Name: Cancellazione ottica e imaging del tessuto renale immunoetichettato (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 18 s
Description: Scopri la cancellazione ottica e l'imaging confocale per l'analisi tridimensionale del tessuto renale immunoetichettato. Questo metodo semplice e accessibile consente la visualizzazione e la quantificazione di strutture cellulari complesse.

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T. S. è sostenuto da sovvenzioni della DFG German Research Foundation (332853055), else Kraner-Fresenius-Stiftung (2015_A197) e della Facoltà di Medicina del RWTH Aachen (RWTH Returner Program). V. G. P. è supportato da borse di ricerca da Deutsche Gesellschaft pellicco Nephrologie, la Alexander von Humboldt Foundation, e il National Health and Medical Research Council dell'Australia. D. H. E è supportato da Fondation LeDucq. R. K. è supportato da sovvenzioni del DFG (KR-4073/3-1, SCHN1188/5-1, SFB/TRR57, SFB/TRR219), dello Stato di Northrhinewestfalia (MIWF-NRW) e del Centro interdisciplinare di ricerca clinica presso la RWTH Aachen University (O3-11).

NOT:</</c0> Tutte le procedure sperimentali qui descritte sono state approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell'Oregon Health and Science University di Portland, Oregon, USA e dalle autorità locali competenti di Aquisto, in Germania.
1. Retrogrado Perfusione aortica addominale e fissazione dei reni del topo
<ol><li>Preparare le soluzioni lo stesso giorno o sera prima e conservare in frigorifero durante la notte. Soluzioni calde alla temperatura ambiente (RT) prima dell'uso.</li>
	<li>
Fare un lotto fresco di 3% paraformaldeide (PFA) in 1x salina tampone fosfato (PBS). Sono necessari circa 50-100 mL PFA per mouse.
	<ol>
<li>Per fare 1 L del 3% PFA: Pesare 30 g di PFA e aggiungere 800 mL di acqua distillata nella cappa del fuma. Mescolare e riscaldare a 50-60 gradi centigradi. Non riscaldare al di sopra di 70 gradi centigradi. AVVISO: il PFA è tossico. Preparare l'APE nella cofano dei fumi.</li>
		<li>Aggiungere lentamente diverse gocce di 2N NaOH. Attendere qualche minuto fino a quando PFA entra nella soluzione o aggiungere qualche goccia in più. Alcuni piccoli pezzi non si dissolveranno.</li>
		<li>Togliere la soluzione dal fuoco. Aggiungere 50 mL di 20x PBS. Rilassare sul ghiaccio a RT.</li>
		<li>Regolare il pH a 7,3-7,4 con HCl. Aggiungere acqua distillata a 1 L.</li>
		<li>Rimuovere le particelle non dissolte filtrando 1x PBS e 3% PFA con filtro 0,22 m.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aggiungere 1.000 unità di Eparin a 1 L di 1x PBS. Trasferire 1x PBS contenente eparina e 3% PFA in 1x PBS in siringhe di plastica da 50 mL separate. NOT:</</c2> Se disponibile, pompa a pressione controllata impostata a 80-100 mmHg o pressione idrostatica (metodo a goccia, l'altezza delle soluzioni di perfusione: 160-200 cm sopra l'animale) può essere utilizzato per la perfusione renale.</li>
	<li>Collegare il PBS, PFA e un ago a farfalla 21 G smussato a un stopcock a tre vie. Assicurarsi che non ci siano bolle d'aria nell'intero sistema.</li>
	<li>Etichettare un tubo conico da 15 mL e dispensare 10 mL di PFA.</li>
	<li>Anestesizzare profondamente un topo C57BL/6 maschio o femmina 12-24 settimane di età utilizzando 120 mg/kg di peso corporeo ketamina e 16 mg/kg di peso corporeo xylazina. L'animale deve essere controllato per la completa assenza di reattività pizzicando i riflessi prima di procedere alla chirurgia (ad esempio, riflesso pizzico di dita dei pipista).</li>
	<li>Una volta che l'animale ha raggiunto un piano chirurgico di anestesia, posizionarlo sulla schiena sotto il microscopio dissetante. Aprire chirurgicamente l'addome con un'incisione addominale mediana utilizzando una forbice operativa ed esporre l'aorta addominale.</li>
	<li>Stringere l'aorta addominale proprio sopra la ramificazione all'arteria iliaca con un emotoma curvo. Quindi bloccare l'aorta addominale proprio sotto le arterie renali con un micro serrefine. Fare una piccola incisione (1 mm) sull'aorta addominale tra i due morsetti con forbici vannas. Inserire lentamente l'ago della farfalla nell'incisione e fare attenzione a non strappare l'aorta addominale aperta.</li>
	<li>Ligate l'arteria renale giusta con una sutura di seta 5-0 e rimuovete il rene destro per altre analisi se è necessario un solo rene per la perfusione e la fissazione.</li>
	<li>Rimuovere il micro serrefine, transetto la vena del portale con le forbici vannas, e profumare immediatamente con 50 mL di PBS contenente eparina, quindi passare e perfondere con 50 mL di 3% PFA. NOT:</</c3> L'alta pressione perfusione attraverso l'aorta addominale è necessaria per aprire tubuli renali per una migliore diffusione degli anticorpi attraverso il tessuto. La perfusione nel cuore non può aprire tubuli renali.</li>
	<li>Raccogliere il rene perfuso con attenzione ed evitare di forare o spremere il tessuto.</li>
	<li>Rimuovere la capsula e tagliare il rene in fette coronali spesse 1 mm. Utilizzare una matricedifiltro dei dati ( Tabella dei materiali ) per standardizzare lo spessore della sezione. NOT:</</c5> In alternativa, prendere in considerazione l'utilizzo di un vibratome.</li>
	<li>Immergere le fette renali con il PFA preparato nel tubo conico da 15 mL etichettato.</li>
	<li>Distribuisci 10 mL di PFA a un altro tubo conico da 15 mL etichettato. Sciacquare l'ago a tre vie e l'ago delle farfalle con PBS prima di passare al mouse successivo.</li>
