PBS per fare fissativo per cervelli d'api</td></tr><tr><td>Fenilmetilsulfonile fluoruro (PMSF)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7626-250 mg</td><td>inibitore della proteasi</td></tr><tr><td>Tampone fosfato Soluzione salina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417-100TAB</td><td>Utilizzato con Paraformaldeide come fissativo; tampone per anticorpi</td></tr></tbody></table>

test anticorpale sui recettori anti-rdl e anti-mglutr1 nelle sezioni del cervello di honeybee utilizzando crispr-cas9

Anti-RDL and Anti-mGlutR1 Receptors Antibody Testing in Honeybee Brain Sections using CRISPR-Cas9

Cluster Regolarmente Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9) è una tecnica di editing genico ampiamente utilizzata negli studi sulla funzione genica. Usiamo questo metodo in questo studio per verificare la specificità degli anticorpi sviluppati contro l'insetto GABAA recettore Resistenza alla dieldrina (RDL) e un recettore del glutammato metabotropico mGlutR1 (mGluRA). Gli anticorpi sono stati generati nei conigli contro i peptidi coniugati specifici per i moscerini della frutta (Drosophila melanogaster) e alle api melappe (Apis mellifera). Abbiamo usato questi anticorpi nelle sezioni del cervello delle api per studiare la distribuzione dei recettori nel cervello delle api. Gli anticorpi sono stati purificati contro il peptide e testati con immunoblotting e il metodo classico di preadsorption con peptidi coniugato per dimostrare che gli anticorpi sono specifici per il corrispondente peptide coniugati contro cui sono stati sollevati. Qui abbiamo sviluppato la tecnica CRISPR-Cas9 per testare la riduzione dei bersagli proteici nel cervello 48 h dopo l'iniezione CRISPR-Cas9 con RNA guida progettati per il recettore corrispondente. Il metodo CRISPR-Cas9 può essere utilizzato anche nelle analisi comportamentali nelle api adulte quando uno o più geni devono essere modificati.

