Name: Screening cinetico dellattività nucleana utilizzando sonde con acido Nucleic (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 52 s
Description: Scopri un metodo di screening cinetico per l'attività nucleana come biomarcatore di malattia utilizzando sonde di acidi nucleici. Questa tecnica flessibile e riproducibile permette di identificare attività nuclease note e sconosciute per applicazioni diagnostiche.

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Gli autori desiderano riconoscere Luiza I. Hernandez (Università di Linkaping) per la sua attenta revisione del manoscritto e preziosi consigli. Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fondazione Knut and Alice Wallenberg e dalla Swedish Government Strategic Research Area in Materials Science on Advanced Functional Materials presso l'Università di Link-ping (Faculty Grant SFO-Mat-LiU n. 2009-00971).

1. Progettazione e preparazione della libreria Oligonucleotide
<ol><li>Progettazione della libreria<ol>
<li>Sulla base dei seguenti criteri, progettare una libreria di sonde oligonucleotide dissedate tra 8 e 12-mer lunghe per evitare la formazione secondaria della struttura, con uguale lunghezza per tutte le sonde.<ol>
<li>Includere almeno un DNA e una sequenza casuale di RNA contenente una combinazione di adenina (A), guanina (G), citosina (C) e timina (T)/uracil (U) (sondedi DNA e RNA nella tabella 1 ). NOTA: Le sequenze di DNA e RNA descritte nella Tabella 1 sono state utili come substrati iniziali per classificare un tipo sconosciuto di attività nucleana, DNase o RNase. Queste due sequenze sono raccomandate come punto di partenza per qualsiasi screening, in quanto hanno dimostrato un'ampia capacità di rilevare i profili di attività nuclease nei campioni di batteri e tessuti. Se l'attività nucleata non viene osservata con queste sequenze di DNA e RNA, è necessaria la progettazione di oligonucleotidi aggiuntivi.</li>
			<li>Includere sequenze polinucleotidiche costituite da un singolo tipo di nucleotide per determinare la dipendenza della sequenza per una data attività nucleale (DNA-Poly A, DNA-Poly T, DNA-Poly C, DNA-Poly G, RNA-Poly A, RNA-Poly U, RNA-Poly C e RNA-Poly G nella tabella 1).</li>
			<li>Utilizzando la stessa sequenza di residui nucleotidi delle sequenze iniziali di DNA e RNA, includere sequenze che contengono analoghi nucleoside che ospitano modifiche chimiche alla posizione 2' dello zucchero ribosio, come 2'-Fluoro e 2'-O-Methyl, come passo rigoroso per aumentare la selettività delle nucleasi.<ol>
<li>Includere sequenze completamente modificate costituite interamente da analoghi nucleoside 2'-Fluoro o analoghi nucleoside 2'-O-Methyl (Tutti i 2'-F e Tutti i 2'-OMe, Tabella 1)</li>
				<li>Includere sequenze chihimericicostituite da purine naturali non modificate e analoghi 2'-Fluoro pyrimidine nucleoside (RNA Pyr-2'F, Tabella 1).</li>
				<li>Includere sequenze chihimerici costituite da purine naturali non modificate e analoghi nucleoside 2'-O-Methyl (RNA Pyr-2'OMe, Tabella 1).</li>
				<li>Includere sequenze chihimerici costituite da pirimidine naturali non modificate e analoghi di 2'-Fluoro purine (RNA Pur-2'F, Tabella 1).</li>
				<li>Includere sequenze chihimerici costituite da pirimidine naturali non modificate e analoghi di 2'-O-Methyl purina (RNA Pur-2'OMe, Tabella 1).</li>
			</ol>
</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparazione e stoccaggio della sonda Oligonucleotide NOTA: Gli oligonucleotidi sono sintetizzati dal metodo fosforamidite. Dopo la sintesi, gli oligonucleotidi vengono purificati utilizzando la cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) e la massa viene misurata dalla spettrometria di massa.<ol>
<li>Abbassare le sonde oligonucleotidi loofilizzate usando una centrifuga e diluirle nel buffer Tris-EDTA (TE) per prevenire la degradazione della nucleasi. Determinare il volume di diluizione in base alla resa di ogni sonda per eseguire il rendering di una soluzione di stock con una concentrazione di 500 pmol/l.</li>
