Name: Caratterizzazione dei trasportatori a membrana di Eterologous Expression in E. coli e produzione di membrane (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-31T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 16 s
Description: Scopri come caratterizzare i trasportatori a membrana guidati da protoni utilizzando vescicole di E. coli. Questo metodo semplifica la quantificazione dell'affinità del substrato rispetto alla ricostituzione in liposomi artificiali.

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Il sostegno a questo progetto è stato fornito dal BGSU Graduate College e dall'Ufficio BGSU dei programmi sponsorizzati e della ricerca.

1. Generazione dell'E. coli Double Knock Out Mutant con Trasduzione P1
<ol><li>Ottenere i ceppi mutanti E. coli a singolo urlo , che sono stati eliminati con il centro di riserva<a href="http://cgsc.biology.yale.edu" target="_blank">genetica (http://cgsc.biology.yale.edu)</a>e NOT:</</c5> Il ceppo di zPotE è resistente alla kanamycin26 e la deformazione di zCadB è resistente alla tetraciclina27.</li>
	<li>Costruire la ceppo PotE/CadB doppio knockout (DKO) utilizzando il protocollo di trasduzione P128.<ol>
<li>Preparazione del lisato<ol>
<li>Diluire una coltura notturna di zPotE in LB fresco (1:100) integrato con 10-25 mM MgCl2, 5 mM CaCl2e 0,1-0,2% di glucosio.</li>
			<li>Coltivare a 37 gradi centigradi per 1-2 h.</li>
			<li>Aggiungete 40 lunisi di fago P1 alla coltura e continuate a crescere a 37 gradi centigradi. Monitorare per 1-3 h fino a quando la coltura ha lised NOTA: Quando la coltura è lised, detriti cellulari saranno visibili nel tubo e la coltura avrà una perdita significativa di torbidità.</li>
			<li>Aggiungere diverse gocce di cloroformio (50-100 ) al lisa e al vortice. Centrifuga a 12.000 x g per 2 min per rimuovere i detriti cellulari e trasferire il supernatante in un tubo fresco.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Trasduzione del<ol>
<li>Crescere con deformazione CadB durante la notte nel mezzo LB.</li>
			<li>Raccogliere le cellule per centrifugazione a 4.000 x g per 2 min e rispendere in 1/5-1/3 il volume di coltura raccolto in LB fresco integrato con 100 mM MgSO4 e 5 mM CaCl2.</li>
			<li>Aggiungete la sospensione della cella al tubo con il fago dal punto 1.2.1.4 e mescolate rapidamente.</li>
			<li>Aggiungete 200 -L di 1 M Na-Citrate (pH5.5), quindi aggiungete 1 mL di LB. Incubare a 37 gradi per 1 h per consentire l'espressione del marcatore resistente agli antibiotici.</li>
			<li>Girare le celle a 4000 x g per 5 min.</li>
			<li>Risospendere in 100 LB con 100 mM Na-Citrate (pH 5,5) e vortice bene per disperdere le cellule.</li>
			<li>Selezionare i ceppi ricombinanti su piastre di agar LB con 50 g/mL di kanamycin e 10 tetraciclina di g/mL, quindi confermare con Polymerase Chain Reaction (PCR) con primer appropriati26,27.</li>
			<li>Verificare i frammenti PCR mediante sequenza.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Espressione del gene bersaglio (AtBAT1) in E. coli Mutant
<ol><li>Amplificala sequenza completa del gene bersaglio da PCR e inseriscila nel vettore di ingresso gateway pENTR/D-TOPO29. NOT:</</c1> In questo caso ATBAT1.1 è stato amplificato utilizzando primer in avanti 5'CGGCGATCAATCCTTGTT e primer inverso 5'GCTAGAGAGTTGGAGGGG, una denaturazione iniziale a 98 gradi centigradi per 2 min e poi 30 cicli di denaturazione a 98 gradi centigradi per 0,1 min, annealanda a 59 gradi centigradi per 0,3 min, estensione a 72 gradi centigradi per 0,40 min e estensione finale a 72 gradi centigradi per 10 min. Il prodotto PCR è stato purificato utilizzando un kit di pulizia PCR, quantificato utilizzando uno spettrometro. L'inserimento del prodotto PCR nel vettore Gateway è stato effettuato seguendo le indicazioni dei manufactrurers.<ol>
<li>Trasforma il vettore di ingresso in competenti cellule Top10 E. coli per scosse di calore e selezionalo per ricombinanti di successo su supporti LB con 50 kanamycin che seguono i protocolli standard di clonazione molecolare30.</li>
		<li>Estrarre il DNA del plasmide utilizzando un kit di estrazione plasmide, seguendo le indicazioni del produttore, e la sequenza per confermare il corretto inserimento.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Trasferire il gene bersaglio nel vettore di destinazione E. coli, pBAD-DEST49 dal gateway LR clonazione per creare un vettore di espressione29.<ol>
<li>Trasforma il vettore di espressione in celle Top10 E. coli competenti per scossa di calore per 30 s e seleziona ricombinanti riusciti su supporti LB con 100 ampicillin a g/mL30.</li>
		<li>Estrarre il plasmide DEL DNA30 e la sequenza per confermare il corretto inserimento.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Trasformare il vettore di espressione in E. coli -potE740(del)::kan, scadB2231::Tn10 e selezionare su piastre LB con ampicillina, kanamycin e tetraciclina30.</li>
	<li>Al fine di determinare la concentrazione ottimale di arabinose per l'induzione, esprimere il gene bersaglio sotto il controllo del promotore araBAD nei media LB con concentrazioni di gradiente di arabono come descritto29.</li>