Test anticorpali anti-RDL Gli anticorpi sono stati prodotti contro il coniugato peptide RDL come mostrato nella Figura 1A. Il primo passo nella caratterizzazione degli anticorpi anti-RDL consiste nel controllare l'omogeneità della proteina estratta dal cervello delle api utilizzando una macchia occidentale con anticorpi anti-RDL e un anticorpo secondario IgG con etichetta su HRP(Figura 1A), inserto). Entrambi gli anticorpi anti-RDL riconobbero la banda situata a 50-60 kD (freccia), corrispondente al peso stimato delle proteine isoformi della sottounità RDL. Per dimostrare che gli anticorpi anti-RDL riconoscevano il peptide nelle fette cerebrali, abbiamo usato un controllo di preadsorption (Figura 1B,C). Quando gli anticorpi sono stati preincubati con peptidi coniugati, la colorazione sulla sezione era assente. Ciò ha dimostrato che gli anticorpi anti-RDL riconoscevano il peptide coniugato contro il quale venivano sollevati. Per dimostrare che gli anticorpi anti-RDL riconoscono la proteina nel tessuto cerebrale fisso, abbiamo usato CRISPR-Cas9 per eliminare il gene RDL che produce la proteina RDL nelle cellule. Figura 1D1-3, mostra le sezioni del cervello frontale di controllo che sono stati etichettati con anticorpi anti-RDL. Questa ape non è stata iniettata con RDL-CRISPR-Cas9 RNP. Nella figura 1D1, anti-RDL etichetta neuropils nella sezione frontale del cervello delle api. La stessa sezione frontale nella figura 1D2 mostra l'assenza di fluorescenza da ATTO550, perché il complesso RDL-CRISPR-Cas9 non è stato iniettato.
Figura 1E1-E3 Mostra una sezione del cervello da un'ape iniettata con RDL-CRISPR-Cas 9 e quindi elaborata con la stessa quantità di anticorpi del cervello di controllo nella figura 1D1-D3. La colorazione anti-RDL è stata significativamente ridotta in tutto il cervello 48 h dopo l'iniezione, e la distribuzione della colorazione ATTO550 nel cervello (Figura 1E2) mostra il successo delle iniezioni RDL-CRISPR-Cas 9 nell'ocelli mediano delle api. Le molteplici cellule sparse del cervello presentano ATTO550. La riuscita iniezione di RDL-CRISPR-Cas 9 ha ridotto l'espressione proteica rispetto al controllo (Figura 1E1-3). Da otto cervelli di api immunostained, solo un cervello aveva un alto livello di distribuzione del RDL-CRISPR-Cas9 nelle cellule del corpo dei funghi, del protocerebrum e del lobo antenne, mentre altri cervelli avevano una colorazione cellulare con ATTO550 nel calice del corpo dei funghi, complesso centrale, ma non del lobo delle antenne. È importante notare che in queste api, la riduzione anti-RDL immunostaining non era così drammatica come nel cervello mostrato Figura 1E1.
Successivamente, per stimare il livello del gDNA RDL modificato nelle api 48 h dopo l'iniezione RDL-CRISPR-Cas9, abbiamo eseguito un test di drop-off qPCR, in cui la sonda di drop-off è stata progettata per corrispondere all'area di uno dei gRNA RDL. In questi esperimenti, nel cervello delle api iniettato con RDL-CRISPR-Cas 9, la riduzione relativa della fluorescenza corrispondeva al numero del gDNA modificato nei campioni. Nei nostri test l'area corrispondente a questa guida in gDNA in 12 api iniettate con RDL-CRISPR-Cas9 erano 64 % (media 30 % SD) rispetto a gDNA in api non inonettate (Figura 3A).
