Isolamento di sottoinsiemi di macrofaschi e cellule stromali da esemplari di miocardio umano e topo
17 dicembre 2019
Presentato qui è un protocollo per isolare vari sottoinsiemi di macrofagi e altre cellule non immuni dal miocardio umano e topidano preparando una sospensione a singola cellula attraverso la digestione enzimatica. Vengono inoltre presentati schemi di Gating per l'identificazione e la caratterizzazione basata sulla citometria del flusso di macrofagi.
Il cuore contiene una popolazione eterogenea di cellule immunitarie che svolgono ruoli cruciali nell'infiammazione cardiaca e nella riparazione. Per comprendere l'eterogeneità delle cellule immunitarie e ottenere ulteriori informazioni sulla loro funzione, è importante avere un metodo che consenta il recupero di queste cellule dal cuore. Questa tecnica può aiutare a scoprire la diversità cellulare immunitaria e nonimmune che risiede nel cuore sano o mato.
Ci sono tre vantaggi principali in questa tecnica. Innanzitutto, è un semplice flusso di lavoro singolo che porta alla generazione di sospensioni a cella singola di vari tipi di celle entro tre ore dal termine. In secondo luogo, porta ad un elevato recupero di popolazioni cellulari immunitarie e non immuni vitali.
E in terzo luogo, è un metodo molto versatile e può essere applicato anche ai tessuti cardiaci di altre specie. Prestare attenzione alla quantità di tessuto utilizzato per una singola reazione di digestione è importante. Utilizzare forbici sterili, sezionare il campione di tessuto dalla parete apicale o laterale del ventricolo sinistro in soluzione salina fredda o HBSS.
Sezionare con cura il grasso epicardiale e le tendinee delle chordae dall'esemplare. Con l'aiuto di una lama sterile o forbici, sezionare i pezzi di tessuto in pezzi del peso di circa 200 milligrammi. Dopo aver eutanasiato il topo, aprire la cavità toracica con l'aiuto di forbici affilate.
Usa hemostat smussati per sollevare il cuore verso l'alto. Perfondere il cuore con PBS freddo utilizzando un ago calibro 25 attaccato a una siringa da cinque millilitri. Perfondi fino a quando il cuore appare sbiancato a colori.
Rimuovere il cuore e posizionare in una piastra di Petri sterile sul ghiaccio. Mettere 200 milligrammi di pezzi di tessuto cardiaco umano o cuore murino in una piastra di Petri sterile. Tritare finemente il tessuto usando una lama sterile o forbici.
Per impostare la digestione, in un tubo conico da 15 millilitri, preparare un volume finale di digestione di tre millilitri per ogni pezzo di tessuto cardiaco umano o un cuore murino con enzimi collagenasi I, DNasi I e ialuronidasi a concentrazioni di 450, 60 e 60 unità per millilitro. Aggiungere 2,5 millilitri di DMEM nel tubo. Con l'aiuto di forcelle pulite, posizionare il tessuto finemente tritato in ogni tubo di reazione.
Mescolare bene con un vortice delicato. Digerire per un'ora a 37 gradi Celsius in un incubatore di scuotimento impostato a una velocità di agitazione da bassa a media. Dopo un'ora di digestione, eserti i tubi dall'incubatrice e posizionare sul ghiaccio.
Impostare tubi conici da 50 millilitri con un colino a celle da 40 micron sopra. Bagnare i filtri con due millilitri di tampone disattivante enzimatico. Successivamente, disattivare gli enzimi di digestione aggiungendo otto millilitri di tampone di disattivazione enzimatico a ciascun tubo di digestione.
Quindi versare i 13 millilitri risultanti della miscela totale attraverso il filtro cellulare da 40 micron nei tubi conici da 50 millilitri. Trasferire i campioni filtrati in tubi conici freschi da 15 millilitri. Ruotare i campioni a 400 volte g per sei minuti a quattro gradi Celsius.
Scartare il supernatante lasciando 0,5 millilitri di supporti. Rimescolare il pellet di cella mediante pipettazione delicata e aggiungere un millilitro di tampone di llisi ACK. Ruotare delicatamente il tubo e incubare a temperatura ambiente per cinque minuti per eseguire la lisi dei globuli rossi.