	<li>Raccogliere i pellet cellulari e valutare l'espressione proteica da SDS-PAGE e la visualizzazione delle bande proteiche come descritto nel manuale del prodotto29. NOT:</</c16> L'E. coli -potE740(del)::kan, scadB2231::Tn10 è stato utilizzato come campione di controllo senza espressione BAT1. E.coli doppio knock out cellule mutanti con il vettore vuoto pBAD-DEST49 non è stato utilizzato come un controllo a causa della presenza del gene ccdB nel vettore.</li>
</ol>3. Generazione di vescicoli membrana all'interno dell'esterno
<ol><li>Coltura le cellule mutanti E. coli che esprimono la proteina bersaglio coltivando una singola colonia durante la notte in 5 mL di supporti senza poliammina (2% glicerolo, 6 g di K2HPO4, 3 g di KH2PO4, 0,5 g di NaCl, NH4Cl, 50 mg di tiamina, 0,79 g lievito completo supporto sintetico amisulfato (10 mg/L), L-Arginina (50 mg/L), acido L-aspartico (80 mg/L), L-Histi cloridrato cloridrato di dine (20 mg/L), L-Leucina (100 mg/L), L-Lysine cloridrato (50 mg/L), L-Mesionina (20 mg/L), L-Phenylalanine (50 mg/L), L-Threonine (100 mg/L), L-Tryptophan (50 mg/L), L-Tyrosine (50 mg/L), L-Valine (140 mg/L), Uracil (20 mg/L)). Trasferire questa coltura a 500 mL di media senza poliammina integrati con 0.0002% arabino e crescere fino a quando la coltura cellulare raggiunge un OD600 di 0,6-0,8 (di solito 5 h).</li>
	<li>Raccogliere il pellet cellulare con centricazione a 2.000 x g per 15 min a 4 gradi centigradi. Risospendere il pellet e lavare tre volte con buffer di fosfato di potassio da 0,1 M, pH 6,6, contenente 10 mM EDTA (Buffer 1). Il volume finale delle celle nel buffer 1 dopo la terza rotazione deve essere 10 mL.</li>
	<li>Generare vesciche a membrana all'interno e fuori dal trattamento della French Press (10,000 p.s.i.) delle cellule intatte utilizzando una cella a pressione francese da 35 mL.</li>
	<li>Prima di caricare il campione nella cella di pressione francese standard, lubrificare il pistone e gli anelli O per renderlo più facile da inserire nella cella. Nota:Queste istruzioni sono specifiche per l'uso della cella di pressione standard31.<ol><li>Avvitare con attenzione il tappo di chiusura all'estremità inferiore della cella. Assicurarsi che la cella sia a destra verso l'alto in base ai caratteri sul lato della cella. Inserire il pistone nella cella e spostarlo nella cella, fino a quando la linea di riempimento massima sul pistone raggiunge la parte superiore del pistone. Capovolgere l'unità sopra e posizionare sul supporto fornito tra i tre posti.</li>
		<li>Versare la sospensione cellulare nel corpo della cella. NOT:</</c0> Abbiamo usato solo 10 mL, quindi ci sarà molto spazio nella camera cellulare a pressione francese, che ha una capacità di 35 mL.</li>
		<li>Montare la cella di pressione standard sull'unità cellulare a pressione francese.<ol>
<li>Verificare innanzitutto che l'alimentazione sia disattivata. Sul lato sinistro del pannello c'è l'interruttore Selettore rapporto. Ha tre posizioni: Giù alla fine della corsa, Basso per l'utilizzo di una cella di pressione più piccola e Alta per l'uso con la cella di pressione francese standard. Se la stampa francese è stata utilizzata in precedenza con la cella più piccola, il pistone potrebbe non essere completamente ritrattato. Impostare questa opzione su Giù.</li>
		</ol></li>
		<li>Accendere la macchina con l'interruttore del RHS sul retro dell'unità e attivare l'interruttore Pause-Run nella posizione Di corsa. Ciò comporterà che il pistone venga completamente ritratto. Riportare l'interruttore su Pausae spegnere la macchina.</li>
		<li>Allenta le viti del pollice e sposta il morsetto di sicurezza che si estende su due colonne in acciaio inox di lato. Si snoda a destra. Con una mano che tiene la base del tappo di chiusura in posizione, scegliere la cella di pressione francese con entrambe le mani, e ruotarla di 180 gradi, quindi il pistone è ora in posizione verticale. Impostarlo sulla piattaforma, e spostare il morsetto di sicurezza in posizione in modo che questo morsetto tiene la cella di pressione francese in posizione.</li>
		<li>Si noti che l'assieme della valvola di flusso sulla spina di chiusura deve essere accessibile all'azionatore e posizionato in modo che la valvola possa essere ruotata liberamente. Aprire l'assieme della valvola di flusso con alcune curve in senso antiorario. Posizionare le braccia del pistone in modo che siano orientate in una posizione a ore due e otto. Stringere le viti dei pollici in modo che la cella di pressione standard sia tenuta in posizione.</li>
		<li>Inserire il tubo di uscita del campione nel tappo di chiusura e collegare un breve pezzo di tubo flessibile in modo che i detriti delle cellule rotte possano essere raccolti in un tubo falco. Di solito usiamo un becher pieno di ghiaccio da 300 mL per tenere il tubo del falco in posizione verticale e per mantenere i detriti cellulari refrigerati.</li>