		<li>Conservare oligonucleotidi linfofiloti a 4 gradi centigradi o a temperatura ambiente per un breve periodo. Per lo stoccaggio a lungo termine (da mesi ad anni), conservare gli oligonucleotidi liofilizzati a -20 gradi centigradi. Dopo la sospensione degli oligonucleotidi liofilizzati in TE, conservare le soluzioni azionarie a -20 gradi centigradi o, preferibilmente, a -80 gradi centigradi.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Cultura batterica
<ol><li>Prendere una perla di vetro poroso dalla fiala di stoccaggio criogenico in condizioni sterili.</li>
	<li>Per isolare singole colonie batteriche (Salmonella ed E. coli), utilizzare il metodo quadrante24 striature / rotolamento del tallone direttamente su un piatto Petri contenente Tryptic Soy Agar (TSA) medium integrato con pecora defibrinated sangue.</li>
	<li>Incubare la coltura a 37 gradi centigradi per 24 ore.</li>
</ol>3. Preparazione supernatante
<ol><li>Trasferire una singola colonia da supporti solidi a 50 mL Tryptic Soy Broth (TSB) e incubare a 37 s per 24 h a 200 rpm.</li>
	<li>Diluire la coltura (1:500) in TSB (sottocoltura) e incubare a 37 gradi centigradi per 24 h a 200 giri in un'incubatrice tremante. NOTA: Dopo 24 h di incubazione le colture batteriche sono in fase stazionaria raggiungendo valori superiori a 109 CFU/mL.</li>
	<li>Dopo il periodo di incubazione, trasferire le colture a tubi sterili con tappo e centrifugare a 4.500 x g per 30 min.</li>
	<li>Raccogliere il supernatante e usarlo immediatamente. In alternativa, conservare i supernatanti a 4 o -20 gradi centigradi.</li>
</ol>4. Saggio sull'attività di Nuclease
<ol><li>Preparazione di soluzioni di lavoro<ol>
<li>Preparare una soluzione di lavoro di 20 l l per ogni sonda in tubi di microcentrifuga liberi da 1,5 ml di diluindo (1:10 rapporto) la soluzione di stock (500 pmol/L) per una concentrazione di lavoro finale di 50 pmol / l. A tale scopo, mescolare 18 L di Phosphate Buffer Saline (PBS) contenente MgCl2 e CaCl2 con 2 L di soluzione di sonda. NOTA: Essere consapevoli del fatto che nella soluzione di lavoro, gli oligonucleotidi sono più vulnerabili alla degradazione di nucleato, quindi, si consiglia di preparare le soluzioni di lavoro appena prima di impostare la reazione.</li>
		<li>Evitare il contatto diretto della luce durante la preparazione e tenere al buio (avvolto in un foglio), quando si tratta di fluorofori.</li>
	</ol></li>
	<li>Impostazione della reazione<ol>
<li>Preriscaldare il fluorometro (ad es. Citazione 1) a 37 gradi centigradi.</li>
		<li>Preparare un set (un tubo/sonda) di 1,5 mL di tubi di microcentrifuga liberi da nucleato per ogni campione (TSB, E. coli e Salmonella)ed etichettare di conseguenza.</li>
		<li>Aggiungere con cura 96 -L di TSB sterile culture media, Salmonella supernatant o E. coli supernatant (dal passo 3.4.). Successivamente, aggiungere di conseguenza 4 soluzione di lavoro sonda/tubo della sonda. Eseguire questo passaggio a temperatura ambiente. NOTA: sono state utilizzate 10 sonde per il primo round dello screening e 6 sonde per il secondo round.</li>
		<li>Mescolare accuratamente pipetting su e giù per ottenere una soluzione omogenea. Evitare di introdurre bolle d'aria nei campioni durante la miscelazione.</li>
		<li>Caricare 95 l di ogni soluzione (sonda - supernatante o supporto di coltura) in un pozzo separato di un fondo nero, non trattato 96 pozzetto. Ridurre al minimo la formazione di bolle nei pozzi al momento del carico erogando con attenzione con la punta vicino alla parete del pozzo.</li>
		<li>Coprire la piastra con il coperchio. Ispezionare visivamente il coperchio e verificare la presenza di segni della penna o dell'accumulo di particelle di polvere che possono introdurre artefatti di misurazione. Sostituire il coperchio per uno nuovo, se questo è il caso.</li>