Successivamente, per stimare il livello dell'RNA RDL nelle api 48 h dopo l'iniezione, abbiamo eseguito qRT-PCR in un gruppo separato di api (Figura 3B). Abbiamo confrontato il livello di RNA RDL di PSL-CRISPR-Cas 9 api iniettate (n - 19) con il livello di RNA nelle api che non sono state iniettate (n n : 12). In questi esperimenti, la relativa riduzione dell'mRNA RDL è stata del 59% (media del 15% SE) rispetto al livello di RNA nelle api non iniettate. Quando abbiamo esaminato il livello di RNA RDL in ogni ape individualmente, solo 13 api su 19 api hanno mostrato una significativa riduzione dell'RNA. Questi dati indicano che l'iniezione di RDL-CRISPR-Cas9 attraverso gli ocelli potrebbe non sempre raggiungere un gran numero di cellule cerebrali, che conferma i dati con RDL immuno-colorato RDL-CRISPR-Cas9 iniettato api. In questi preparati, solo un'ape su 8 aveva RDL CRISP-Cas9 in molte cellule cerebrali (corpo del fungo, protocerebrum e lobo antenne) rispetto ad altri cervelli delle api, dove la distribuzione del RDL-CRISPR-Cas9 era concentrata nelle cellule nel protocerebrum (calice del corpo del fungo e complesso centrale) ma non il lobo delle antenne (Figura 4A-D).
Test anticorpi anti-mGlutR1 Abbiamo usato gli anticorpi anti-mGlutR1 prodotti nel coniglio contro peptidi coniugati specifici della Drosophila melanogaster (Figura 2A). La sequenza di questo peptide mostra un'identità del 94% con il peptide apile (CLSDKTRFDYFARTVPPD) Figura 2A. In primo luogo, abbiamo controllato gli anticorpi contro la proteina cerebrale delle api usando l'immunoblotting. L'omogenea cerebrale delle api è stata separata dal 10% di SDS-PAGE e trasferita elettrofoeticamente da una membrana di nitrocellulosa e macchiata con anti-mGlutR1. L'inserto nella Figura 2A mostra due bande con pesi stimati (103 e 83 kD) corrispondenti a due isoformi. Quando abbiamo testato questo anticorpo sul cervello delle api, abbiamo scoperto che etichettano i profili e le cellule del neuropilar nelle sezioni del cervello delle api, come illustrato nella Figura 2B,D. Dopo la preadsorption dell'anticorpo anti-mGlutR1 con peptide coniugato-mGlutR1 , la colorazione specifica scomparve nella fetta del cervello delle api (Figura 2C). Ciò conferma che gli anticorpi anti-mGlutR1 riconoscono il peptide (Figura 2C). Successivamente, abbiamo iniettato un mix di mGlutR1-CRISPR-Cas9 nell'ocelli mediano e abbiamo usato il noguideRNA di controllo. Nelle api di controllo (n - 7), la fluorescenza da ATTO550 non era concentrata nelle cellule. Alcuni cervelli avevano manifestazione difluorescenza diffusa ATTO550 etichettatura. Così, la preparazione del controllo in Figura 2D1-3 Mostra colorazione anti-mGlutR1 nel cervello, ma non la fluorescenza ATTO550. Quando mGlutR1-CRISPR-Cas9 è stato iniettato negli ocelli e assorbito da molte cellule, il livello di fluorescenza degli anticorpi secondari è stato significativamente ridotto nell'area che riprende il mGlutR1RNP funzionale (Figura 2E1-3). Le api sono state monitorate per 48 h, e un'ape per ogni condizione sperimentale è stata trovata morta. Così, in questo esperimento, abbiamo controllato sette api di controllo e otto api CRISPR-Cas9. Tutte le api iniettate con CRISPR-Cas9 avevano cellule che prendevano mGlutR1-CRISPR-Cas9. La maggior parte di queste cellule erano nel calice del corpo del fungo, complesso centrale, e protocererem posteriore. Solo due api su sette hanno mostrato l'etichettatura ATTO550 in molte cellule nel corpo del fungo, complesso centrale, e il lobo delle antenne. Un esempio di una di queste api è illustrato nella Figura 2E. La riduzione del livello di colorazione mGlutR1 in questi preparati è stata significativa. Le altre cinque api hanno l'etichettatura ATTO550 corrispondente alla consegna di successo del mGlutR1 CRISPR-Cas9 nel corpo del fungo e nel protocerebrum posteriore, ma non nei lobi delle antenne.
Successivamente, per stimare il livello del mGlutR1 gDNA modificato nelle api 48 h dopo l'iniezione, abbiamo eseguito un test di drop-off basato su qPCR, in cui la sonda drop-off è stata progettata per trovarsi nell'area vicino alla guida mGlutR1. In questi esperimenti, nel cervello delle api iniettato con mGlutR1-CRISPR-Cas 9, la relativa modifica del gDNA in 12 api era del 59% (media 33 % SD) rispetto al gDNA nelle api non iniettate (Figura 3A).