		<li>Assicurarsi che l'opzione Pausa-Esegui sia impostata su Pausae che l'assieme della valvola sia nella posizione aperta. Riaccendere la macchina, adust l'interruttore Selettore rapporto su Alta, e girare la valvola di aumento di pressione sul pannello anteriore a destra circa mezzo giro.</li>
		<li>Il pistone inizierà a salire dalla base per passare l'aria in camera. Dirigere l'aria che esce dal tubo Tygon attaccato al tubo di uscita del campione al tubo nel becher.</li>
		<li>Quando escono le prime gocce di liquido, chiudere l'assieme della valvola di flusso ruotandolo in senso orario. Questo crea un metallo alla guarnigiorazione metallica, con la cella di pressione, in modo da non stringere eccessivamente.</li>
		<li>La parte anteriore della stampa francese ha un grafico sul pannello anteriore per generare la giusta pressione sulle cellule biologiche all'interno della cella di pressione. In questo caso, aumentare la pressione ruotando la valvola di aumento della pressione in senso orario, fino a quando il misuratore raggiunge 640 psi. Questo creerà una pressione interna di 10.000 psi.</li>
		<li>Una volta che la cella ha raggiunto la pressione di destinazione aprire leggermente l'assieme valvola di flusso ruotandolo in senso antiorario. Regolare l'apertura della valvola per consentire una portata di sole 10 gocce al min.</li>
		<li>Quando la linea di arresto sul corpo del pistone raggiunge la parte superiore della cella di flusso. Impostare l'opzione Pausa-Corsa su Pausa. Questo è fondamentale perché avere il pistone inserito più lontano nella cella danneggerà l'unità. Aprire l'assieme della valvola di flusso e raccogliere le gocce rimanenti.</li>
		<li>Impostare l'opzione Cambia Selettore rapporto su Giù, quindi impostare l'opzione Pausa esecuzione su Esegui. Quando la piastra inferiore è completamente ritratta, impostare l'interruttore Esegui su Pausae spegnere la macchina.</li>
		<li>Rimuovere la cella di pressione francese dalla pressa francese e smontare per la pulizia. Conservare tutte le parti a secco con un leggero rivestimento di glicerolo. Rimuovere e sostituire eventuali guarnizioni o guarnizioni con segni di usura.</li>
	</ol></li>
	<li>Rimuovere le cellule ininterrotte e i detriti cellulari della stampa francese eluente con la centrifugazione a 10.000 x g per 15 min a 4 gradi centigradi. Scartare il pellet e trasferire il supernatante ai tubi di ultracentrifuga.</li>
	<li>Le vesciche della membrana di pellet dal soldante risultante da ultracentrifugation a 150.000 g per 1 h a 4 gradi centigradi.</li>
	<li>Lavare le vesciche a membrana una volta, senza resuspension, in 1 mM Tris-maleate, pH 5.2 contenente 0,14 M KCl, 2 mM 2-mercaptoetanolo e 10% glicerolo e resodare nello stesso buffer (Buffer 2)23 utilizzando un grinder di tessuto Dounce. Tipicamente la frazione di membrana da 500 mL di coltura sarebbe sospesa in 5 mL di tampone, e una concentrazione di 5-10 mg di proteina/mL della membrana utilizzando il saggio di acido biochinico32.</li>
	<li>In tubi di microcentrifuga da 1,5 ml di spazio, conservare 100 aliquote di preparazione della membrana a -80 gradi centigradi.</li>
</ol>4. Western Blot e orientamento del Trasporto di Saggio
<ol><li>Lavare e risospendere le vesciche del passaggio 3.7 in 30 mM Tris pH 7.8 - 0,1 mM CoCl2.</li>
	<li>Aggiungere i campioni di 100 l, aggiungere 1 L di 2 mg/mL carboxypeptidase A in 0,1 M NaCl, 30 mM Tris, 0,2 mM CoCl2 pH 7,8.</li>
	<li>Intenere per 20 min a 20 gradi centigradi. Interrompere la digestione aggiungendo 5 , 5 M NaEDTA, 0,5 M 2-mercaptoetanolo pH 7,5.</li>
	<li>Per disattivare completamente l'enzima, incubare la soluzione per 1 h a temperatura ambiente. NOT:</</c2> Vescicolas senza il catboxypeptidase A trattamento sono stati utilizzati come un controllo.</li>
	<li>Analizzare i campioni per elettroforesi in presenza di solfato di dodecyl al litio. Aggiungere 5-10 luna di 150 mg/mL di solfato di litio dodecyl, 450 mg/mL glicerolo, 0,1 mg/mL di blu bromofenolo, 0,4 M Tris pH 7,5 a 100 - L di campione.</li>
	<li>Eseguire l'immunoblomentazione posando un filtro di nitrocellulosa inumidito con 25 mM di sodio-idrogeno fosfato pH 7.5 sul gel di poliacrilammide. Posizionarli tra due filtri di cellulosa inumidita e infine tra due cuscinetti di plastica inumiditi. Posizionare questo assemblaggio tra gli elettrodi di una camera contenente 25 mM di sodio-idrogeno fosfato pH 7,5 a 2-4 gradi centigradi.</li>
	<li>Consentire all'elettrotrasferimento delle proteine di procedere per 3 h a 20 V e 2-3 A.</li>
	<li>Bloccare la membrana di nitrocellulosa durante la notte a 2 gradi centigradi in un buffer di blocco di 0,15 M NaCl, 10 mM Tris, pH 7.5 e 0,5 mg/mL Tween 2033.</li>
	<li>Incubare il filtro di nitrocellulosa per 2 h con una diluizione di 1:5000 anti-glian (terminale C)-HRP nel buffer di bloccante (20 mL) e lavare due volte con 50 mL di tampone per un totale di 60 min.</li>