	</ol></li>
	<li>Configurazione della misurazione<ol>
<li>Aprire il software di acquisizione (Gen5 3.05) facendo clic sull'icona del collegamento software (Figura S1A).</li>
		<li>Selezionare Leggi ora nella finestra di gestione delle attività e scegliere Nuovo... per creare il protocollo di misurazione cinetica (Figura S1B).</li>
		<li>Fare clic su Imposta temperatura nella finestra di dialogo intitolata Procedura e selezionare 37 . Confermare e salvare le impostazioni premendo OK (Figura S1C).</li>
		<li>Fare clic su Avvia Kinetics nella finestra di dialogo intitolata Procedura. Quindi, nella finestra di dialogo popup, intitolata Passo Kinetico, selezionare 2 h nella casella di input Tempo di esecuzione e 2 min nella casella di input Intervallo. Confermare e salvare le impostazioni premendo OK (Figura S1D).</li>
		<li>Fare clic su Lettura nella finestra di dialogo intitolata Procedura. Quindi nella finestra di dialogo pop-up, intitolata Metododi lettura , selezionare Intensità di fluorescenza come metodo di rilevamento, Endpoint/Kinetic come tipo di lettura e Filtri come tipo di ottica. Confermare e salvare le impostazioni premendo OK (Figura S1E).</li>
		<li>Nella finestra di dialogo a comparsa intitolata Read Step (Kinetic), selezionare Verde dal gruppo difiltri . Confermare e salvare le impostazioni premendo OK (Figura S2A).</li>
		<li>Nella finestra di dialogo intitolata Procedura, selezionare Usa coperchio e fare clic su Convalida per assicurarsi che il protocollo creato sia valido. Ciò è confermato da una finestra di dialogo popup (Figura S2B).</li>
		<li>Selezionare protocollo nella barra dei menu e scegliere la procedura (Figura S2C).</li>
		<li>Nella finestra di dialogo denominata Procedura, definire i pozzi da misurare (Figura S2D).</li>
		<li>Immettere il nome dell'esperimento nella casella di input del nome file (Figura S2E).</li>
		<li>Caricare la piastra con il coperchio nel lettore di piastre. Assicurarsi che la piastra sia nel giusto orientamento.</li>
		<li>Avviare l'acquisizione facendo clic sul pulsante Leggi nuovo nella barra degli strumenti (Figura S2F).</li>
	</ol></li>
	<li>Analisi dei dati<ol>
<li>Fare clic su uno dei pozze misurati nella finestra di dialogo denominata Plate 1 (Figura S3A).</li>
		<li>Fare clic su Seleziona pozzi e includere tutti i pozzi misurati nella finestra di dialogo di selezione dei pozzi. Confermare e salvare le impostazioni premendo OK. (Figura S3B).</li>
		<li>Selezionare i dati nella finestra di dialogo denominata Plate 1 per visualizzare i risultati visualizzati (Figura S3C).</li>
		<li>Esportare i dati in un foglio di pagine affiancate selezionando Esportazione rapida dal menu di scelta rapida (Figura S3C).</li>
		<li>Nel foglio di diffusione, etichettare le colonne di dati di conseguenza per ogni campione e sonda.</li>
		<li>Generare grafici cinetici, utilizzando la linea con lo stile dei marcatori, tracciando le unità di fluorescenza relative (RFU) rispetto al tempo (asse x: sequenza temporale della reazione e dell'asse y: RRU). NOTA: la descrizione della generazione di un grafico è applicabile quando si utilizzano programmi per fogli di calcolo (ad esempio Excel). Tuttavia, qualsiasi altro programma può essere utilizzato per generare grafici dai dati grezzi ottenuti, tracciando RFU rispetto al tempo.</li>
		<li>Calcolare la velocità della reazione ezimatica per ogni intervallo <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/60005/60005eq1.jpg"> misurato in base alla seguente formula25: rate , dove If è RFU al punto di tempo intervallo massimo e Ii è RFU al punto di tempo intervallo minimo, e Tf e Ti sono rispettivamente i punti di tempo a intervalli massimi e minimi.</li>