Dopo cinque minuti nel buffer ACK, aggiungere nove millilitri di DMEM al campione. Riposizionare il coperchio sui tubi e invertire delicatamente i tubi da mescolare. Filtrare attraverso un colino a celle da 40 micron e raccogliere il filtrato in tubi conici da 15 millilitri.
Centrifugare i tubi a 400 volte g per sei minuti e scartare il supernatante. Aggiungere un millilitro di tampone FACS e rimospendare il pellet. Quindi trasferirlo in un tubo di microcentrifugo da 1,5 millilitri.
Centrifugare di nuovo a 400 volte g per cinque minuti. Scartare il supernatante e rimescolare il pellet in 100 microlitri di tampone FACS. Una sospensione a singola cellula è ora pronta per la colorazione degli anticorpi.
Aggiungere un tipico pannello anticorpale umano ai campioni cardiaci a una o 50 diluizione. Utilizzare diversi anticorpi per cellule stromali e macrofagi cardiaci murini. Incubare per 30-40 minuti a quattro gradi Celsius al buio.
Aggiungere un millilitro di tampone FACS, vortice delicatamente e centrifuga a 400 volte g per cinque minuti. Ripetere questo passaggio di lavaggio una seconda volta. Quindi rimospendare il campione in 350 microlitri di tampone FACS e aggiungere DAPI per raggiungere una concentrazione finale di un micromolare.
I campioni sono ora pronti per l'analisi FACS. In questo protocollo è stato raggiunto l'isolamento dei macrofagi dal topo e dal miocardio umano. Questa figura mostra il nucleo LVAD umano non elaborato ed elaborato.
Sono stati presentati lo schema di gating per lo smistamento del flusso dei macrofagi umani negativi CCR2 e CCR2 dal miocardio umano e per le cellule stromali negative CD45 dalla cardiomiopatia ischemica umana. Le immagini delle FACS macchiate di Wright ordinate CD45 positive e CD45 negative mostrano una membrana cellulare intatta che indica la vitalità. Anche lo schema di gating per ordinare i macrofagi da un cuore di topo ebbe successo.
Il peso del tessuto utilizzato per la reazione enzimatica è fondamentale per una digestione efficiente. Utilizzare non più di 200 milligrammi di tessuto per le concentrazioni enzimatiche indicate nel protocollo. Seguendo questo metodo, le cellule possono essere coltivate per saggi di stimolazione in vitro.
Le celle possono essere ordinate per il sequenziamento dell'RNA di massa o il sequenziamento a singola cella. Questo metodo è servito come tecnica inestimabile per scoprire l'eterogeneità del macrofago precedentemente non riconosciuta presente nel cuore umano sano o mato. Utilizzando questo metodo seguito dal sequenziamento a singola cellula, sono in corso studi per scoprire come varie cellule immunitarie e non immuni variano dal cuore mato rispetto al cuore sano.
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Panoramica
Questo protocollo descrive un metodo per isolare diverse sotto-popolazioni di macrofagi e cellule non immunitarie dal miocardio umano e murino. Preparando una sospensione di singole cellule mediante digestione enzimatica, i ricercatori possono approfondire la comprensione dell'eterogeneità delle cellule immunitarie nell'infiammazione e nella riparazione cardiaca.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia cardiovascolare
- Immunologia
Sfondo
- Il cuore contiene una popolazione diversificata di cellule immunitarie.
- Queste cellule svolgono ruoli cruciali nell'infiammazione e nella riparazione cardiaca.
- Comprendere la loro eterogeneità è essenziale per lo studio della salute cardiaca.
- Questa tecnica facilita il recupero sia di cellule immunitarie che non immunitarie dal cuore.
Scopo dello studio
- Isolare e caratterizzare macrofagi e altri tipi cellulari dal miocardio.
- Individuare la diversità delle cellule immunitarie e non immunitarie nei cuori sani e malati.
- Fornire un metodo affidabile per lo studio delle risposte immunitarie cardiache.
Metodi Utilizzati
- Digestione enzimatica per preparare sospensioni di singole cellule.
- Citometria a flusso per l'identificazione e la caratterizzazione delle cellule.
- Isolamento di diversi tipi cellulari dal miocardio umano e murino.
- Flusso di lavoro semplice completato entro tre ore.
Risultati principali
- Alto recupero di popolazioni cellulari immuni e non immuni vitali.
- Isolamento efficace di sottogruppi di macrofagi.