	<li>Effettuare post-fissaggio durante la notte presso RT protetti dalla luce.</li>
</ol>2. Preparazione dei tessuti e immunostaining
<ol><li>Dopo la post-fissazione, lavare la fetta renale due volte con 1x tampone di lavaggio (Tabella dei materiali) per 1 h su un rocker orizzontale a RT.</li>
	<li>Eseguire il recupero dell'antigene. Riscaldare 300 mL di 1x soluzione di smascheramento antigene (Tin grado dimateriali) in un becher da 500 mL a 92-98 gradi centigradi. Racchiudere la fetta in cassetta di incorporamento permeabile al cuscinetto riscaldato con agitazione per 1 h a 92-98 gradi centigradi. Togliere il becher dal fuoco e lasciarlo raffreddare a RT. NOT:</</c2> Alcuni fornitori testano i loro anticorpi per l'applicazione dell'immunoistochimica e includeranno un metodo di recupero dell'antigene suggerito nella scheda tecnica. Pertanto, alcuni epitopi potrebbero richiedere un buffer più semplice (ad esempio, pH 9).</li>
	<li>Trasferire la fetta in 10 mL di 1x buffer di lavaggio con 0.1% Triton X-100 e rock durante la notte a RT. Lavare le fette 2x con 10 mL di tampone di lavaggio 1x fresco per 1 h il giorno successivo.</li>
	<li>Diluire l'anticorpo primario in 500 -L di normale diluente anticorpo (Tabella dei materiali). Iniziare con una concentrazione di 1:50-1:100. Afmasse delicatamente la fetta renale in anticorpi primari diluiti per 4 d a 37 gradi centigradi. NOT:</</c4> Poiché ogni anticorpo ha proprietà uniche, la temperatura durante l'incubazione degli anticorpi e le diluizioni degli anticorpi devono essere ottimizzate per le singole sonde. Per i controlli secondari solo anticorpi, incubare il tessuto renale in diluente senza anticorpo primario. Invece di diluente anticorpo commerciale, 1x PBS con 0.1% Triton X-100 e 0.01% azide di sodio può essere utilizzato.</li>
	<li>Lavare la fetta renale in 10 mL di 1x lavaggio durante la notte a RT con un cambio di tampone di lavaggio dopo 8 h.</li>
	<li>Diluire gli anticorpi secondari (ad esempio, 1:100 per gli anticorpi secondari coniugati ad Alexa Fluor) in 500 - L di normale diluente anticorpo. Incubare le fette di rene in anticorpi secondari diluiti per 4 giorni a 37 gradi centigradi. Da questo passo in poi, proteggere le fette di rene dalla luce.</li>
	<li>Lavare le fette di rene in 10 mL di 1x lavare il buffer durante la notte a RT con un cambio di buffer di lavaggio dopo 8 h.</li>
</ol>3. Cancellazione dei tessuti
<ol><li>Trasferire la fetta renale a 5 mL di alto grado 100% etanolo (Tabella dei materiali) per 2 h a RT con dondolo delicato (con un passaggio all'etanolo fresco dopo 1 h). Questo passo è per la disidratazione dei tessuti. NOT:</</c1> L'etanolo di alto grado è necessario per ottenere un'elevata traslucenza tissutale nella fase successiva. Metanolo o tetraidrofuran sono reagenti di disidratazione alternativi con alto potenziale di delipidazione.</li>
	<li>Immergere la fetta renale in 2 mL di ECi (Tabella dei Materiali) con dondolo delicato a RT (con un cambio di ECi fresco dopo 2 h) durante la notte. NOT:</</c3> Il punto di congelamento/fusione dell'ECi è di 6-8 gradi centigradi. Pertanto, non conservare i campioni in frigorifero. Condurre l'immersione in una cappa di fumi correttamente ventilata ed evitare il contatto diretto con i vestiti e la pelle (ECi è un composto non tossico approvato dalla Food and Drug Administration ma ha un forte odore). Utilizzare tubi Eppendorf regolari o recipienti di vetro (nessun recipiente in polistirolo).</li>
	<li>La traslucenza dei tessuti può essere raggiunta dopo l'immersione ECi e quando le fette di rene sono pronte per l'imaging.</li>
</ol>4. ConfocalImaging e analisi delle immagini
 NOT:</</c0> Per l'imaging, altre tecniche di microscopia possono essere utilizzate finché la soluzione di corrispondenza dell'indice di rifrazione è compatibile con l'obiettivo. Questo protocollo utilizza un microscopio confocale invertito.
<ol><li>Aggiungete 600-1.000 l di ECi nella teglia di fondo in vetro (Tabella dei materiali). NOT:</</c1> Evitare l'uso di piatti di coltura cellulare regolari, perché ECi è un solvente organico che dissolverà i piatti di plastica. Allo stesso modo, ECi potrebbe attaccare parti in plastica / anelli di isolamento su lenti obiettive. Fare riferimento alle relazioni appropriate per una panoramica dei piatti di imaging compatibili30 e delle camere stampate 3D 3D28.</li>
	<li>Trasferire la fetta renale traslucida nel piatto. Posizionare un coperchio rotondo sulla fetta renale per applicare una leggera pressione verso il fondo di vetro. Sigillare il piatto con pellicola di paraffina (Tabella dei materiali) per evitare perdite di ECi. NOT:</</c5> Organi interi o fette di tessuto spesse più millimetri possono richiedere un bordo (cemento dentale o elastomero in silicone; vedi Tabella dei materiali) intorno al tessuto per creare un eCi-pool per il campione.</li>
	<li>Posizionare il piatto sulla piattaforma di imaging al microscopio.</li>
	<li>Prendere diversi z-stack ed eseguire cuciture. Iniziare con una dimensione z-step di 5 m. NOT:</</c7> Considerare l'utilizzo di obiettivi a lunga distanza di lavoro (>5 mm) e ad alta apertura numerica (>0,9) per l'imaging di fette o organi di tessuto molto spessi. Dopo l'imaging, trasferire il tessuto nell'etanolo e conservarlo in tampone o PBS con azide di sodio dello 0,02%.</li>
	<li>Analizzare l'immagine utilizzando il rendering 3D con il software (Table of Materials).</li>
</ol>