	<li>Per visualizzare l'immunoblot, sciogliere 6 mg di 4-cloro-1-naftolo in 20 mL di alcol denaturato e aggiungere 80 mL di 15 mM Tris pH 7,5 e 50 -L del 30% H2O2. Bagnare la carta da filtro nella soluzione di substrato per 20 min. Il reagente reagirà con l'anticorpo per formare un precipitato blu sulla membrana di nitrocellulosa. Quando si è sviluppato un colore sufficiente, sciacquare la membrana con acqua e lasciare asciugare.</li>
</ol>5. Saggio dei trasporti
<ol><li>Incubare 100 aliquote di vescicle di membrana a 12 gradi centigradi per 5 min.</li>
	<li>Avviare il trasporto aggiungendo poliamine radioetichettate alle vesciche della membrana ad una concentrazione finale di 50 M (se non diversamente specificato). Fare 3soluzioni H-substrate (spermide o putrescine) in un buffer di aspirato costituito da 10 mM Tris-HCl, 10 mM fosfato di potassio, pH 8.0 e 0.14 M KCl23 (Buffer 3) con modifiche a seconda del saggio.</li>
	<li>Condurre i saggi di trasporto per 1 min a 12 s in tubi di microfuge da 1,5 ml.</li>
	<li>Dopo 1 min, trasferire le miscele di reazione al collettore filtrazione e filtrare attraverso un filtro a membrana di nitrocellulosa 0,45 m.<ol>
<li>Aggiungere 3 mL di buffer di assaggio ghiacciato contenente una concentrazione superiore di 10 volte di poliammine senza etichetta seguita da 3 mL di tampone di analisi senza i poliamine per ridurre l'attacco non specifico.</li>
		<li>Trasferire i filtri lavati a 20 mL di scintillio usa e getta contenenti 10 mL di liquido scintillio e determinare la radioattività utilizzando un contatore di scintillazione liquida. Il contatore di scintillazione misura la radioattività nel campione e la segnala come disintegrazione per min (dpm).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Calcolare l'assorbimento netto della poliamina come differenza tra l'assorbimento a 1 min da vescicoli incubati a 12 gradi centigradi e l'assorbimento a 0 min da vescicoli incubati sul ghiaccio. NOT:</</c3> La massa del substrato importata nelle vesciche viene calcolata come segue. Se il volume del campione nel tubo di microfuge è di 0,2 l e la concentrazione iniziale del substrato è di 100 M, la massa totale del substrato nel tubo di microfuge è 20 x 10-12 M. A causa dell'altissima attività specifica dei substrati etichettati commercialmente (spesso 2,22 x 109 dpm/mM) la massa dell'isotopo aggiunto può essere ignorata nel calcolo. Quindi, se la quantità totale di isotopo che è stato aggiunto al tubo di microfuge era 100 x 106 dpm e le vesciche avevano un assorbimento netto di 1.000 dpm, allora la massa totale di substrato assorbita dalle vescicoli era l'1% del numero totale di talpe di substrato o 2 x 10-13 M.<ol>
<li>Determinare Km per il substrato misurando l'assorbimento di 10, 25, 50, 250 e 500 m di substrato radioetichettato in vescicoli che esprimono la proteina bersaglio. Calcolare la cinetica Michaelis-Menten utilizzando un metodo di regressione non lineare utilizzando il modello Michaelis Menton del pacchetto software statistico34.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Per gli esperimenti di competizione, aggiungere il substrato agonistico non etichettato di 100 ml, 500 m, 1 mM, 1,5 mM o 2 mM nel buffer di analisi, al tubo di microcentrifuga da 1,5 mL contenente 100 l'l di vesciccoli a 12 m.<ol>
<li>Aggiungere contemporaneamente la poliammina radioetichettata (50 m) al tubo di microcentrifuga.</li>
		<li>Misurare la radioattività intrappolata all'interno delle vesciche come accennato in precedenza ripetendo i passaggi da 5 a 5.4.2.</li>
		<li>Determinare l'apparente Km (Km,app) per i substrati competitivi misurando l'assorbimento di 10, 25, 50, 250 e 500 m di poliammina radioetichettata in presenza di 100 sottostrato non etichettato m o superiore e utilizzando un metodo di regressione non lineare per tracciare la curva.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Nel presente studio, illustreremo un metodo per la caratterizzazione di un antiportatore esprimendo prima la proteina in E. coli e poi generando vescicle a membrana, in modo che la proteina eterologamente espressa possa essere presentata in un sistema privo di cellule. Oltre alle attrezzature presenti nella maggior parte dei laboratori di biologia molecolare, questa strategia richiede l'uso di una stampa francese, un ultracentrifuga e l'accesso a una struttura per condurre saggi radioisotopi.
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Le proteine coinvolte nel traffico di metaboliti costituiscono un livello essenziale di regolazione fisiologica, ma la stragrande maggioranza dei trasportatori di membrana vegetale non è ancora stata caratterizzata funzionalmente. Sono state implementate diverse strategie per caratterizzare nuove proteine da trasporto. Espressione etetologa in organismi modello come E. coli e cellule eucariotiche come lievito, Enopus oocyte, cellule di mammiferi, cellule di insetti e cellule vegetali sono stati tutti utilizzati per determinare la loro attività di trasporto1. Le cellule eucariotiche sono favorite per l'espressione di proteine eucariotiche, perché la composizione cellulare di base, i percorsi transducivi del segnale, la trascrizione e la traduzione di macchine automatiche sono compatibili con le condizioni native.