		<li>Selezionare la velocità con il valore più alto (Rmax) per ogni curva. Se è presente più di unR max per campione, selezionare quello che si verifica al primo punto del tempo di misurazione.</li>
		<li>Calcolare il rapporto tra Rmax e il valore medio dell'intervallo di tempo in cui si verifica Rmax: coefficiente di tasso<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/60005/60005eq2.jpg">
</li>
		<li>Calcolare la differenza di piegatura (FD) tra il coefficiente di tasso di Salmonella e E. coli per ogni sonda.</li>
		<li>Considerare significativo un valore di differenza di piegatura superiore a 3.</li>
		<li>Considerare le sonde significative con i valori di differenza di piegatura più alti (FD) come sonde candidate e come base per la progettazione della libreria nel successivo ciclo di screening.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Screening dei criteri di selezione dei round(Figura 1)
<ol><li>Primo ciclo di screening<ol>
<li>Eseguire il saggio di attività nuclease (come descritto nella sezione 4) utilizzando sonde DNA, RNA e polinucleotide.</li>
		<li>Valutare la preferenza per la chimica del DNA o della chimica dell'RNA confrontando il numero e le prestazioni (valore FD) delle sonde candidate al DNA e all'RNA.</li>
		<li>Selezionare il tipo di chimica dell'acido nucleico che rende il maggior numero di sonde candidate, come illustrato nella Figura 1.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Secondo ciclo di screening<ol>
<li>Eseguire il saggio di attività nuclease (come descritto nella sezione 4) utilizzando sonde completamente modificate e sonde chimeriche progettate in base al substrato acido nucleico selezionato nel primo ciclo di screening.</li>
		<li>Valutare la preferenza verso sequenze contenenti 2'-Fluoro e 2'-O-Methyl nucleoside analogici confrontando i risultati ottenuti per le sonde candidate modificate 2'-Fluoro e 2'-O-Methyl.</li>
		<li>Selezionare il tipo di modifica analogica nucleoside per il rendering del maggior numero di sonde candidate, come illustrato nella Figura 1.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Skerra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+binding+proteins%3A+anticalins+-+harnessing+the+structural+plasticity+of+the+lipocalin+ligand+pocket+to+engineer+novel+binding+activities%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">Alternative binding proteins: anticalins - harnessing the structural plasticity of the lipocalin ligand pocket to engineer novel binding activities.</a> FEBS Journal. 275 (11), 2677-2683 (2008).</li>
<li>Ku, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleic+Acid+Aptamers%3A+An+Emerging+Tool+for+Biotechnology+and+Biomedical+Sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Nucleic Acid Aptamers: An Emerging Tool for Biotechnology and Biomedical Sensing.</a> Sensors (Basel). 15 (7), 16281-16313 (2015).</li>
<li>Jayasena, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aptamers%3A+an+emerging+class+of+molecules+that+rival+antibodies+in+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Aptamers: an emerging class of molecules that rival antibodies in diagnostics.</a> Clinical Chemistry. 45 (9), 1628-1650 (1999).</li>
<li>Gray, B. P., Brown, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+peptide+libraries%3A+mining+for+cell-binding+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Combinatorial peptide libraries: mining for cell-binding peptides.</a> Chemical Reviews. 114 (2), 1020-1081 (2014).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Le alterazioni dell'attività di nuclease sono state associate a un'ampia varietà di fenotipi della malattia, tra cui diversi tipi di cancro e infezioni batteriche. Queste alterazioni sono proposte come l'agente causale di una condizione14, mentre in altri casi sono la conseguenza di un evento fisiologico dannoso20 o agente patogeno16,26. Non sorprende che i tentativi di utilizzare nucleasi e attività di nucleasi com...