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<li>Zhai, X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3-D+reconstruction+of+the+mouse+nephron%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">3-D reconstruction of the mouse nephron.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 17 (1), 77-88 (2006).</li>
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<li>Kuwajima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ClearT%3A+a+detergent-+and+solvent-free+clearing+method+for+neuronal+and+non-neuronal+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue.</a> Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).</li>
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<li>Lee, E., Sun, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ACT-PRESTO%3A+Biological+Tissue+Clearing+and+Immunolabeling+Methods+for+Volume+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">ACT-PRESTO: Biological Tissue Clearing and Immunolabeling Methods for Volume Imaging.</a> Journal of Visualized Experiments. (118), (2016).</li>
<li>Klingberg, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fully+Automated+Evaluation+of+Total+Glomerular+Number+and+Capillary+Tuft+Size+in+Nephritic+Kidneys+Using+Lightsheet+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Fully Automated Evaluation of Total Glomerular Number and Capillary Tuft Size in Nephritic Kidneys Using Lightsheet Microscopy.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 28 (2), 452-459 (2017).</li>
<li>Dodt, H. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultramicroscopy%3A+3-D+visualization+of+neuronal+networks+in+the+whole+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Ultramicroscopy: 3-D visualization of neuronal networks in the whole mouse brain.</a> Nature Methods. 4 (4), 331-336 (2007).</li>
<li>Erturk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3-D+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3-DISCO%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">3-D imaging of solvent-cleared organs using 3-DISCO.</a> Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).</li>
<li>Becker, K., Jahrling, N., Saghafi, S., Weiler, R., Dodt, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+clearing+and+dehydration+of+GFP+expressing+mouse+brains%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Chemical clearing and dehydration of GFP expressing mouse brains.</a> PloS One. 7 (3), e33916(2012).</li>
<li>Renier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iDISCO%3A+a+simple%2C+rapid+method+to+immunolabel+large+tissue+samples+for+volume+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging.</a> Cell. 159 (4), 896-910 (2014).</li>
<li>Pan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shrinkage-mediated+imaging+of+entire+organs+and+organisms+using+uDISCO%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO.</a> Nature Methods. 13 (10), 859-867 (2016).</li>
<li>Schwarz, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent-protein+stabilization+and+high-resolution+imaging+of+cleared%2C+intact+mouse+brains%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Fluorescent-protein stabilization and high-resolution imaging of cleared, intact mouse brains.</a> PLoS ONE. 10 (5), e0124650(2015).</li>
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<li>Matryba, P., Bozycki, L., Pawlowska, M., Kaczmarek, L., Stefaniuk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+perfusion-based+CUBIC+protocol+for+the+efficient+whole-body+clearing+and+imaging+of+rat+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biophotonics%22%5BJournal%5D)">Optimized perfusion-based CUBIC protocol for the efficient whole-body clearing and imaging of rat organs.</a> Journal of Biophotonics. 11 (5), e201700248(2018).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Le tecniche di compensazione ottica hanno ricevuto un'ampia attenzione per la visualizzazione 3D e la quantificazione della microanatomia in vari organi. In questo caso, il metodo di compensazione basato su solventi (ECi) è stato combinato con l'immunolabeling per l'imaging 3D di tubuli interi in fette di rene. Questo metodo è semplice, economico e veloce. Tuttavia, altre domande di ricerca possono essere meglio risolte con altri protocolli di compensazione5. È anche importante tenere a mente che ...