- Dimostrata eterogeneità delle cellule immunitarie nel tessuto cardiaco.
- Agevolazione di ulteriori ricerche sui meccanismi di infiammazione e riparazione cardiaca.
Conclusioni
- Questa tecnica fornisce uno strumento prezioso per la ricerca cardiaca.
- Migliora la comprensione del ruolo delle cellule immunitarie nella salute cardiaca.
- Studi futuri potranno sfruttare questo metodo per esplorare le malattie cardiache.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Comprendere l'eterogeneità dei macrofagi nel tessuto cardiaco è fondamentale per ridurre i rischi nella validazione degli obiettivi nella scoperta di farmaci cardiovascolari. Questo protocollo consente l'isolamento riproducibile di sottogruppi immunitari e stromali dal miocardio umano e murino, supportando studi meccanicistici che informano sulla fiducia nell'obiettivo e sulla priorizzazione del portafoglio. La semplicità del metodo e la sua applicabilità interspecie migliorano la continuità traslazionale dalla scoperta alla validazione preclinica.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi delle funzioni dei sottoinsiemi di macrofagi nelle vie di infiammazione e riparazione cardiaca.
- Valore operativo: Fornisce un flusso di lavoro standardizzato per l'isolamento di cellule immunitarie e non immunitarie vitali, con minima variabilità da giorno a giorno.
- Valore strategico: Supporta la validazione di bersagli basata su ipotesi chiarificando i contributi cellulari ai fenotipi della malattia.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera popolazioni cellulari purificate adatte per saggi funzionali e applicazioni omiche successive.
- Valore operativo: Consente un'elevata resa di cellule vitali entro un flusso di lavoro di tre ore, permettendo la standardizzazione dei saggi.
- Valore strategico: Facilita la preparazione scalabile di sistemi pertinenti alla malattia per lo screening di composti e studi sull'interazione con i bersagli.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Consente il confronto diretto dei profili di cellule immunitarie e stromali tra cuori umani sani e malati.
- Valore operativo: Compatibile con il sequenziamento dell'RNA su bulk e su singola cellula per la scoperta di biomarcatori e la riduzione dei rischi meccanicistici.
- Valore strategico: Supporta decisioni di avanzamento ponderate sul rischio, collegando fenotipi cellulari a stati patologici attraverso diverse specie.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla validazione del bersaglio alla ricerca preclinica, consentendo l'isolamento di tipi cellulari meccanicamente rilevanti per analisi funzionali e genomiche.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi mediante l'isolamento di specifici sottoinsiemi di macrofagi e stromali.
- Screening: Produce sospensioni cellulari standardizzate e vitali adatte allo sviluppo di saggi e allo screening di composti.
- Analisi: Genera input quantitativi per citometria a flusso, sequenziamento e letture funzionali che permettono l'analisi comparativa tra diverse condizioni.
- Ricerca traslazionale: Collega le scoperte alla continuità preclinica attraverso l'applicabilità interspecie e l'utilizzo di campioni pertinenti alla malattia.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per il profilo immunitario in modelli di malattie cardiovascolari e in diverse aree terapeutiche.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva riducendo l'ambiguità meccanicistica nella patologia cardiaca mediata dal sistema immunitario.
- Valore operativo: Garantisce riproducibilità e scalabilità grazie a un flusso di lavoro semplice ed efficiente in termini di tempo.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione dello sviluppo fornendo una valutazione precoce del rischio biologico relativamente ai bersagli cardiovascolari.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione aggiustata in base al rischio, basata su meccanismi cellulari validati in modelli di malattia umana e murina.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella dissociazione enzimatica dei tessuti, nella citometria a flusso e nella manipolazione sterile delle cellule.
- Dipende dall'accesso a collagenasi I, DNasi I, ialuronidasi, tampone lisante ACK e strumentazione compatibile con la FACS.
- Necessita di protocolli standardizzati di dissezione del tessuto (ad esempio, frammenti di 200 mg del ventricolo sinistro apicale/laterale) per garantire l'efficienza della digestione.
- Richiede l'adattamento di pannelli di anticorpi per marcatori specifici di macrofagi e cellule stromali in base alla specie (ad esempio, CCR2 per gli esseri umani, CD45 per i topi).
- È limitato dalla qualità e quantità del tessuto in ingresso; rese subottimali possono verificarsi con campioni fibrotici o calcificati.
