Name: Un modello di lesione polmonare acuta autolimitata dallinstillazione unilaterale dellacido intra-bronchiale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-30T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 s
Description: Scopri un modello di lesione polmonare acuta autolimitata mediante instillazione unilaterale di acido intra-bronchiale nel topo. Questo metodo riproduce l'ARDS umano da aspirazione gastrica per studiare la risoluzione dell'infiammazione.

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Gli autori desiderano ringraziare il Dr. Joseph Mizgerd per i suoi contributi allo sviluppo del metodo intra-bronchiale selettivo e per i suoi utili commenti e recensioni del manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto da National Institutes of Health grants P01GM095467 (B.D.L.) e K08HL130540 (R.E.A.).

Tutte le procedure sugli animali riportate di seguito sono state riviste e approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali presso il Brigham and Women's Hospital (Protocollo #2016N000356).
 NOT:</</c0> La tecnica sterile è stata seguita per tutte le procedure di sopravvivenza. Un campo sterile è stato istituito per ogni intervento chirurgico utilizzando un asciugamano drappeggio sterile, mentre i chirurghi indossavano guanti chirurgici sterili, tappi, maschere e cappotti da laboratorio puliti. Tutti gli strumenti chirurgici sono stati sterilizzati utilizzando un'autoclave, e la sterilità è stata mantenuta utilizzando uno sterilizzatore di perline.
1. Preparazione di 0,1 N HCl
<ol><li>Aggiungere 11 mL di ddH2O ad una bottiglia di vetro d'ambra. Aggiungere lentamente 1 mL di 37% HCl (12 N) per creare un 1 N N HCl di lavoro. ATTENZIONE: Assicurarsi che HCl sia aggiunto in acqua. Questo è un problema di sicurezza perché l'aggiunta di acqua direttamente all'acido può causare acido a bollire e spruzzi fuori dalla bottiglia. Quando si tratta di HCl concentrato, assicurarsi che l'acido sia tenuto in un cappuccio chimico ventilato e che venga indossato l'attrezzatura protettiva personale appropriata, tra cui camice da laboratorio, guanti e occhiali di sicurezza.</li>
	<li>Aggiungere lentamente 4 mL del supporto di lavoro HCl precedentemente diluito in 35 mL di ddH2O in un tubo conico da 50 mL per creare uno stock sperimentale di 0,1 N HCl.</li>
	<li>Misurare il pH del supporto sperimentale utilizzando una sonda a pH elettronica dopo la calibrazione a due punti utilizzando soluzioni a basso pH. È possibile utilizzare le soluzioni di stock NaOH o HCl in base alle esigenze, in modo che il volume finale sia di 40 mL. NOT:</</c5> Misurare i valori di pH bassi può essere difficile. Per garantire una misurazione accurata, assicurarsi che la sonda pH sia calibrata correttamente utilizzando standard di pH bassi per evitare un'eccessiva estrapolazione della misurazione.</li>
	<li>Immediatamente prima dell'esperimento, filtrare 1–2 mL dello stock sperimentale HCl attraverso un filtro sterile da 0,22 m in un tubo sterile di microcentrifuga.</li>
</ol>2. Instillazione intra-bronchiale selettiva di HCl
<ol><li>
Preparazione dell'area chirurgica
	<ol>
<li>Indurre l'anestesia generale fornendo una miscela di ketamina (100 mg/kg) e xilosina (10 mg/kg) mediante iniezione intraperitoneale. Assicurarsi che il mouse sia completamente aerato stringendo delicatamente la punta della coda o del piede posteriore. La mancanza di risposta al ritiro è necessaria prima di fare un'incisione cutanea.  Amministrare l'anestesia aggiuntiva boluses, se necessario.</li>
		<li>Consegnare 0,1 mg/kg di buprenorfina sottocutaneamente sotto la mischia del collo. L'analgesico pre-operatorio rafforzerà l'effetto dell'anestesia e migliorerà il dolore pre e post-operatorio derivante dalla procedura.</li>
		<li>Utilizzare clipper elettrici per radere delicatamente l'area chirurgica sulla superficie ventrale del mouse, sotto il mento nella regione cervicale della gola, utilizzando tratti verso il basso lenti. Rimuovere la pelliccia sciolta per esporre completamente la pelle sottostante.</li>