Il crescente interesse nello studio di interi organi o di grandi strutture multicellulari ha portato allo sviluppo di metodi di compensazione ottica che coinvolgono l'imaging di tessuto trasparente in tre dimensioni. Fino a poco tempo fa, i metodi migliori per stimare il numero di cellule, la lunghezza o il volume di intere strutture sono stati la stereologia o il sezionamento seriale esaustivo, che si basa sul campionamento sistemico del tessuto per l'analisi successiva in due dimensioni1, 2 Il nome del sistema , 3. Tuttavia, questi metodi richiedono molto tempo e necessitano di un elevato livello di formazione e competenza4. I metodi ottici di compensazione superano questi problemi bilanciando l'indice di rifrazione in tutto un campione per rendere il tessuto traslucido per l'imaging 3D5,6,7.
Sono stati sviluppati diversi metodi di compensazione ottica che rientrano in due categorie principali: metodi basati su solventi e acquosi. I metodi basati su aqueous possono essere ulteriormente suddivisi in semplice immersione8,9, iperidratazione10,11e idrogel incorporando12,13. I metodi a base di solvente disidratano il tessuto, rimuovono i lipidi e normalizzano l'indice di rifrazione a un valore intorno a 1,55. Limitazioni della maggior parte dei metodi a base di solventi sono la dorching della fluorescenza endogena di proteine reporter comunemente usate come GFP, tossicità dei solventi, capacità di sciogliere le colle utilizzate in alcune camere di imaging o lenti oggettive, e il restringimento dei tessuti durante disidratazione14,15,16,17,18,19,20,21. Tuttavia, i metodi basati sui solventi sono semplici, efficienti in termini di tempo e possono funzionare in diversi tipi di tessuto.
I metodi basati su aqueous si basano sull'immersione del tessuto in soluzioni acquose che hanno indici di rifrazione nell'intervallo di 1.38-1.528,11,12,22,23,24 . Questi metodi sono stati sviluppati per preservare l'emissione di proteine endogeniche di reporter fluorescenti e prevenire il restringimento indotto dalla disidratazione, ma i limiti della maggior parte dei metodi di compensazione basati su acquosi includono una durata più lunga del protocollo, l'espansione dei tessuti e modificazione delle proteine (cioè denaturazione parziale delle proteine mediante urea in protocolli iperidratanti come ScaleA2)7,11,23,25. ScaleS ha affrontato l'espansione dei tessuti combinando l'urea con il sorbitolo, che controbilancia per disidratazione l'espansione dei tessuti indotta dall'urea, e ha conservato l'ultrastruttura dei tessuti valutata dalla microscopia elettronica10. Il restringimento o l'espansione dei tessuti influisce sulle dimensioni assolute delle strutture, sulle distanze tra gli oggetti o sulla densità delle cellule per volume; pertanto, la misurazione delle dimensioni cambia al momento della compensazione del tessuto può aiutare a interpretare i risultati ottenuti7,26.
In generale, un protocollo per la compensazione ottica è costituito da più passaggi, tra cui pretrattamento, permeabilizzazione, immunolabeling (se necessario), corrispondenza dell'indice di rifrazione e imaging con microscopia luminosa avanzata (ad esempio, a due fotone, confocali o microscopia a fluorescenza del foglio luminoso). La maggior parte degli approcci di compensazione sono stati sviluppati per visualizzare il tessuto neuronale, e studi emergenti hanno convalidato la loro applicazione in altri organi5. Questo strumento completo è stato dimostrato in precedenza per consentire un'analisi affidabile ed efficiente delle strutture renali, tra cui glomeruli27,28, infiltrati immunitari28, vascolatura28e segmenti di tubulo 29, ed è un approccio ideale per migliorare la comprensione della funzione glomerare e del rimodellamento del tubulo in salute e malattia.
Riassunto qui è un metodo a base di solventi che combina l'immunostaining dei tubuli renali; sgombera ottica con cinnamate chimico a buon mercato, non tossico e pronto all'uso (ECi); e l'imaging a microscopia confocale che consente una visualizzazione completa del tubulo e la quantificazione. Questo metodo è semplice, combina antigene-recupero di fette di rene con colorazione di anticorpi commerciali, e non richiede attrezzature specializzate, che lo rende accessibile alla maggior parte dei laboratori.