Il lievito è stato un importante organismo modello per la caratterizzazione di nuove proteine di trasporto nelle piante. La prima proteina per il trasporto vegetale che è stata espressa con successo nel lievito (Saccharomyces pombe) è stata il trasportatore esososo HUP1 da Chlorella2. Da allora, molte proteine del trasporto vegetale sono state caratterizzate funzionalmente utilizzando un sistema di espressione del lievito. Questi includono, trasportatori di zucchero vegetale (SUC1 e SUC23, VfSUT1 e VfSTP14) e i trasportatori di auxina (AUX1 e PIN5). Svantaggi di utilizzare il lievito per esprimere le proteine vegetali possono includere l'attività alterata delle proteine plastidi-localizzate perché il lievito manca di questo organello, mistargeting6, e la formazione di aggregati piegati male e l'attivazione delle risposte allo stress nel lievito a causa della sovraespressione delle proteine della membrana7,8,9.
L'espressione etetologa delle proteine da trasporto negli evociti Xenopus è stata ampiamente utilizzata per la caratterizzazione elettrofisiologica dei trasportatori10. Le prime proteine del trasporto vegetale caratterizzate dall'espressione eteologa negli ovociti di Xenopus sono state il canale di potassio arabidopsis KAT110 e il trasportatore esaso dell'Arabidopsis STP111. Da allora, gli evociti Xenopus sono stati impiegati per caratterizzare molte proteine del trasporto vegetale come trasportatori di membrana plasmatica12, trasportatore di saccarosio vacuolare SUT413 e trasportatore vacuolar malate ALMT914. Un'importante limitazione degli evociti Xenopus per i saggi di trasporto è che la concentrazione di metaboliti intracellulari non può essere manipolata1. Inoltre, le conoscenze professionali sono necessarie per preparare gli evociti Xenopus e la variabilità dei lotti di ovociti è difficile da controllare.
L'espressione eterologa nell'organismo modello E. coli è un sistema ideale in termini di caratterizzazione di nuove proteine di trasporto vegetale. Con un genoma completamente sequenziato15, le caratteristiche molecolari e fisiologiche di E. coli sono ben note. Gli strumenti e le tecniche molecolari sono ben definiti16. Inoltre, diversi vettori di espressione, ceppi non patogeni e mutanti sono disponibili17,18,19. Inoltre, E. coli ha un alto tasso di crescita e può essere facilmente coltivato in condizioni di laboratorio. Molte proteine possono essere facilmente espresse e purificate a elevate quantità in E. coli9. Quando le proteine non possono essere analisi direttamente nei sistemi cellulari, la ricostituzione delle proteine in liposomi è stata anche un'innovazione di successo, anche se impegnativa, per la caratterizzazione delle proteine della membrana purificate. Caratterizzazione funzionale delle proteine di trasporto mitocondriali vegetali tra cui trasportatori soluti come trasportatori di fosfati in soia, mais, riso e arabidopsis, vettore dicarboxylate-tricarboxylate in Arabidopsis sono stati realizzati utilizzando questo sistema modello20,21. Tuttavia, le proteine ricombinanti della proteina pomodoro SICAT9 sono risultate non funzionali negli esperimenti di ricostituzione, e altri membri della famiglia dei trasportatori CAT sono stati trovati non funzionali nei saggi di Xenopus oocyte22. Pertanto, sono necessari ulteriori strumenti molecolari per la caratterizzazione dei trasportatori di membrana.
Cinque sistemi di trasporto della poliammina si trovano in E. coli23. Essi comprendono due trasportatori ABC che mediano l'assorbimento di spermidina e putrescina, uno scambiatore putrescina/ornitina, uno scambiatore di cadaverina/lisina, un esportatore di spermidine e un importatore di putrescina. Lo scambiatore putrescine PotE è stato originariamente caratterizzato utilizzando un saggio vescino, dove vescicoli all'interno verso l'esterno sono stati preparati da cellule liscicon con una pressa francese e misurando l'assorbimento di putrescina radioetichettata nelle vesciche in cambio di ornina24. I saggi vescicoli sono stati utilizzati anche per caratterizzare un trasportatore di calcio, che mediava il trasporto di calcio in risposta a un gradiente protonico25. Questi esperimenti ci hanno spinto a sviluppare una strategia per la caratterizzazione di altri scambiatori di poliamina. Per prima cosa abbiamo creato un ceppo di Scambiatori Di E. coli carenti in Scambiatori PotE e CadB. Qui, dimostriamo la caratterizzazione funzionale di un antiportatore di poliammina vegetale per espressione eteloga nel ceppo E. coli modificato, generazione di vesciche a membrana utilizzando una pressa francese e saggi radioetichettati.