		<li>Preparare l'area chirurgica tamponando il sito rasato con 10% povidone-iodio soluzione. Dopo aver applicato la soluzione asettica, pulire il sito utilizzando un tampone alcolico isopropile 70%. Ripetere questo passaggio 3x.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Isolamento della trachea
	<ol>
<li>Posizionare il topo in una posizione supina su una scheda chirurgica pulita e coprire il topo in un drappo chirurgico sterile mantenendo l'esposizione dell'area chirurgica. Fissare il drappo in posizione.</li>
		<li>Fare un 0,5 cm incisione longitudinale nella pelle sopra la trachea e le ghiandole salivari. Utilizzare pinze seghettate leggermente curve per tirare indietro la pelle e separare delicatamente le ghiandole salivari per esporre i muscoli tracheali.</li>
		<li>Utilizzando pinze seghettate per dissezione smussata, spingere delicatamente a parte i muscoli paratracheali e prendere in giro la fascia che circonda la trachea fino a quando gli anelli cartilaginesi della trachea sono completamente esposti.</li>
		<li>Utilizzare pinze seghettate completamente curve per sollevare la trachea e separare il tessuto connettivo tra la retro-trachea e la retro-fascia. Una volta staccato il tessuto connettivo, la punta delle pinze dovrebbe scivolare completamente dietro la trachea.</li>
		<li>Mantenere le pinze curve dietro la trachea e afferrare un pezzo di 10-15 cm di sutura di seta intrecciata 4-0 con le punte delle pinze. Tirare la sutura dietro la trachea in modo che ci sia una lunghezza uniforme su entrambi i lati.</li>
		<li>Una volta che la sutura è in posizione, tirare delicatamente i lati della sutura verso la parte posteriore del mouse e tenere i lati in posizione.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Cannulando selettivamente il bronco principale sinistro e instillando HCl
	<ol>
<li>Prendere un angiocateter 24 G x 3/4" e inserire l'ago, smussare, nella regione anteriore della trachea tra il primo e il secondo anello tracheale. Una volta che il corretto inserimento è confermato dalla visualizzazione diretta della punta dell'ago nel lume tracheale, rilasciare la sutura e far avanzare la cannula sopra l'ago e nella trachea fino a raggiungere la resistenza, quindi ritirare l'ago. Angolare la direzione di inserimento verso il bronco stelo principale sinistro per l'instillazione selettiva nel polmonesinistro.</li>
		<li>Una volta che la cannula è in posizione, afferrare saldamente la porta di iniezione per evitare che il catetere si sposti.</li>
		<li>Utilizzando una pipetta P200 e punte sterili di pipetta P200, instillare 2,5 mL/kg (50 mL per un mouse da 20 g) di sterile filtrato 0,1 N HCl nel catetere, seguito da un identico volume d'aria.</li>
		<li>Ritirare rapidamente il catetere e sollevare la scheda chirurgica ad un angolo di 60 gradi per 30 s.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Chiusura dell'area chirurgica
	<ol>
<li>Disporre la scheda chirurgica e rimuovere la sutura da dietro la trachea.</li>
		<li>Utilizzare sutura in seta intrecciata rivestita a 4-0 cera per chiudere l'incisione cutanea con punti da 2 a 3 punti.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Assistenza post-operatoria
<ol><li>Una volta chiusa l'incisione, posizionare il mouse sul lato sinistro su una piastra di riscaldamento calda fino a quando il mouse si riprende dall'anestesia. Iniziare a monitorare il mouse per il dolore e il livello di attività prima di riportarlo al normale alloggiamento. NOT:</</c1> La buprenorfine deve essere somministrata a 0,1 mg/kg sottocutaneamente ogni 6-12 h per le prime 24 h. Se il dolore progressivo persistente è presente, estendere il regime analgesico fino a quando il dolore si placa.</li>
</ol>4. Lavazio Bronchoalveolar integrale (BAL) e immunophenotyping Leukocito intero
<ol><li>
Eutanasia del topo somministrando 3 volte la dose di chetamina/xilolazina utilizzata nel passo 2.1.1.