<table><tbody><tr><td>0,22 &micro; m filter</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-761-112</td><td></td></tr><tr><td>15 mL tubo conico</td><td>Fisher Scientific</td><td>339650</td><td></td></tr><tr><td>21 G ago a farfalla</td><td>Braun</td><td>Venofix</td><td></td></tr><tr><td>Rubinetto a 3 vie</td><td>Fisher Scientific</td><td>K420163-4503</td><td></td></tr><tr><td>Software di analisi 3D</td><td>Bitplane AG</td><td>IMARIS</td><td></td></tr><tr><td>Software di analisi 3D</td><td>Cellprofiler</td><td></td><td>software open source gratuito</td></tr><tr><td>5-0 sutura di seta</td><td>Fine Science Tools</td><td>18020-50</td><td></td></tr><tr><td>siringhe di plastica da 50 ml Fisher</td><td>Scientific</td><td>14-817-57</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo monoclonale anti-BrdU</td><td>Roche</td><td>11296736001</td><td></td></tr><tr><td>Diluente per anticorpi</td><td>Dako</td><td>S0809</td><td></td></tr><tr><td>CD31-647</td><td></td><td>BioLegend 102516</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione per il recupero dell'antigene a base di citrato</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-3300</td><td></td></tr><tr><td>Emostatico curvo</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-812-14</td><td></td></tr><tr><td>Dako Wash Buffer</td><td>Agilent</td><td>S3006</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio da dissezione</td><td>Motic</td><td>DSK-500</td><td></td></tr><tr><td>Cassette per inclusione Carl</td><td>Roth</td><td>E478.1</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>Merck</td><td></td><td></td>100983</tr><tr><td>Etilcinnamato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>112372</td><td></td></tr><tr><td>Film flessibile/Parafilm M</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7793</td><td></td></tr><tr><td>Capra anti-AQP2</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-9882</td><td></td></tr><tr><td>Porcellino d'India anti-NKCC2</td><td>N/A</td><td>N/A DOI</td><td>: 10.1681/ASN.2012040404</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Carl Roth</td><td>P074.1</td><td></td></tr><tr><td>Eparina</td><td>Sagent Pharmaceuticals</td><td>401-02</td><td></td></tr><tr><td>Emostatico</td><td>Agnthos</td><td>312-471-140</td><td></td></tr><tr><td>Bilanciere orizzontale</td><td>Labnet</td><td>S2035-E</td><td></td></tr><tr><td>Piatto di imaging</td><td>Ibidi</td><td>81218</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina</td><td>MWI Salute animale</td><td>501090</td><td></td></tr><tr><td>Micro serrefine</td><td>Strumenti di scienze fini</td><td>18052-03</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318-500</td><td></td></tr><tr><td>Forbici operatorie</td><td>Merit</td><td>97-272</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>O4042-500</td><td></td></tr><tr><td>Coniglio anti-fosforoThr53-NCC</td><td>PhosphoSolutions</td><td>p1311-53</td><td></td></tr><tr><td>Elastomero siliconico</td><td>World Precision Instruments World Precision Instruments Kwik-Sil</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodio azide</td><td>Affettatrice per tessuti Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Zivic Instruments</td><td>HSRA001-1</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Acros Organics</td><td>AC215682500</td><td></td></tr><tr><td>forbici Vannas</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Lancer</td><td>Series 1000</td><td></td></tr><tr><td>Xilazina</td><td>MWI Salute animale</td><td>AnaSed Inj SA (Xilazina)</td><td></td></tr></tbody></table>