<table><tbody><tr><td>2-mercaptoetanolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>3H-putrescina</td><td>PerkinElmer</td><td>NET185001MC</td><td></td></tr><tr><td>3H-spermidina</td><td>PerkinElmer</td><td>NET522001MC</td><td></td></tr><tr><td>4-cloro-1-naftolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8890</td><td></td></tr><tr><td>14C arginina</td><td>Moravek Inc.</td><td>MC137</td><td></td></tr><tr><td>Arginina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-5006</td><td></td></tr><tr><td>Anti-His (C-term)-HRP anticorpo</td><td>ThermoFisher</td><td>R931-25</td><td>Rileva l'etichetta C-terminale di poliistidina (6xHis), richiede il gruppo carbossilico libero per il rilevamento</td></tr><tr><td>Arabinosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3256</td><td></td></tr><tr><td>Kit per il dosaggio delle proteine BCA</td><td>ThermoFisher</td><td>23227</td><td>Pierce BCA protein asay corredo.</td></tr><tr><td>Blu di bromofenolo</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0404</td><td></td></tr><tr><td>Carbossipeptidasi B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9584-1mg</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>Sorvall</td><td></td><td>SS-34 rotore ad angolo fisso e rotore ad angolo fisso GA-6</td></tr><tr><td>Macinatore di tessuti Dounce</td><td>LabGenome</td><td>7777-7</td><td>Corning 7777-7 omogeneizzatore in pyrex con beccuccio per versare.</td></tr><tr><td>Ecoscint-H</td><td>National Diagnostics</td><td>LS275</td><td>cocktail di scintillazione</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Collettore di filtrazione</td><td>Hoefer</td><td>FH225V</td><td></td></tr><tr><td>Cella a pressione francese</td><td>Glen Mills</td><td>FA-080A120</td><td></td></tr><tr><td>GABA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2129</td><td></td></tr><tr><td>Glutammato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6904</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism software</td><td></td><td></td><td><a href="http://www.graphpad.com/prism/Prism.htm" target="_blank">http://www.graphpad.com/prism/Prism.htm</a></td></tr><tr><td>Perossido di idrogeno</td><td>KROGER</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di potassio</td><td>J.T. Baker</td><td>3040-01</td><td></td></tr><tr><td>Contatore a scintillazione liquida</td><td>Beckman</td><td>LS-6500</td><td></td></tr><tr><td>Maleate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0375</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtri a membrana in nitrocellulosa</td><td>Merck Millipore</td><td>hawp02500</td><td>0.45 &; Kit</td></tr><tr><td>di pulizia M PCR</td><td>Genscript</td><td></td><td>QuickClean II</td></tr><tr><td>Fosfato di potassio bibasico</td><td>ThermoFisher</td><td>P290-500</td><td></td></tr><tr><td>putrescina</td><td>fluka</td><td>32810</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato di potassio monobasico</td><td>J.T.Baker</td><td>4008</td><td></td></tr><tr><td>Spermidina</td><td>Sigma-aldrich</td><td>S2501</td><td></td></tr><tr><td>Ceppi: E. coli e Delta; potE740(del)::kan, &Delta; cadB2231::Tn10</td><td>Questo manoscritto</td><td>è disponibile su richiesta.</td><td>La deformazione è carente negli scambiatori di poliammine PotE e CadB.</td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>Research Products</td><td>T60040-1000</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuga</td><td>Sorvall MTX 150</td><td>46960</td><td>Thermo Fisher S150-AT rotore ad angolo fisso</td></tr><tr><td>Provette per ultracentrifuga</td><td>ThermoFisher</td><td>45237</td><td>Provette da centrifuga per rotore S150-AT</td></tr><tr><td>Vettore: pBAD-DEST49</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td>Gateway vettore di espressione per E. coli</td></tr></tbody></table>

caratterizzazione dei trasportatori a membrana di eterologous expression in e. coli e produzione di membrane

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

Sono stati sviluppati diversi metodi per caratterizzare funzionalmente nuovi trasportatori a membrana. Le poliamine sono onnipresenti in tutti gli organismi, ma gli scambiatori di poliamina nelle piante non sono stati identificati. Qui, dedichiamo un metodo per caratterizzare gli antiportatori di poliammina utilizzando vesciche di membrana generate dalla lisi delle cellule di Escherichia coli eterologicamente esprimendo un antiportatore vegetale. In primo luogo, abbiamo espresso etelogusly AtBAT1 in un ceppo E. coli carente in poliamina e trasportatori di scambio di arginina. Le vesciche sono state prodotte utilizzando una pressa francese, purificata dall'ultracentrifugazione e utilizzata in un saggio di filtrazione a membrana di substrati etichettati per dimostrare la specificità del substrato del trasportatore. Questi saggi hanno dimostrato che AtBAT1 è un trasportatore mediato da protoni di arginina, acido z-aminobutyrico (GABA), putrescina e spermide. Il ceppo mutante sviluppato per il saggio di AtBAT1 può essere utile per l'analisi funzionale di altre famiglie di scambiatori di poliammina vegetale e animale. Ipotizziamo anche che questo approccio possa essere utilizzato per caratterizzare molti altri tipi di antiportatori, purché queste proteine possano essere espresse nella membrana cellulare batterica. E. coli è un buon sistema per la caratterizzazione di nuovi trasportatori, dal momento che ci sono diversi metodi che possono essere impiegati per mutagenizzare i trasportatori nativi.

I passaggi principali in questo protocollo sono riepilogati in cifritàin Figura 1 . In breve, le cellule E. coli carenti in tutti gli scambiatori di poliammina ed esprimono AtBAT1 sono coltivate, centrifuse, lavate con un tampone e sottoposte a lisi cellulare utilizzando una pressa francese. La lisi tende a produrre vesciche che sono per lo più dentro e fuori e intrappolare il buffer al di fuori delle cellule. I detriti cellulari vengono rim...

Descriviamo un metodo per la caratterizzazione dei trasportatori a membrana protonica in preparati a vescicolo a membrana prodotti dall'espressione etesologa in E. coli e lisi di cellule che utilizzano una pressa francese.

Caratterizzazione dei trasportatori a membrana di Eterologous Expression in E. coli e produzione di membrane

Several methods have been developed to functionally characterize novel membrane transporters. Polyamines are ubiquitous in all organisms, but polyamine ...