	<ol>
<li>Per differenziare i neutrofili interstiziali e intravascolari, iniettare per via endovenosa un anticorpo Ly6G con etichetta fluoroforo selezionato 5 min prima dell'eutanasia. Questa etichetta dovrebbe essere adatta per il rilevamento da citometria di flusso per distinguere i neutrofili intravascolari dai neutrofili interstiziali e alveolari polmonari, che saranno etichettati durante la preparazione dei tessuti con un fluophore diverso (vedi sotto).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Posizionare il mouse su una scheda chirurgica e agganciare gli incisivi anteriori intorno a un anello di sutura di seta intrecciata 2-0.</li>
	<li>Seguire i passaggi 2.2.2–2.2.6. per preparare la trachea per la cannulation. NOT:</</c3> Assicurarsi che il diaframma non sia forato per massimizzare la pressione gonfiatrice trans-alveolar durante la lavanda polmonare; la conformità polmonare lasciata diminuisce in seguito a lesioni, che possono richiedere un più alto requisito di pressione trans-alveolar per la lavanda polmonare.</li>
	<li>Cannula la trachea dopo il passo 2.3.1, ma non far avanzare il catetere sotto la carina; inserire il catetere parallelo alla trachea.</li>
	<li>Con il catetere inserito, legare la sutura intorno alla trachea per tenere il catetere in posizione.</li>
	<li>Instillare e ritirare due mL consecutivi di PBS -/- ghiacciato (senza magnesio o calcio) con aliquota di 0,6 mM EDTA utilizzando una siringa da 1 cc. Per l'immunofenotipizzazione per citometria di flusso, rimuovere ogni aliquota e tornare a un tubo FACS in polistirolo da 5 mL sul ghiaccio.</li>
	<li>Per garantire l'eutanasia, eseguire una toracotomia utilizzando forbici chirurgiche seguite da puntura cardiaca. I polmoni possono essere raccolti per un'ulteriore lavorazione.</li>
	<li>Centrifugare il BAL per 10 min a 800 g a 4 gradi centigradi per pelletare le cellule.</li>
	<li>Decant il supernatante in un tubo di microcentrifuga da 2 mL e in tubi di microcentrifuga da 1,5 ml. Conservare a -80 gradi centigradi per l'analisi successiva.</li>
	<li>Risospendere il pellet cellulare in PBS -/- con 2% FBS per l'analisi differenziale leucocite per citometria di flusso.</li>
	<li>Per differenziare i neutrofili interstiziali e intravascolari, rimuovere separatamente il polmone sinistro e destro ed elaborare i polmoni per la citometria del flusso come in Abdulour et al. 20146.</li>
	<li>Macchiare la sospensione cellulare risultante utilizzando anticorpi FACS selezionati, assicurandosi di macchiare per Ly6G che è coniugato con un fluoroforo diverso rispetto all'anticorpo Ly6G dal punto 4.1.1.</li>
</ol>5. Valutazione della permeabilità della barriera alveolare utilizzando la tinture blu di Evan (EBD)
<ol><li>Intravenosamente iniettare la tinri blu di Evan (40 mg/kg) 30 minuti prima dell'eutanasia.</li>
	<li>Eutanasia del topo utilizzando sovradosaggio di chetamina/xylazina (passaggio 4.1).</li>
	<li>Per misurare l'integrità della barriera alveolare, seguire i passaggi da 4.2 a 4.9 per la raccolta BAL.</li>
	<li>Trasferire 100 l di BALF su una piastra di benda chiara 96-bene, insieme a 100 l di standard EBD duplicati. Utilizzare PBS -/- come spazio vuoto.</li>
	<li>Utilizzare un lettore di microplaper misurare l'assorbimento del BALF a 620 nm e 740 nm. Utilizzare l'assorbimento a 740 nm per correggere la contaminazione da eme nei campioni7.</li>
	<li>Per misurare l'integrità della barriera vascolare, permetà i polmoni iniettando lentamente 5 mL di PBS ghiacciato -/- attraverso il ventricolo destro del cuore. Rimuovere il polmone sinistro.</li>
	<li>Asciugare il polmone sinistro per 72 h a 58 gradi centigradi per rimuovere l'acqua in eccesso.</li>
	<li>Elaborare il tessuto polmonare essiccato come in Radu e Chernoff 20138e misurare le assorbimenti a 620 nm e 740 nm.</li>
</ol>6. Istologia polmonare
<ol><li>Cannulare la trachea seguendo i passaggi 4.1–4.5.</li>
	<li>Per fissare i polmoni a 20 cm H2O, utilizzare un supporto ad anello e un morsetto per elevare una siringa da 60 mL dotata di tubi controllati da valvole e riempita con una soluzione fixativa selezionata (ad esempio, zinco fissativo) in modo che il menisco della soluzione fissativa sia di 20 cm Polmoni.</li>
	<li>Collegare il tubo al catetere e aprire il valore. Riempire lentamente i polmoni con fissativo fino a quando non smettono di gonfiarsi.</li>
	<li>Rimuovere il catetere 3/4 della via d'uscita dalla trachea. Legare la trachea con sutura prima di rimuovere completamente il catetere per ridurre al minimo la perdita di fissativo.</li>
	<li>Togliere i polmoni e cuore in blocco. NOT:</</c1> Assicurarsi che i polmoni non siano forati durante la rimozione per mantenere la pressione infuso fissativo.</li>