cancellazione ottica e imaging del tessuto renale immunoetichettato

Optical Clearing and Imaging of Immunolabeled Kidney Tissue

Le tecniche di compensazione ottica rendono trasparente il tessuto bilanciando l'indice di rifrazione in un campione per la successiva imaging tridimensionale (3D). Hanno ricevuto grande attenzione in tutte le aree di ricerca per il potenziale di analizzare strutture multicellulari microscopiche che si estendono su distanze macroscopiche. Dato che i tubuli renali, la vascolatura, i nervi e i glomeruli si estendono in molte direzioni, che finora sono stati catturati solo parzialmente dalle tradizionali tecniche bidimensionali, la pulizia dei tessuti ha aperto anche molte nuove aree di ricerca sui reni. L'elenco dei metodi di compensazione ottica è in rapida crescita, ma rimane difficile per i principianti in questo campo scegliere il metodo migliore per una determinata domanda di ricerca. Fornito qui è un metodo semplice che combina l'etichettatura anticorpale di fette di rene di topo spesse; sgombera ottica con cinnamate chimico a buon mercato, non tossico e pronto all'uso; e l'imaging confocale. Questo protocollo descrive come perfondere i reni e utilizzare un passaggio di recupero dell'antigene per aumentare il legame degli anticorpi senza richiedere attrezzature specializzate. La sua applicazione è presentata nell'imaging di diverse strutture multicellulari all'interno del rene, e come risolvere la scarsa penetrazione degli anticorpi nel tessuto è affrontato. Discutiamo anche delle potenziali difficoltà dell'imaging dei fluorofori endogeni e dell'acquisizione di campioni molto grandi e di come superarli. Questo semplice protocollo fornisce uno strumento facile da configurare e completo per studiare il tessuto in tre dimensioni.

I reni sono organi complessi composti da 43 diversi tipi di cellule31. La maggior parte di queste cellule formano grandi strutture multicellulari come glomeruli e tubuli, e la loro funzione è fortemente dipendente dalle interazioni tra loro. Le tecniche istologiche classiche 2D catturano parzialmente queste grandi strutture e possono perdere cambiamenti focali all'interno di strutture intatte31. Pertanto, l'analisi 3D con tecniche di compensazione ottica aiuta a capire come...

La combinazione di etichettatura anticorpale, compensazione ottica e microscopia luminosa avanzata consente l'analisi tridimensionale di strutture o organi completi. Descritto qui è un metodo semplice per combinare l'etichettatura di fette renali spesse, la compensazione ottica con il cinnamate etilico e l'imaging confocale che consente la visualizzazione e la quantificazione delle strutture renali tridimensionali.

Cancellazione ottica e imaging del tessuto renale immunoetichettato

Optical clearing techniques render tissue transparent by equilibrating the refractive index throughout a sample for subsequent three-dimensional (3-D) ...