Le nucleasi sono una classe di enzimi in grado di fendere i legami di fosforestro che formano la struttura della spina dorsale delle molecole di acido nucleico. La grande diversità di nucleasi rende la loro classificazione piuttosto difficile. Tuttavia, ci sono alcuni criteri comuni utilizzati per descrivere le nucleasi, come la preferenza del substrato (acido deossiribonucleico (DNA) o acido ribonucleico (RNA), sito di scissione (endonucleases o esonucleasi), o dipendenza da ioni onani metallici, tra gli altri1. Le nucleasi sono enzimi catalitici altamente conservati che hanno ruoli fondamentali in entrambi gli organismi procariotici ed eucarioti e sono stati utilizzati, e continuano ad essere utilizzati, come strumenti di editing genico2. Sono anche attori fondamentali nella manutenzione e replicazione del DNA, contribuendo a mantenere la stabilità del genoma e partecipando ai processi di proof-reading3. Nei batteri, ad esempio, le nucleasi sono state identificate come importanti fattori di virulenza, in grado di promuovere la sopravvivenza batterica riducendo l'efficacia del sistema immunitario dell'ospite4,5,6,7 ,8. Nei mammiferi, le nucleasi sono state suggerite per essere implicate nell'apoptosi9, biogenesi mitocondriale e manutenzione10 e mediazione delle risposte immunitarie innate antibatteriche e antivirali11. Non sorprende che le alterazioni dell'attività di nucleamento, sia in miglioramento che in mancanza, siano state implicate in una vasta gamma di malattie umane. Queste malattie vanno da un'ampia varietà di tumori12,13 a ipertrofia cardiaca10 o malattie autoimmuni14. Pertanto, le nucleasi sono diventate candidati interessanti come biomarcatori per un gruppo eterogeneo di condizioni umane. Infatti, le nucleasi hanno già mostrato il loro potenziale come strumenti diagnostici di successo per il rilevamento di infezioni causate da specifici agenti batterici, come Staphylococcus aureus o Escherichia coli15, 16.In molti tipi di cancro, l'espressione della proteina ribonuclease nuclease nuclease stafilocca del dominio di nuclease 1 (SND1) è indicativa di prognosi infausta17. Nei pazienti affetti da cancro al pancreas, sono stati riportati18 livelli elevati di siero ribonuclease I (RNase I) e proposti di essere associati a fenotipi cellulari cancerosi19. In condizioni cardiache ischemiche, come l'infarto miocardico o l'angina pectoris instabile, deoxyribonuclease I (DNase I) i livelli del siero sono stati indicati come un valido marcatore diagnostico20,21.
È stato ipotizzato che il progetto globale dell'attività nuclease potrebbe essere diverso negli stati sani e malati. Infatti, recenti rapporti hanno utilizzato differenze nell'attività nuclease per distinguere tra fenotipi sani e cancerosi22 o per identificare le infezioni batteriche patogene in modo specifico per specie15,23. Questi risultati hanno aperto una nuova strada per l'uso di nucleasi come biomarcatori della malattia. Pertanto, esiste la necessità di sviluppo di un metodo di screening completo in grado di identificare sistematicamente le differenze associate alle malattie nell'attività nucleana, che possono essere di fondamentale importanza nello sviluppo di nuovi strumenti diagnostici.
In questo articolo, introduciamo e descriviamo un nuovo approccio di screening in vitro (Figura 1) per identificare sonde sensibili e specifiche in grado di discriminare l'attività nucleasea in sano e malsano, o un'attività specifica di un tipo di cellula o batteri. Approfittando della modularità degli acidi nucleici, abbiamo progettato una libreria iniziale di sonde oligonucleotidi fluorescenti quesinella costituita da un insieme completo di sequenze e chimiche diverse, entrambe parametri importanti per la progettazione della biblioteca. Queste sonde oligonucleotide sono affiancate da un fluoroforo (fluorescein amidite, FAM) e da un quencher (quencher di marea 2, TQ2) rispettivamente alle estremità 5' e 3'(tabella 1). Utilizzando questo saggio fluorometrico basato sul trasferimento di energia a risonanza fluorescente (FRET) per misurare la cinetica della degradazione enzima, siamo stati in grado di identificare le sonde candidate con il potenziale di discriminare i modelli differenziali di attività nucleana associati a stati sani o malati. Abbiamo progettato un processo iterativo, in cui vengono create nuove librerie sulla base delle migliori sonde candidate, che consente l'identificazione di sonde candidate sempre più specifiche nelle successive fasi di screening. Inoltre, questo approccio sfrutta la natura catalitica delle nucleasi per aumentare la sensibilità. Ciò si ottiene sfruttando la natura attivabile delle sonde reporter e la capacità delle nuclesie di elaborare continuamente le molecole di substrato, entrambi rappresentando vantaggi chiave rispetto agli anticorpi alternativi o ai metodi di screening a base di piccole molecole.
Questo approccio offre uno strumento di screening altamente modulare, flessibile e facile da implementare per l'identificazione di specifiche sonde di acido nucleico in grado di discriminare gli stati sani e le malattie, e un'eccellente piattaforma per lo sviluppo di nuovi strumenti diagnostici che possono essere adattati per future applicazioni cliniche. Come tale, questo approccio è stato utilizzato per identificare l'attività di nuclease derivata da Salmonella Typhimurium (qui chiamata Salmonella) per l'identificazione specifica di questo batterio. Nel seguente protocollo, riportiamo un metodo per lo screening dell'attività nucleale batterica utilizzando l'analisi cinetica.