	<li>Fissare i polmoni per 24 h in 25 mL di fissativo a temperatura ambiente.</li>
	<li>Lavare i polmoni fissi per intervalli sequenziali di 20 min in PBS -/-, 30% di etanolo e 50% di etanolo.</li>
	<li>Dopo l'ultimo lavaggio, conservare i polmoni nel 70% di etanolo per la lavorazione dell'istologia come in Eickmeier et al. 20139.</li>
</ol>

<ol><li>Baron, R. M., Levy, B. D., et al. Acute Respiratory Distress Syndrome. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBaron%2C+RM+%22Harrison%27s+Principles+of+Internal+Medicine%2C+20e%22">Harrison's Principles of Internal Medicine, 20e</a>. Jameson, J. L. , McGraw-Hill Education. (2018).</li>
<li>Bellani, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology%2C+Patterns+of+Care%2C+and+Mortality+for+Patients+With+Acute+Respiratory+Distress+Syndrome+in+Intensive+Care+Units+in+50+Countries%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+the+American+Medical+Association%22%5BJournal%5D)">Epidemiology, Patterns of Care, and Mortality for Patients With Acute Respiratory Distress Syndrome in Intensive Care Units in 50 Countries.</a> The Journal of the American Medical Association. 315 (8), 788-800 (2016).</li>
<li>The ARDS Definition Task. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+Respiratory+Distress+Syndrome%3A+The+Berlin+DefinitionThe+Berlin+Definition+of+ARDS%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+the+American+Medical+Association%22%5BJournal%5D)">Acute Respiratory Distress Syndrome: The Berlin DefinitionThe Berlin Definition of ARDS.</a> The Journal of the American Medical Association. 307 (23), 2526-2533 (2012).</li>
<li>Thompson, B. T., Chambers, R. C., Liu, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+Respiratory+Distress+Syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Acute Respiratory Distress Syndrome.</a> New England Journal of Medicine. 377 (6), 562-572 (2017).</li>
<li>Krishnamoorthy, N., Levy, B. D., Walker, K. H., Abdulnour, R. -E. E., Engstrom, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specialized+Proresolving+Mediators+in+Innate+and+Adaptive+Immune+Responses+in+Airway+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Specialized Proresolving Mediators in Innate and Adaptive Immune Responses in Airway Diseases.</a> Physiological Reviews. 98 (3), 1335-1370 (2018).</li>
<li>Abdulnour, R. -E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maresin+1+biosynthesis+during+platelet-neutrophil+interactions+is+organ-protective%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Maresin 1 biosynthesis during platelet-neutrophil interactions is organ-protective.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (46), 16526(2014).</li>
<li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulmonary+permeability+assessed+by+fluorescent-labeled+dextran+instilled+intranasally+into+mice+with+LPS-induced+acute+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Pulmonary permeability assessed by fluorescent-labeled dextran instilled intranasally into mice with LPS-induced acute lung injury.</a> PLoS ONE. 9 (7), (2014).</li>
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<li>Eickmeier, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aspirin-triggered+resolvin+D1+reduces+mucosal+inflammation+and+promotes+resolution+in+a+murine+model+of+acute+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunology%22%5BJournal%5D)">Aspirin-triggered resolvin D1 reduces mucosal inflammation and promotes resolution in a murine model of acute lung injury.</a> Mucosal Immunology. 6 (2), 256-266 (2013).</li>
<li>Abdulnour, R. -E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipase+D+isoforms+differentially+regulate+leukocyte+responses+to+acute+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">Phospholipase D isoforms differentially regulate leukocyte responses to acute lung injury.</a> Journal of Leukocyte Biology. 103 (5), 919-932 (2018).</li>
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<li>Colby, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolvin+D3+and+Aspirin-Triggered+Resolvin+D3+Are+Protective+for+Injured+Epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Resolvin D3 and Aspirin-Triggered Resolvin D3 Are Protective for Injured Epithelia.</a> American Journal of Pathology. 186 (7), 1801-1813 (2016).</li>
<li>Bonnans, C., Fukunaga, K., Keledjian, R., Petasis, N. A., Levy, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+phosphatidylinositol+3-kinase+by+polyisoprenyl+phosphates+in+neutrophil-mediated+tissue+injury%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Regulation of phosphatidylinositol 3-kinase by polyisoprenyl phosphates in neutrophil-mediated tissue injury.</a> The Journal of Experimental Medicine. 203 (4), 857-863 (2006).</li>