Il crescente interesse per lo studio di strutture grandi e multicellulari ha portato allo sviluppo di questa tecnica di compensazione ottica che consente una visualizzazione tridimensionale e la quantificazione di grandi strutture all'interno di organi trasparenti. Questo protocollo fornisce uno strumento semplice, economico, facile da configurare e completo per indagare i tessuti in tre dimensioni. La natura multistrato di una malattia non può sempre essere simulata dalle tecniche bidimensionali tradizionali.L'analisi tridimensionale dei tessuti può aiutare a diagnosticare e monitorare meglio le malattie. Questo metodo non è limitato al tessuto renale e può essere applicato a qualsiasi tessuto normale e danneggiato. Questo semplice protocollo è facile da seguire per qualsiasi scienziato con una certa esperienza nella gestione degli animali.È importante testare diversi anticorpi in caso di scarsa etichettatura degli anticorpi e condurre solo controlli anticorpali secondari. Inizia preparando l'eparina contenente PBS e paraformaldeide al 3,0% in 1X PBS secondo le indicazioni manoscritte e trasferendo le soluzioni in siringhe di plastica separate da 50 ml. La paraformaldeide è tossica e deve essere preparata nella cappa dei fumi.Raccogliere e profuso il rene secondo le indicazioni del manoscritto. Quindi, rimuovere la capsula e tagliare il rene a fette coronali spesse un mm. Immergere le fette renali con la soluzione di paraformaldeide preparata in un tubo conico da 15 ml.Dopo la fissazione, lavare la fetta di rene due volte con 1X tampone di lavaggio per un'ora su un rocker orizzontale e quindi procedere con il recupero dell'antigene. Riscaldare 300 mL di soluzione di smascheramento antigene 1X in un becher da 500 mL. Quindi, racchiudere una fetta di rene in una cassetta incorporante permeabile al tampone riscaldato e mescolarla per un'ora a 92-98 gradi Celsius.È importante mantenere stabile la temperatura tra 92 e 98 gradi Celsius per questo passaggio di recupero dell'antigene. Quindi trasferire la fetta in 10 mL di tampone di lavaggio 1X con 0,1%Triton X-100 e dondola durante la notte. Il giorno successivo, lavare la fetta due volte con 10 mL di tampone di lavaggio 1X fresco per un'ora.Diluire l'anticorpo primario in 500 microlitri di diluente anticorpale normale. Scuotere delicatamente la fetta renale in anticorpo primario diluito per quattro giorni a 37 gradi Celsius. Dopo l'incubazione, lavare la fetta di rene in 10 mL di tampone di lavaggio 1X durante la notte a temperatura ambiente, cambiando il tampone una volta dopo otto ore.Diluire gli anticorpi secondari in 500 microlitri di diluente anticorpale normale e incubare con la fetta renale per quattro giorni a 37 gradi Celsius. Si prega di notare che da questo passo avanti, la fetta di rene dovrebbe essere protetta dalla luce. Dopo l'incubazione con anticorpi secondari, lavare la fetta di rene in 10 mL di tampone di lavaggio 1X durante la notte a temperatura ambiente.Per disidratare la fetta di rene, trasferirla a cinque mL di etanolo di alta qualità al 100% e scuoterla per due ore a temperatura ambiente, rinfrescando l'etanolo dopo un'ora. Immergere delicatamente la fetta di rene in due mL di cinnamato etilico e roccia durante la notte. Quando sei pronto per l'immagine del tessuto, aggiungi da 600 a 1000 microlitri di cinnamato etilico in un piatto con fondo di vetro e trasferisci la fetta di rene nel piatto.Posizionare una copertura rotonda sulla fetta di rene e sigillare il piatto con pellicola di paraffina. Posizionare il piatto sulla piattaforma di imaging al microscopio e immaginare il tessuto in base alle indicazioni del manoscritto. Questo protocollo è stato utilizzato per eseguire con successo analisi 3D sul tessuto renale e valutare le funzioni e le interazioni cellulari.Il metodo può causare tempra fluorescente reporter, ma altre forti proteine fluorescenti possono resistere alla tempra del segnale. La profusione aortica addominale può migliorare la diffusione degli anticorpi. In alcuni casi, una scarsa penetrazione degli anticorpi si traduce in un segnale superficiale.Questo può essere corretto con concentrazioni più elevate o rifornimento di anticorpi. La consegna intravascolare deve essere presa in considerazione se l'antigene di interesse è espresso nella vascolarizzazione renale. Tuttavia, gli anticorpi che prendono di mira le proteine nella membrana apicale delle cellule epiteliali tubuliche non attraversano la barriera di filtrazione glomerulare e causano segnali non specifici.Il tessuto può essere etichettato con gli anticorpi per rilevare una specifica popolazione cellulare o per visualizzare interi segmenti di tubuli. Inoltre, la colocalizzazione delle proteine in 3D può essere ottenuta combinando anticorpi multipli. È importante ricordare che l'etichettatura degli anticorpi può essere migliorata con una buona profusione renale, l'uso di fase di recupero dell'antigene e un'alta concentrazione di anticorpi.Alcune proteine reporter forti possono resistere alla tempra del segnale fluorescente seguendo questo protocollo. Per testare questo, salta i passaggi di recupero dell'antigene e di etichettatura degli anticorpi. Questa tecnica rispetta la natura tridimensionale delle strutture e apre molte nuove aree di ricerca.Elimina le ipotesi e le interferenze richieste associate all'analisi bidimensionale tradizionale.

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Fonte: Behera, R. K., et al. Un metodo basato sulla fluorescenza per studiare la regolazione genica batterica nei tessuti infetti. J. Vis. Esp. (2019)Questo video mostra un metodo per preparare il tessuto renale infetto del topo, colorare il DNA e rilevare l'espressione genica batterica utilizzando doppi reporter fluorescenti. Il rosso segna tutti i batteri, mentre il verde mette in evidenza le cellule sensibili all'infezione.

Imaging a fluorescenza della colonizzazione batterica nel tessuto renale del topo

Questo video mostra un test per la colorazione dell'intera montatura di reni murini utilizzando un metodo di pulizia dei tessuti chiamato CUBIC (clear, unobstructed brain/body imaging cocktails and computational analysis) e la colorazione immunofluorescente. Il rene viene sottoposto a chiarificazione tissutale, in cui il rene viene delipidatato, decolorato e trattato con una soluzione di corrispondenza dell'indice di rifrazione per rendere il tessuto trasparente per un imaging tridimensionale...