<table><tbody><tr><td>Piastra a 96 pozzetti con fondo nero, non trattata,</td><td>Fisher Scientific</td><td>10000631</td><td></td></tr><tr><td>Cytation1</td><td>Provette BioTek</td><td>CYT1FAV</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf</td><td>Thermofisher</td><td>11926955</td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli</td><td>ATCC</td><td>25922</td><td></td></tr><tr><td>Fiala di conservazione criogenica Microbank contenente perle Pro-Lab</td><td>Diagnostics</td><td>22-286-155</td><td></td></tr><tr><td>Sonde per acidi nucleici</td><td>Biomers.net</td><td>#</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato tampone Soluzione salina contenente MgCl2 e CaCl2</td><td>Gibco&trade;</td><td></td><td></td>14040117</tr><tr><td>Salmonella enterica subs.</td><td>Enterica ATCC</td><td>14028</td><td></td></tr><tr><td>Tris-EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>10647633</td><td></td></tr><tr><td>Triptone Soia Agar con sangue di pecora defibrato</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10362223</td><td></td></tr><tr><td>Brodo di Soia Trittico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>22092</td><td></td></tr></tbody></table>

screening cinetico dell'attività nucleana utilizzando sonde con acido nucleic

Kinetic Screening of Nuclease Activity using Nucleic Acid Probes

Le nucleasi sono una classe di enzimi che scompongono gli acidi nucleici catalizzare l'idrolisi dei legami di fosforestro che legano gli zuccheri ribosio. Le nucleasi mostrano una varietà di ruoli fisiologici vitali negli organismi procariotici ed eucarioti, che vanno dal mantenimento della stabilità del genoma alla protezione contro gli agenti patogeni. L'attività di nucleasi alterata è stata associata a diverse condizioni patologiche, tra cui infezioni batteriche e cancro. A tal fine, l'attività di nucleasi ha mostrato un grande potenziale per essere sfruttata come un biomarcatore specifico. Tuttavia, un metodo di screening robusto e riproducibile basato su questa attività rimane altamente auspicabile.
Qui, introduciamo un metodo che consente lo screening per l'attività nuclease utilizzando sonde di acido nucleico come substrati, con l'ambito di differenziare tra condizioni patologiche e sane. Questo metodo offre la possibilità di progettare nuove librerie di probe, con crescente specificità, in modo iterativo. Pertanto, sono necessari più cicli di screening per affinare il design delle sonde con caratteristiche migliorate, sfruttando la disponibilità di acidi nucleici modificati chimicamente. Il notevole potenziale della tecnologia proposta risiede nella sua flessibilità, alta riproducibilità e versatilità per lo screening dell'attività di nucleasi associata alle condizioni della malattia. Si prevede che questa tecnologia consentirà lo sviluppo di promettenti strumenti diagnostici con un grande potenziale nella clinica.

La figura 1 mostra il flusso di lavoro di questa metodologia, suddivisa in due cicli di screening. Nel primo ciclo di screening, abbiamo utilizzato 5 sonde di DNA (DNA, DNA Poly A, DNA Poly T, DNA Poly C e DNA Poly G) e anche 5 sonde di RNA (RNA, RNA Poly A, RNA Poly U RNA Poly C e RNA Poly G). I dati grezzi di questo ciclo di screening sono riportati nella tabella supplementari 1. Nel secondo round, le sonde modificate chimicamente sono state sintetizzate sostituendo la seq...

L'attività di nucleasi alterata è stata associata a diverse condizioni umane, alla base del suo potenziale come biomarcatore. La metodologia di screening modulare e facile da implementare presentata in questo documento consente di selezionare specifiche sonde di acido nucleico per sfruttare l'attività nuclease come biomarcatore della malattia.

Screening cinetico dell'attività nucleana utilizzando sonde con acido Nucleic

Nucleases are a class of enzymes that break down nucleic acids by catalyzing the hydrolysis of the phosphodiester bonds that link the ribose sugars. ...