Questi risultati sono stati confermati anche dai test qRT-PCR in un diverso gruppo di api, dove abbiamo stimato i livelli di RNA mGlutR1 utilizzando qRT-PCR nelle api 48 h dopo le iniezioni con RNPmGlutR1mix (Figura 3B). Abbiamo confrontato il livello di mGlutR1 RNA delle api iniettate mGlutR1-CRISPR-Cas9 (n - 6) con i livelli di RNA nelle api che non sono state iniettate (n . 6). In questi esperimenti, la riduzione relativa dell'mRNA mGlutR1 nelle api iniettate è stata del 53% (media 18% SE) rispetto alle api non iniettate (Figura 3B).
La sezione di quattro api diverse che ha espresso il RNP RDL-CRISPR-Cas9 nella cella Kenyon del corpo fungo è mostrato figura 4A-D. L'ape di esempio con fluorescenza ATTO550 nel corpo del fungo e il lobo dell'antenna è illustrato Nella Figura 4E, F.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Guide</td>
			<td>Sequenze</td>
			<td>gRNA</td>
			<td>Rnp</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>[guidaRNA:tracrRNA]</td>
			<td>[gRNA:Cas9 Nuclease]</td>
		</tr>
<tr>
<td>RDL_Guide1</td>
			<td>ACCGTAACGCGCCCCCGCT</td>
			<td>GRDL1</td>
			<td>RRDL1</td>
		</tr>
<tr>
<td>RDL_Guide2</td>
			<td>AACGTCGATCGACTTGACGT</td>
			<td>GRDL2</td>
			<td>RRDL2</td>
		</tr>
<tr>
<td>RDL_Guide3</td>
			<td>CCATGAGAAACACGTGCCCCCCCCC</td>
			<td>GRDL3</td>
			<td>RRDL3</td>
		</tr>
<tr>
<td>mGlu_Guide 1</td>
			<td>CGAAAGTTATCTCTGAGGTGT</td>
			<td>GMGL1</td>
			<td>RMGL1</td>
		</tr>
<tr>
<td>MGlu_Guide 2</td>
			<td>TTCAACGAGACAAGTTCAT</td>
			<td>GMGL2</td>
			<td>RMGL2</td>
		</tr>
<tr>
<td>mGlu_Guide 3</td>
			<td>GCAAACGTCGGTAGGAGTGA</td>
			<td>GMGL3</td>
			<td>RMGL3</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1: Sequenze nucleotide di guide progettate per RDL e mGlutR1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59993/59993fig1a.jpg"> Figura 1: Caratterizzazione degli anticorpi anti-RDL. (A) Schematico della sottounità RDL, dove i cerchi rosa indicano la localizzazione del peptide 2 (extracellulare CVNEKQSYFHIATTSNEFIRI-amide) nel N-terminus and peptide 1 (intracellulare CVRFKVHDPKAHSKGS-amide) nel termine C. L'inserto in A mostra le bande nella macchia occidentale di estratti cerebrali di api craniche elaborate con anticorpi anti-RDL corrispondenti (uno con pep1 anti-RDL e pep2 anti-RDL). Ogni immunoblot mostra la dimensione apparente della proteina 50-60 kD, corrispondente ai pesi stimati delle varie isoforme delle sottounità RDL. (B, C) Preadsorption degli anticorpi anti-RDL con peptide coniugato 1. L'immagine in C mostra una riduzione delle macchie nella sezione quando gli anticorpi sono stati preincubati con peptide coniugato 1. Il corpo a forma di ventaglio (Fb) e il corpo ellissoide (eb) sono strutture complesse centrali nel cervello. M - lobo mediale del corpo del fungo. (D1-3) Colorazione anti-RDL di un controllo, sezione del cervello di api non iniettato dopo 48 h. Verde indica il profilo positivo anti-RDL nel cervello. (D2) Questa ape non è stata iniettata e non contiene fluorescenza ATTO550. (D3) Immagini unite da D1 e D3. (E1-3) L'iniezione di RDL-CRISPR-Cas9 ha ridotto la colorazione anti-RDL dopo la fluorescenza di 48 h. (E2) nei nuclei cellulari ha indicato il successo della consegna RDL-CRISPR-Cas9. (E3) Immagine unita di anti-RDL (verde) e ATTO550 (rosso). Barra della scala: 100 m (B-E). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59993/59993fig1large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59993/59993fig2a.jpg"> Figura 2: Caratterizzazione degli anticorpi anti-mGlutR1. (A) Schematica di GCPR mGluR che mostra il peptide Drosophila melanogaster utilizzato per l'immunizzazione. Per confronto, il peptide Apis mellifera è mostrato di seguito. Il cerchio indica la localizzazione del peptide nel capoN del dominio extracellulare del recettore mGlutR1. L'inserto in A mostra che gli anticorpi anti-mGlutR1 riconoscevano due bande nella macchia occidentale dei cervelli delle api, 103 kD e 83 kD che corrispondono ai pesi stimati delle isoforme conosciute. (B, C) Controllo della preadsorbioni dell'anticorpo anti-mGlutR1 in due sezioni consecutive del lobo dell'antenna glomeruli. L'immagine dell'anti-mGlutR1 nella sezione glomeruli antenna in C mostra la riduzione della colorazione come risultato della preincubazione del peptide anti-mGlutR1 con l'anticorpo anti-mGlutR1. Questa procedura fa precipitare l'anticorpo fuori soluzione, che abolisce la colorazione rispetto a B (controllo, assenza del peptide nella preincubazione). (D1) mostra la colorazione dell'anti-mGlutR1 in una fetta di cervello delle api dopo un'iniezione di controllo nell'ocellus mediano. Questa iniezione mancava del gRNA mGlutR1 che consente il knock down dei recettori mGlutR1 da CRISPR-Cas9, e quindi la colorazione dell'anticorpo anti-mGlutR1 non è stata ridotta (verde). (D2) L'assenza di fluorescenza ATTO550 indica l'assenza di CRISPR-Cas9 funzionale nel cervello. (D3) Immagini unite di anti-mGlutR1 e ATTO550. (E1-E3) mostrano la colorazione di anti-mGlutR1 in una sezione cerebrale dove mGlutR1 è stato definitivamente abbattuto 48 h dopo l'iniezione con mGlutR1-CRISPR-Cas 9 nell'ocellus mediano. Così, la colorazione in questo cervello è notevolmente ridotta a causa del successo knockout del mGlutR1 in molte cellule. (E2) La colorazione ATTO550 in molti nuclei cellulari nel cervello delle api indica che l'iniezione di mGlut1-CRISPR-Cas 9 ha avuto successo. (E3) Immagine unita di ATTO550 (rosso) e anti-mGlutR1 (verde). Barra della scala: 10 m (B, C); 100 m (D,E). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59993/59993fig2large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59993/59993fig3.jpg"> Figura 3: Valutazione del gDNA modificato e espressione di mRNA di RDL e mGlutR1 mRNA nei cervelli delle api 48 h dopo l'iniezione con 345 nL del corrispondente RPN CRISPR-Cas9. (A) Il test di analisi di drop-off basato su qPCR per valutare la quantità di gDNA con un'area di modifica è stato calcolato utilizzando il metodo 2-ZCt e normalizzato contro il controllo, cervelli non iniettati. I dati sono espressi come media(B ) Il test TheqRT-PCR è stato utilizzato per valutare la quantità di mRNA nelle api iniettate e non iniettate CRISPR-Cas9. AmActin è stato usato come gene di riferimento. L'espressione genica relativa è stata calcolata utilizzando 2 metodidi z-zct e normalizzata contro il controllo, cervelli non iniettati. I dati sono espressi come media : SE. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59993/59993fig3large.jpg" target="_blank">Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59993/59993fig4a.jpg"> Figura 4: Esempio della distribuzione di RNP CRISPR-Cas9 nel cervello delle api tramite la fluorescenza ATTO550. (A-D) Le sezioni cerebrali di quattro api diverse che hanno espresso il RNP RDL-CRISPR-Cas9 nella cellula Kenyon del corpo del fungo. (E, F) Esempio di due cervelli 48 h dopo l'iniezione con RNPmGlutR1 CRISPR-Cas9. Barra della scala: 150 m (A-F). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59993/59993fig4large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Presentato qui è un protocollo per utilizzare il sistema CRISPR-Cas9 per ridurre la produzione di una proteina nel cervello delle api adulte per testare la specificità degli anticorpi.