Una tecnica di colorazione dell'organo a montaggio intero per l'imaging tridimensionale del rene

ACT-PRESTO (attivo chiarezza tecnica pressione legati trasferimento efficiente e stabile delle macromolecole in organi) consente una rapida, efficace, ma poco costoso compensazione dei tessuti e la penetrazione degli anticorpi rapida nei tessuti liberata da diffusione passiva o la consegna a pressione assistita. Utilizzando questo metodo, una vasta gamma di tessuti può essere cancellato, immunolabeled da più anticorpi e volume-ripreso.

ACT-PRESTO: Biological Clearing tessuti e Metodi immunomarcatura per Volume Imaging

Qui descriviamo un approccio microscopico a foglio leggero per visualizzare l'infiltrato cardiovascolare CD45 + in un modello murino di miocardite fulminante asettica, che è indotto dal trattamento tossicolare intracellulare di tenebre di topi CD11c.DTR.

Visualizzazione quantitativa di leucociti infiltrati in un modello di murina della miocardite fulminante mediante microscopia a foglio chiaro

Descriviamo un protocollo per la microdisezione laser di sottosezioni del rene umano, tra cui il glomerulus, il tubulo prossimale, l'arto ascendente spesso, il condotto di raccolta e l'interstizio. L'RNA viene quindi isolato dai compartimenti ottenuti e il sequenziamento dell'RNA viene effettuato per determinare i cambiamenti nella firma trascrittamica all'interno di ogni sottoseme.

Applicazione della microdisezione laser per scoprire la trascritomica regionale nel tessuto renale umano

L'obiettivo di questo protocollo è quello di isolare le regioni intatte del pacemaker della pelvi renale del topo utilizzando il sezionamento del vibratoma. Queste sezioni possono quindi essere utilizzate per l'imaging Ca2+ in situ per chiarire le proprietà transitorie Di Ca2+ delle cellule pacemaker e di altre cellule interstiziali in fette di vibratome.

Isolamento e imaging delle regioni pacemaker intatte e intatte della pelvi renale del topo mediante sezionamento del vibratoma

Qui presentiamo un protocollo per adattare il metodo CLARITY dei tessuti cerebrali per retine a montaggio intero per migliorare la qualità della colorazione immunoistochimica standard e l'imaging ad alta risoluzione dei neuroni retini e delle loro strutture subcellulari.

Immunostaining delle retine a montaggio intero con il metodo clarity tissue clearing

Identificare il tipo di cellula responsabile della secrezione di citochine è necessario per comprendere la patobiologia della malattia renale. Qui, descriviamo un metodo per colorare quantitativamente il tessuto renale alla ricerca di citochine prodotte da cellule epiteliali o interstiziali renali utilizzando la brefeldina A, un inibitore della secrezione, e marcatori specifici del tipo di cellula.

Identificazione della fonte delle proteine secrete nel rene mediante iniezione di brefeldina A

Qui presentiamo un protocollo che utilizza la microscopia a 2 fotoni a Monaco di Baviera nei ratti Wistar Fromter con glomeruli di superficie per quantificare gli effetti dell'ostruzione ureterale prolungata sulla dinamica e sulla funzione glomerulare.

Utilizzo della microscopia a 2 fotoni per quantificare gli effetti dell'ostruzione ureterale unilaterale cronica sui processi glomerulari

Il presente protocollo descrive un metodo di pulizia dei tessuti e una colorazione immunofluorescente a montaggio intero per l'imaging renale tridimensionale (3D). Questa tecnica può offrire prospettive macroscopiche nella patologia renale, portando a nuove scoperte biologiche.

Colorazione tridimensionale a rene intero con CUBIC

Questo studio presenta una serie di metodi facili da usare, completi e semplici per etichettare e analizzare i glomeruli da reni di topo eliminati da CUBIC. Dati come il numero e il volume del glomerulo possono essere ottenuti in modo semplice e affidabile utilizzando l'isotiocianato di fluoresceina (FITC)-destrano, la microscopia a fluorescenza a foglio luminoso (LSFM) o la comune microscopia confocale e software come Imaris.

Un metodo efficiente e veloce per l'etichettatura e l'analisi dei glomeruli di topo

Scopri la cancellazione ottica e l'imaging confocale per l'analisi tridimensionale del tessuto renale immunoetichettato. Questo metodo semplice e accessibile consente la visualizzazione e la quantificazione di strutture cellulari complesse.

Cancellazione ottica e imaging del tessuto renale immunoetichettato

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