Questo protocollo fornisce una potente alternativa per lo screening dell'attività della nucleasi come biomarcatore della malattia, con una metodologia facile da implementare anche per i ricercatori che non sono così specializzati nelle sonde di acido nucleico. Il principale vantaggio di questa tecnica è la capacità di selezionare sonde di acido nucleico in grado di identificare attività nucleasi conosciute e sconosciute, sfruttando l'interazione dinamica sonda-nucleasi. Altri vantaggi di questa metodologia sono la sua flessibilità, elevata riproducibilità e facilità d'uso.La dimostrazione sarà eseguita da Khadija, studentessa di Master, e Baris, un postdoc del nostro laboratorio. Quando si progetta una libreria oligonucleotide, includere almeno un DNA e una sequenza casuale di RNA contenente una combinazione di adenina, guanina, citosina e tiamina o uracile. Per preparare le sonde oligonucleotidi, spingi giù le sonde oligonucleotidiche liofilizzate e diluire ogni sonda nel tampone Tris-EDTA a una concentrazione di 500 picomolare per microlitro per prevenire la degradazione della nucleasi.Per la coltura batterica su supporto solido, arrotolare una singola perla di vetro poroso dalla conservazione criogenica direttamente su un piatto di coltura contenente TSA integrato con sangue di pecora defibrinato per striare singole colonie batteriche. Quindi posizionare la piastra a 37 gradi Celsius per 24 ore. Per la coltura batterica in mezzo liquido, trasferire una singola colonia da una coltura media solida a 50 millilitri di TSB per l'incubazione a 37 gradi Celsius per 24 ore a 200 rotazioni al minuto.Il giorno dopo, diluire la coltura a un rapporto uno a 500 in TSB fresco e incubare i batteri per altre 24 ore a 37 gradi Celsius e 200 rotazioni al minuto in un incubatore di scuotimenti. Per impostare un saggio di attività della nucleasi, prima preripidi un fluorometro a 37 gradi Celsius e aggiungi con cura 96 microlitri di TSB sterile o supernatante da una coltura media liquida Salmonella o E.Coli a un tubo di microcentrifugo privo di nucleasi da 1,5 millilitri per sonda. Aggiungere quattro microlitri di soluzione di lavoro a sonda a ciascun tubo e utilizzare una pipetta per mescolare accuratamente ogni contenuto del tubo fino a ottenere soluzioni omogenee, facendo attenzione ad evitare bolle.Successivamente, caricare con cura 95 microlitri di ogni soluzione vicino alla parete di singoli pozzi di un fondo nero, piastra di pozzo 96 non trattata, facendo attenzione ad evitare bolle. Una volta aggiunte tutte le soluzioni, coprire la piastra e ispezionare visivamente il coperchio alla ricerca di marcature a penna o polvere che possono introdurre artefatti di misurazione. Per impostare il software per la misurazione dell'attività nucleasi, aprire un programma software di acquisizione adatto.Selezionare Leggi ora dalla finestra Gestione attività e quindi Nuovo per creare il protocollo di misurazione cinetica. Fare clic su Imposta temperatura per selezionare 37 gradi Celsius e confermare e salvare le impostazioni facendo clic su OK. Fate clic su Inizia cinetica (Start Kinetics). Nella finestra popup selezionare due ore nella casella di input Tempo di esecuzione e due minuti nella casella di input intervallo prima di fare clic su OK per confermare e salvare le impostazioni.Fare clic su Leggi. Nella finestra popup, selezionate Intensità fluorescenza come metodo di rilevamento, Cinetica endpoint come tipo di lettura e filtri come tipo di ottica. Quindi fare clic su OK. Nella finestra popup selezionare Verde dal set di filtri e fare clic su OK. Nella finestra Procedura selezionare Usa coperchio e fare clic su Convalida.Verrà visualizzata una finestra popup che conferma che il protocollo creato è valido. Nel menu Protocollo selezionare Procedura. Nella finestra Procedura definire i pozzi da misurare e immettere il nome dell'esperimento nella casella di input Nome file.Quindi caricare la piastra nel lettore di lastre, facendo attenzione che la piastra sia nell'orientamento giusto e fare clic sul pulsante Leggi nuovo per iniziare l'acquisizione. Per l'analisi dei dati, aprire i dati nel software di analisi appropriato e selezionare uno dei pozzi misurati nella piastra di una finestra. Fate clic su Seleziona pozzi (Select Wells) e includete tutti i pozzi misurati nella finestra di dialogo Selezione pozzi (Well Selection Dialog) prima di fare clic su OK. Quindi selezionare Dati nella lastra una finestra per visualizzare i risultati tabulati e fare clic su QuickExport per esportare i dati in un foglio di calcolo.In un foglio di calcolo etichettare le colonne di dati in base alle esigenze per ogni campione e sonda e tracciare le unità di fluorescenza relative rispetto al tempo in cui i dati generano grafici cinetici. In questo esperimento rappresentativo, dopo il primo ciclo di screening, i supernanti della coltura di Salmonella hanno riportato una chiara preferenza per le sonde di RNA rispetto alle sonde del DNA. Sulla base dell'identificazione dell'RNA come tipo di acido nucleico preferito dalle nucleasi della Salmonella, una nuova libreria solo RNA è progettata per essere utilizzata nel secondo ciclo di screening.Al contrario, E.Coli nei controlli dei mezzi di coltura dimostrò una capacità molto limitata di degradare le sonde di RNA. Dopo un secondo ciclo di screening utilizzando nucleotidi modificati chimicamente volti ad aumentare la specificità delle sonde di RNA, l'RNA pirimidina 2'O-metile e l'RNA purine 2'O-metile potrebbero essere identificati sulla base delle loro modifiche chimiche come il comportamento cinetico più performante rispetto all'RNA pirimidina 2'fluoro e RNA purine 2'fluoro rispettivamente. Questi risultati suggeriscono che la Salmonella ha un'importante attività di RNAse con preferenza chimica differenziale del substrato che può essere utilizzata per selezionare sonde in grado di riconoscere specificamente questo batterio.Questa procedura consente la selezione di sonde in grado di identificare le attività nucleasi associate a condizioni di malattia, come il cancro o l'infezione batterica, consentendo lo sviluppo di nuovi strumenti diagnostici clinici.

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In questo video, dimostriamo la procedura per determinare l'attività dell'elicasi di una proteina bersaglio per svolgere il substrato di dsRNA marcato con biotina. L'attività dell'enzima è stata identificata analizzando lo spostamento della mobilità elettroforetica, seguito da un saggio di chemiluminescenza utilizzando streptavidina coniugata con enzimi chemiluminescenti.