Test anticorpale sui recettori anti-RDL e anti-mGlutR1 nelle sezioni del cervello di Honeybee utilizzando CRISPR-Cas9

Cluster Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9) is a gene editing technique widely used in studies of ...

Per la prima volta abbiamo stabilito una modifica dei geni codificati per gabaa ionotropico e recettori del glutammato metabotropico in sottoinsiemi di neuroni nel cervello adulto delle api melme. L'editing genico CRISPR-Cas9 può essere utilizzato per modificare uno o più geni nel cervello delle ape adulte per esplorare i loro ruoli nell'apprendimento e nella memoria in condizioni di laboratorio controllate. Questo metodo può essere utilizzato per studiare la funzione di proteine specifiche nelle api adulte, nonché per testare la specificità degli anticorpi contro le loro proteine corrispondenti.A dimostrare la procedura con Irina Sinakevitch saranno Lev Kurtzman e Hyun Choi, ex studenti universitari del mio laboratorio. Per testare l'espressione di RDL e mGlutR1 mediante analisi immunocitochimica dopo l'iniezione CRISPR-Cas9, in primo luogo, utilizzare uno strumento CRISPR-Cas9 online per progettare le guide utilizzando la sequenza di DNA guida di api mellifera, RDL e mGlutR1. Per preparare formazioni complesse di RNA guida per ogni RNA guida, etichettare una provetta per ogni guida con il nome dell'RNA guida e aggiungere 92 microlitri di tampone privo di nucleotidi, quattro microlitri di fluoroforo micromolare, RNA CRISPR transattivato etichettato e quattro microlitri dell'appropriata soluzione di RNA guida per ogni tubo.Una volta aggiunti tutti i materiali, mescolare delicatamente le soluzioni e ruotare il contenuto del tubo in una centrifuga da banco per cinque secondi per sedimentare la soluzione. Quindi, mantenere le soluzioni a 95 gradi Celsius per cinque minuti per creare un complesso di RNA guida seguito da un raffreddamento di 10 minuti a temperatura ambiente. Per preparare le formazioni complesse di ribonucleoproteina aggiungere sei microlitri di ciascuna soluzione di RNA guida e sei microlitri di 0,5 microgrammi per microlitro SP-Cas9 nucleasi V3 ai tubi opportunamente etichettati.Dopo una miscelazione delicata, incubare le soluzioni a 37 gradi Celsius per 10 minuti Per fare miscele di ribonucleoproteina RNP per iniezione, al termine dell'incubazione aggiungere quattro microlitri di ogni ribonucleoproteina all'RDL appropriato. Per effettuare un controllo, la soluzione di RNA senza guida mescola quattro microlitri di RNA tracciante con 92 microlitri di tampone e quattro microlitri di acqua. Dopo l'aggiunta di acqua, mantenere la soluzione per cinque minuti a 95 gradi Celsius e lasciare raffreddare la miscela fino a raggiungere la temperatura ambiente.Quindi, mescolare sei microlitri della soluzione di RNA senza guida con sei microlitri da 0,5 microgrammi per microlitro Cas9 nucleasi V3. Per l'iniezione di miscela di ribonucleoproteina, dopo aver catturato singole api in fiale con un piccolo foro nei tappi, immobilizzare le api per non più di tre minuti sul ghiaccio e fissare ogni ape in supporti metallici precedentemente preparati con nastro adesivo. Con il torace posteriore, le ali e la testa esposte. Utilizzare una siringa da cinque millilitri per nutrire le api con una soluzione di saccarosio molare fino a quando non hanno più fame e posizionare le api protette in una scatola con un tovagliolo di carta bagnato per l'umidità.Quindi, posizionare la cera all'interno dei coperchi di due piastre di Petri da 35 millilitri e posizionare i fondi dei piatti sulla cera. Iniettare un saccarosio molare tra il coperchio e il fondo di ogni piatto e posizionare una piastra di petri alimentazione in una scatola bianca con uno scivolo di vetro e posizionare l'altra in una scatola nera con uno scivolo di vetro. Quindi, posizionare un piccolo pettine in ogni scatola e caricare un sistema di microiniezione con la miscela RDL CRISPR-Cas9.Per l'iniezione DI RDL CRISPR-Cas9, iniettare gli ocelli mediani di otto api con 345 nanolitri di mix RDL di ribonucleoproteina seguito dall'alimentazione con un saccarosio molare prima di rilasciare le api nella scatola sperimentale nera. Alimentare un secondo set di otto api come controlli senza iniezioni e rilasciarle nella scatola di controllo bianca. Quindi, posizionare entrambe le scatole in un contenitore di polistirolo con carta bagnata, osservando le api due volte al giorno per assicurarsi che abbiano abbastanza cibo e una buona umidità.48 ore dopo l'iniezione, immobilizzare le api sul ghiaccio per 30 secondi e utilizzare le forbici per decapitare ogni insetto. Posizionare le teste in paraformaldeide AL PBS al microscopio sezionato in una cappa aspirante e utilizzare forbici per iris barraquer per rimuovere con attenzione ma rapidamente le antenne, gli occhi composti e l'esoscheletro superiore. Lasciare riposare le teste nella soluzione fissante per 10 minuti prima di rimuovere il resto dello scheletro di eso dalla testa e tutta la trachea rimanente.Quindi, posizionare ogni cervello in un tubo di microcentrifugo da 1,5 millilitri contenente almeno un millilitro di paraformaldeide durante la notte a quattro-otto gradi Celsius. La mattina successiva, aggiungere 3,8 grammi di argrose a 50 millilitri di acqua distillata in un pallone erlenmeyer e microonde la soluzione fino a quando l'argrose liquirifica. Trasferire da tre a quattro cervelli di api da miele fissi in una nuova piastra di Petri da 35 millimetri e utilizzare carta velina per rimuovere l'eccesso fissativo.Versare con cura l'argrose liquido sul cervello e orientare i campioni all'interno dell'argrose in modo che i lobi delle antenne siano rivolti verso l'alto. Dopo che l'argrose si è solidificato, utilizzare un bisturi per tagliare singoli blocchi di argrose contenenti un singolo cervello e riempire ogni pozzo di una piastra da 24 po 'caricata con un cesto con fondo a rete idrofobica e 600 microlitri di PBS per pozzo. Quindi, usa un vibratomo per acquisire sezioni trasversali di 70 micrometri del tessuto cerebrale da ogni blocco di argrose.Posizionando le sezioni da un singolo cervello sulla rete dello stesso cesto man mano che vengono acquisite. Dopo aver etichettato le sezioni con anticorpi coniugati al fluoroforo, secondo i protocolli standard, incorporare ogni diapositiva con sezioni di un singolo cervello utilizzando una goccia di mezzo di montaggio e visualizzare i campioni mediante microscopia a fluorescenza. L'anti-RDL etichetta i neuropils nella sezione frontale del cervello delle ape knockout CRISPR-Cas9 RDL.Una specificità simile è stata osservata per gli anticorpi anti-mGlutR1. In questi test di consegna PCR rappresentativi e quantitativi nel cervello delle api iniettati con RDL CRIPSR-Cas9, la riduzione relativa della fluorescenza corrispondeva al numero del DNA guida modificato nel campione. Dopo l'iniezione di mGlutR1 CRISPR-Cas9, la relativa modifica del DNA guida è stata di circa il 59% nel cervello delle api iniettate rispetto al DNA guida osservato nel cervello delle api non iniettate.In questo rt-PCR quantitativo in un gruppo separato di api la riduzione relativa dell'RNA messaggero RDL era di circa il 59% rispetto al livello di RNA nelle api non iniettate, e la riduzione relativa dell'RNA messaggero mGlutR1 nelle api iniettate era di circa il 53%In particolare, l'iniezione di RDL CRISPR-Cas9 attraverso gli ocelli potrebbe non sempre raggiungere un gran numero di cellule cerebrali. Ad esempio, in questi preparati solo uno su otto aveva RDL CRISPR-Cas9 in un gran numero di cellule cerebrali rispetto ad altri cervelli delle ape. Con l'RDL CRISPR-Cas9 concentrato all'interno delle cellule del protocerebrum, ma non il lobo antennale.Assicurati di evitare l'RNA congelato e rifozen. Fai attenzione a non raffreddamento eccessivamente le api. Sfruttali immediatamente una volta che l'arresto si muove nel flaconcino.Questa tecnica può essere utilizzata per studiare gli effetti della riduzione dei recettori ionotropici e metabotropici inibitori nel corpo dei funghi e nel complesso centrale sul comportamento delle api melisce.