Uno dei principali vantaggi di questa tecnica per caratterizzare i trasportatori a membrana è che è possibile determinare l'affinità relativa del trasportatore per substrati specifici, nonché ottenere informazioni sul meccanismo di trasporto. La caratterizzazione delle proteine di membrana che utilizzano gradienti proteici per guidare il trasporto del substrato è particolarmente adatta per questo saggio di vescicola inside-out che dimostriamo qui. Mentre questo saggio richiede alcune attrezzature specializzate come una stampa francese e l'accesso a un ultracentrifugo, pensiamo che possa essere tecnicamente più facile di saggi che richiedono la ricostituzione dei trasportatori a membrana in liposomi artificiali.Il vantaggio principale di questa tecnica è che ci consente di quantificare le affinità relative per diversi substrati e fare saggi di competizione per testare l'effetto dei substrati concorrenti sulle griglie di trasporto. Nel caso del trasportatore BAT1 utilizzato per illustrare questo saggio, siamo stati anche in grado di mostrare l'attivazione del substrato del trasportatore da parte dell'arginina. Per iniziare questa procedura, coltura le cellule mutanti E.coli preparate che esprimono la proteina bersaglio inoculando una singola colonia in cinque millilitri di poliammina 3 media con antibiotici appropriati e coltivarla durante la notte a 37 gradi Celsius.Il giorno dopo, trasferire questa coltura a 500 millilitri di poliammina fresca 3 media che viene integrata con 0,0002%arabinosi e crescere fino a quando la coltura cellulare raggiunge un OD600 compreso tra 0,6 e 0,8. Dopo questo, centrifuga a 2000 volte G e a quattro gradi Celsius per 15 minuti per raccogliere il pellet cellulare. Sospendere di nuovo il pellet e lavarlo tre volte con tampone uno centrifugando a 2000 volte G e a quattro gradi Celsius per 15 minuti ogni volta.Il volume finale delle celle nel buffer uno dopo il terzo giro dovrebbe essere di 10 millilitri. Impostare una cella a pressione francese da 35 millilitri e versare la sospensione cellulare nel corpo della cellula. Accendere la macchina con l'interruttore RHS sul retro dell'unità e impostare l'interruttore del selettore del rapporto su alto.Accendere l'interruttore della pompa. Il pistone inizierà a salire dalla base per spostare l'aria nella camera. Aumentare la pressione ruotando la valvola di aumento della pressione in senso orario fino a quando il misuratore raggiunge 640 PSI.Questo creerà una pressione interna di 10.000 PSI. Una volta che la cella ha raggiunto la pressione target, aprire leggermente l'assieme della valvola di flusso ruotandolo in senso antiorario. Regolare l'apertura della valvola per consentire una portata di soli circa 10 gocce al minuto.Quando la linea di arresto sul corpo del pistone raggiunge la parte superiore della cella di flusso, spegnere l'interruttore della pompa. Abbassare la piastra inferiore posizionando l'interruttore del selettore del rapporto verso il basso e quindi, impostando l'interruttore della pompa. Quando la piastra inferiore è completamente retratta, ridurre la pressione del sistema a zero ruotando la valvola di aumento della pressione completamente in senso antiorario.Spegnere l'interruttore della pompa e spegnere la macchina. Centrifuga la pressa francese eluente a 10.000 volte G e a quattro gradi Celsius per 15 minuti per rimuovere cellule ininterrotte e detriti cellulari. Scartare il pellet e trasferire il supernatante in tubi ultracentrifugo.Ultracentrifugare il supernatante risultante a 150.000 volte G e a quattro gradi Celsius per un'ora per pellettizzare le vescicole della membrana. Lavare le vescicole della membrana una volta senza ri-sospensione nel tampone due. Quindi, utilizzare una smerigliatrice di tessuto Dounce per sospendere di nuovo le vescicole della membrana nel tampone due.Preparare 100 aliquote microlitri dei preparati a membrana in tubi di centrifuga da 1,5 millilitri e conservarli a meno 80 Celsius. In primo luogo, lavare e sospendere di nuovo le vescicole in 30 millimolare di Tris a pH 7,8, che contiene 0,1 millimolare di cloruro di cobalto II. Aggiungere un microlitro di carbossipeptidasi A in cloruro di sodio, Tris e cloruro di cobalto II a ogni campione di 100 microliter.Incubare a 20 gradi Celsius per 20 minuti. Aggiungere cinque microlitri di una soluzione contenente EDTA di sodio e 2-mercaptoetanolo a PH 7,5 per interrompere la digestione. Incubare la soluzione a temperatura ambiente per un'ora per inattivare completamente l'enzima.Successivamente, aggiungere da cinque a 10 microlitri di una soluzione contenente solfato di dodecil di litio, glicerolo, blu bromofenolo e Tris a pH da 7,5 a 100 microlitri del campione e analizzare i campioni per elettroforesi. Per eseguire l'aminoblotting, posare un filtro di nitrocellulosa inumidito con fosfato di idrogeno di sodio da 25 millimolare sul gel di poliacrilammide. Posizionare questi tra due filtri di cellulosa inumiditi e, infine, tra due tamponi di plastica inumiditi.Posizionare questo assemblaggio tra gli elettrodi di una camera contenente 25 millimolare di sodio idrogeno fosfato ad una temperatura compresa tra due e quattro gradi Celsius. Elettrotrasferare le proteine a 20 volt e a due o tre ampere per tre ore. Bloccare la membrana della nitrocellulosa nel tampone di blocco durante la notte a due gradi Celsius.Il giorno successivo, incubare la nitrocellulosa a 20 millilitri da uno a 5.000 diluizione dell'anticorpo HRP anti-terminale C e tampone di blocco per due ore e lavare due volte con 50 millilitri di tampone per un totale di 60 minuti. Per visualizzare l'ammino macchia, sciogliere sei milligrammi di 4-cloro-1-naftolo in 20 millilitri di alcol denaturato e aggiungere 80 millilitri di Tris millimolare e 50 microlitri di perossido di idrogeno al 30%. Bagnare la carta filtrante in questa soluzione di substrato per 20 minuti.Quando si è sviluppato un colore sufficiente, sciacquare la membrana con acqua e lasciare asciugare. Per