Misurazione dell'attività dell'elicasi di una proteina bersaglio utilizzando duplex di RNA marcati con biotina

Le esonucleasi svolgono un ruolo fondamentale nel garantire la stabilità del genoma. La perdita della funzione dell'esonucleasi WRN provoca un invecchiamento precoce. Lo studio dei substrati e di altri requisiti della nucleasi in vitro può aiutare a chiarire il suo ruolo in vivo. Qui dimostriamo un saggio rapido e riproducibile basato sulla fluorescenza per misurare la sua attività nucleasica.

Un saggio di esonucleasi basato sulla fluorescenza per caratterizzare DmWRNexo, ortologo dell'esonucleasi WRN progeroide umana, e la sua applicazione ad altre nucleasi

Descriviamo saggi discontinui sensibili basati su gel per esaminare la cinetica dell'inizio del filamento ritardato utilizzando le proteine di replicazione del batteriofago T7.

Cinetica di Lagging filamento sintesi del DNA<em&gt; In Vitro</em&gt; Dai replica proteine ​​batteriofago T7

Qui sono presentati protocolli per saggi biochimici in vitro utilizzando etichette di biotina che possono essere ampiamente applicabili per studiare le interazioni proteina-nucleiche dell'acido.

Analisi biochimiche in Vitro che utilizzano etichette di biotina per studiare le interazioni proteina-nucleica dell'acido

Sono stati sviluppati saggi sull'attività NMR per identificare e caratterizzare gli inibitori di due enzimi riboidroelettrici nucleoside. I protocolli sono forniti per i saggi composti iniziali a 500 M e 250 M, i saggi di risposta alla dose per determinare i valori IC50, i saggi del controschermo del detergente, i saggi del controschermo jump-diluizione e i saggi in E. coli intere cellule.

Assaggi di attività basati su NMR per determinare l'inibizione composta, i valori IC50, l'attività Artifactual e l'attività intera delle cellule

Viene descritto un metodo altamente parallelo per misurare la scissione specifica del sito del DNA a livello di singola molecola. Questo protocollo illustra la tecnica utilizzando la restrizione endonuclease NdeI. Il metodo può essere facilmente modificato per studiare qualsiasi processo che si traduce in scissione del DNA specifica del sito.

Analisi cinetica ad alta velocità ad alto rendimento parallela per cleavage del DNA specifico del sito

Le DNA metiltransferasi sono potenziali bersagli di farmaci antitumorali. Qui, viene presentato un protocollo per valutare piccole molecole per l'inibizione della DNA metiltransferasi. Questo test utilizza un'endonucleasi per accoppiare la metilazione del DNA alla generazione di fluorescenza e consente di monitorare l'attività enzimatica in tempo reale.

Saggio di metilazione del DNA accoppiato a endonucleasi a fluorescenza continua per lo screening degli inibitori della DNA metiltransferasi

Le nanomacchine basate su DNAzyme possono essere utilizzate per il rilevamento altamente selettivo e sensibile degli acidi nucleici. Questo articolo descrive un protocollo dettagliato per la progettazione di nanomacchine basate su DNAzyme con un nucleo 10-23 utilizzando software libero e la loro applicazione nel rilevamento di un frammento di virus di Epstein-Barr come esempio.

DNAzyme 10-23 - Nanomacchine basate sul riconoscimento degli acidi nucleici

Qui viene presentato un protocollo per il dosaggio degli enzimi metabolizzanti degli acidi nucleici, utilizzando esempi di enzimi ligasi, nucleasi e polimerasi. Il test utilizza oligonucleotidi marcati in fluorescenza e non marcati che possono essere combinati per formare duplex che imitano i danni all'RNA e/o al DNA o gli intermedi di percorso, consentendo la caratterizzazione del comportamento enzimatico.

Utilizzo di oligonucleotidi sintetici modificati per il dosaggio degli enzimi che metabolizzano gli acidi nucleici

Questo studio presenta un saggio FRET raziometrico semplice e di facile utilizzo per il rilevamento e la valutazione quantitativa dell'attività della DNasi e dimostra la sua applicazione nell'analisi di una nucleasi debole.

Valutazione dell'attività della DNasi mediante trasferimento di energia di risonanza a fluorescenza raziometrica

Questo protocollo descrive un saggio biochimico gel shift per misurare l'attività di FEN1 (Flap Endonuclease 1) e lo sviluppo di inibitori.

Rilevamento basato sulla fluorescenza dell'attività della nucleasi FEN1 e screening di inibitori di piccole molecole

Scopri un metodo di screening cinetico per l'attività nucleana come biomarcatore di malattia utilizzando sonde di acidi nucleici. Questa tecnica flessibile e riproducibile permette di identificare attività nuclease note e sconosciute per applicazioni diagnostiche.

Screening cinetico dell'attività nucleana utilizzando sonde con acido Nucleic

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