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In questo protocollo, si descrive due strategie che sopprimono contemporaneamente due geni (doppia knockdown gene) di api mellifere. Poi ci presentiamo come usare la risposta estensione proboscide (PER) test per studiare l'effetto di doppio knockdown gene sul miele d'api percezione gustativa.

RNAi mediato doppia Gene atterramento e gustative Percezione misura di api mellifere (<em&gt; Apis mellifera</em&gt;)

Nel corso degli ultimi anni, saggi cellulari vivi sono stati utilizzati con successo per rilevare gli anticorpi contro gli antigeni di superficie e conformazionale. Qui, descriviamo un metodo con elevate throughput citometria consentire l'analisi di grandi coorti di pazienti. Individuazione di anticorpi romanzo migliorare la diagnosi e il trattamento di disturbi immuno-mediata.

High-throughput Citometria a Flusso test cellulare per individuare gli anticorpi per N-metil-D-aspartato Receptor o dopamina-2 recettore nel siero umano

L'ibridazione in situ dell'RNA (ISH) consente la visualizzazione degli RNA nelle cellule e nei tessuti. Qui mostriamo come la combinazione di RNAscope ISH con immunoistochimica o coloranti istologici possa essere utilizzata con successo per rilevare mRNA localizzati negli assoni in sezioni di cervelli di topo e umani.