iniziare, incubare l'aliquota di 100 microliter delle vescicole di membrana a 12 gradi Celsius per cinque minuti. Aggiungere il tampone 3 contenente poliammine radioetichettate ad una concentrazione finale di 50 micromolari alle vescicole di membrana in tubi microcentrifugo da 1,5 millilitri per avviare il trasporto.Condurre il saggio di trasporto a 12 gradi Celsius per un minuto. Successivamente, trasferire le miscele di reazione al collettore di filtrazione e filtrarlo attraverso un filtro a membrana di nitrocellulosa da 0,45 micrometri. Aggiungere tre millilitri di tampone di dosaggio ghiacciato contenente una concentrazione dieci volte superiore di poliammine non etichettate, seguiti da tre millilitri di tampone di dosaggio senza le poliammine per ridurre il legame non specifico.Trasferire i filtri lavati su flaconcini a scintillazione usa e getta da 20 millilitri contenenti 10 millilitri di liquido scintillante e utilizzare un contatore di scintillazione liquida per determinare la radioattività. Calcolare l'assorbimento netto di poliammina come descritto nel protocollo di testo. Determinare il Km per il substrato misurando l'assorbimento del substrato radioetichettato nelle vescicole che esprimono la proteina bersaglio e calcolare la cinetica di Michaelis-Menten usando un metodo di regressione non lineare.Per gli esperimenti di competizione, aggiungere il substrato competitivo non etichettato realizzato nel tampone di dosaggio al tubo di centrifuga contenente 100 microlitri di vescicole a 12 gradi Celsius, aggiungendo contemporaneamente 50 micromolare della poliammina radioetichettata. Misurare la radioattività intrappolata all'interno delle vescicole come descritto in precedenza. Determinare un KM padre per i substrati competitivi misurando l'assorbimento delle poliammine radioetichettate e la presenza di 100 substrati micromolari o non etichettati superiori e utilizzare un metodo di regressione non lineare per tracciare la curva.In questo studio, un anti-porter è caratterizzato prima dall'espressione della proteina in E.coli, e poi, generando vescicole di membrana in modo che la proteina espressa eterologamente possa essere saggiata in un sistema privo di cellule. Una macchia occidentale viene utilizzata per verificare che l'AtBAT1 sia traslocato in vescicola. Sondare la macchia con un anticorpo anti-his C-terminale ha rivelato una proteina costrutto di fusione che è di circa 72,3 kilodaltoni.La digestione delle vescicole prima di SDS-PAGE ha comportato una diminuzione, ma non una completa perdita del segnale della sonda. A 12 gradi Celsius, l'assorbimento di uno spermidina radioetichettato dalle vescicole è più alto a un minuto ed è rimasto lineare per tre minuti. Pertanto, il tempo di incubazione per il saggio di trasporto è fissato a un minuto.Dopo un minuto, non c'è assorbimento netto di isotopo da vescicole di membrana che sono state preparate e conservate a pH 8.0 in quanto non esiste un gradiente di protone attraverso la membrana vescicolare. Per dimostrare l'effetto della dissipazione del gradiente protonico artificiale, le vescicole di membrana vengono incubate in tampone di pH 8.0 per 10 minuti prima dell'aggiunta del substrato etichettato, portando ad un assorbimento minimo del substrato radioetichettato. Nel complesso, questi risultati indicano che l'assorbimento di spermidina guidato da protoni è dovuto alla proteina BAT1.Per determinare la specificità del substrato della proteina, i valori di Km vengono calcolati misurando l'assorbimento del substrato radioetichettato a diverse concentrazioni. I valori di Km per spermidina, putrescina e arginina indicano che questa proteina è uno scambiatore di poliammina e arginina ad alta affinità. L'affinità del trasportatore per un particolare substrato può anche essere determinata indirettamente utilizzando saggi di concorrenza.Questi test rivelano che GABA è un inibitore competitivo dello spermidina. Inoltre, la misurazione dell'assorbimento di 50 micromolari di spermidina radioetichettata in presenza di concentrazioni variabili di diversi amminoacidi rivela che l'AtBAT1 è anche in grado di trasportare glutammato e alanina a concentrazioni millimolari. Quando si esegue questa procedura, l'integrazione del trasportatore di membrane nella membrana batterica è, ovviamente, critica.La verifica che la proteina di interesse sia integrata nella membrana può essere eseguita utilizzando anticorpi diretti contro i tag del terminale C. La variazione genetica dei trasportatori umani può influenzare il trasporto di, sia, metaboliti che farmaci che sono substrati del particolare trasportatore. Pertanto, la variazione allelica può influenzare, sia, l'assorbimento e l'escrezione di droghe.Molte varianti alleliche possono essere rapidamente realizzate mediante mutagenesi diretta lateralmente del gene trasportatore in un vettore di espressione. I test funzionali di queste varianti possono quindi essere testati in condizioni molto controllate utilizzando saggi vescicolari interni. I trasportatori a membrana costituiscono da otto a 10 di tutte le proteine e la maggior parte non è stata caratterizzata completamente in nessuno degli organismi modello.I trasportatori localizzati nelle membrane organelle sono particolarmente difficili da caratterizzare per espressione eterologo nelle cellule eucariotiche. Se il tipo di scambio o i trasportatori mediati da protoni possono essere localizzati in questa membrana E.coli, questi trasportatori possono essere funzionalmente caratterizzati utilizzando questo saggio in vitro. La qualità e la resa delle vescicole sono influenzate dal tasso di eluizione dei frammenti cellulari della stampa francese.Nel fare saggi di trasporto di vescicole con isotopi, è importante avere una configurazione sperimentale che faciliti la ricerca di repliche sperimentali. Ci sono molti modi per farlo, ma pensiamo che sarà utile per noi mostrarvi come lo abbiamo fatto.

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