Rilevazione di assoni localizzato mRNA nelle sezioni del cervello Utilizzando ad alta risoluzione<em&gt; In Situ</em&gt; Ibridazione

Il sistema / Cas9 CRISPR offre il potenziale per fare l'editing genoma mirato accessibile e conveniente per la comunità scientifica. Questo protocollo ha lo scopo di dimostrare come creare virus che sarà ad eliminazione diretta di un gene di interesse utilizzando il sistema / Cas9 CRISPR, e poi iniettare stereotassica nel cervello di topo adulto.

Progettazione, Packaging, e consegna di alto titolo CRISPR Retro e lentivirus via Stereotassica iniezione

Questo manoscritto descrive diversi protocolli per la somministrazione di agenti farmacologici alle api, tra cui semplici metodi non invasivi per le api in volo libero, così come le varianti più invasive che consentono preciso trattamento localizzato delle api trattenuti.

Manipolazione neurofarmacologico di sobrio e-volo libero api mellifere,<em&gt; Apis mellifera</em

Questo articolo descrive un protocollo dettagliato e altamente efficace di ibridazione in RNA in situ , in particolare per i geni espressi a basso livello del recettore dell'Odorant (OR), così come altri geni, nelle antenne degli insetti utilizzando digoxigenina (DIG) o sonde con biotina.

Localizzazione dei geni del recettore degli odoranti nell&#39;antenna di Locust da RNA<em&gt; In Situ</em&gt; Ibridazione

Per verificare gli effetti inibitori di agenti farmacologici sulla fosfolipasi C (PLC) in diverse regioni del cervello dell'ape mellifica, presentiamo un'analisi biochimica per misurare l'attività del PLC in quelle regioni. Questo test potrebbe essere utile per confrontare attività PLC tra tessuti, così come tra le API che esibiscono comportamenti diversi.

Rilevamento di attività della fosfolipasi C in omogeneato del cervello dall'ape

Molte caratteristiche dell'eusocialità degli insetti si basano sulla comunicazione all'interno della colonia e sulla divisione del lavoro. La manipolazione genetica dei geni regolatori chiave negli embrioni di formiche tramite microiniezione e mutagenesi mediata da CRISPR fornisce informazioni sulla natura del comportamento altruistico negli insetti eusociali.

Iniezioni di embrioni per mutagenesi mediata da CRISPR nel saltatore di Ant Harpegnathos

Qui è presentato un protocollo di microiniezione embrionale Helicoverpa armigera (Hübner) e identificazione di mutanti knockout creati dall'editing del genoma CRISPR / Cas9. Gli insetti mutanti consentono ulteriori ricerche sulla funzione genica e sull'interazione tra diversi geni in vivo.

Microiniezione embrionale e identificazione di mutanti knockout di Helicoverpa Armigera (Hübner) modificata dal genoma CRISPR/Cas9

Abbiamo messo a punto un saggio di ibridazione in situ Duplex per mappare le isoforme del recettore dell'insulina IR-A e IR-B nel plesso coroideo murino, superando i limiti dei metodi tradizionali. Questo approccio ad alta risoluzione rivela l'espressione specifica dell'isoforma, offrendo nuove intuizioni sulla segnalazione dell'insulina cerebrale e sulle potenziali terapie mirate all'isoforma per i disturbi neurologici.

Visualizzazione precisa dei recettori dell'insulina A e B nel cervello murino con un test di ibridazione in situ dell'RNA

Qui, descriviamo una procedura semplice e rapida per rilevare il DNA da agenti patogeni delle api, come Lotmaria passim e Nosema ceranae, utilizzando una lisi cellulare pronta per l'amplificazione, l'amplificazione della polimerasi ricombinasi e i saggi CRISPR/Cas12a.

Rilevamento del DNA in loco di parassiti tripanosomatidi e nosema ceranae attraverso lisi alcalina accoppiata al sistema RPA/CRISPR/Cas12a

Scopri come modificare i recettori GABAA e glutammatergici nel cervello dell'ape adulta con CRISPR-Cas9 per studiare apprendimento e memoria. Questo metodo consente di testare la specificità degli anticorpi in immunocitochimica.

Test anticorpale sui recettori anti-RDL e anti-mGlutR1 nelle sezioni del cervello di Honeybee utilizzando CRISPR-Cas9

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