<li>Mandell, L. A., Niederman, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aspiration+Pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Aspiration Pneumonia.</a> New England Journal of Medicine. 380 (7), 651-663 (2019).</li>
<li>Seki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+anti-inflammatory+and+proresolving+mediator+resolvin+E1+protects+mice+from+bacterial+pneumonia+and+acute+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">The anti-inflammatory and proresolving mediator resolvin E1 protects mice from bacterial pneumonia and acute lung injury.</a> Journal of Immunology. 184 (2), 836-843 (2010).</li>
<li>Abdulnour, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aspirin-triggered+resolvin+D1+is+produced+during+self-resolving+gram-negative+bacterial+pneumonia+and+regulates+host+immune+responses+for+the+resolution+of+lung+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunology%22%5BJournal%5D)">Aspirin-triggered resolvin D1 is produced during self-resolving gram-negative bacterial pneumonia and regulates host immune responses for the resolution of lung inflammation.</a> Mucosal Immunology. 9 (5), 1278-1287 (2016).</li>
<li>Traber, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid-epithelial+cross+talk+coordinates+synthesis+of+the+tissue-protective+cytokine+leukemia+inhibitory+factor+during+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+physiology.+Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Myeloid-epithelial cross talk coordinates synthesis of the tissue-protective cytokine leukemia inhibitory factor during pneumonia.</a> American journal of physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 313 (3), L548-L558 (2017).</li>
<li>Yamamoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+lung+epithelium+in+neutrophil+recruitment+during+pneumococcal+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Roles of lung epithelium in neutrophil recruitment during pneumococcal pneumonia.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 50 (2), 253-262 (2014).</li>
<li>Acute Respiratory Distress Syndrome Network. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ventilation+with+Lower+Tidal+Volumes+as+Compared+with+Traditional+Tidal+Volumes+for+Acute+Lung+Injury+and+the+Acute+Respiratory+Distress+Syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Ventilation with Lower Tidal Volumes as Compared with Traditional Tidal Volumes for Acute Lung Injury and the Acute Respiratory Distress Syndrome.</a> New England Journal of Medicine. 342 (18), 1301-1308 (2000).</li>
<li>Peng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+nitric+oxide+synthase+contributes+to+ventilator-induced+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Inducible nitric oxide synthase contributes to ventilator-induced lung injury.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 172 (4), 470-479 (2005).</li>
<li>Abdulnour, R. -E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+stress+activates+xanthine+oxidoreductase+through+MAP+kinase-dependent+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Mechanical stress activates xanthine oxidoreductase through MAP kinase-dependent pathways.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 291 (3), L345-L353 (2006).</li>
<li>Serhan, C. N., Levy, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolvins+in+inflammation%3A+emergence+of+the+pro-resolving+superfamily+of+mediators%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Resolvins in inflammation: emergence of the pro-resolving superfamily of mediators.</a> The Journal of Clinical Investigation. 128 (7), 2657-2669 (2018).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il metodo di instillazione intra-bronchiale qui descritto qui utilizza la cannulazione selettiva del bronco principale sinistro per infondere HCl nel polmone sinistro, con conseguente lesioni polmonari acute murine unilaterali e autolimitate. Questo modello di lesione polmonare acido murino rappresenta da vicino la risposta infiammatoria, istopatologia e disfunzione fisiologica osservata nell'ARDS umano, dove l'aspirazione dell'acido gastrico è un comune precipitante o fattore che contribuisce4. L'esposizione delle vie aeree murine a basso pH HCl provoca una maggiore permeabilità della barriera alveolar-capillare, edema alveolare e infiltrazione di neutrofili profondi nel sito di lesione. Questi eventi non sono osservati nel polmone destro illeso. Inoltre, questo modello produce risposte infiammatorie rapide che raggiungeno il picco entro 24 h dopo l'instillazione acida e condivide i cambiamenti nell'espressione genica con ARDS umano, come l'espressione differenziale delle isola10.
Anche se questo modello preclinico murino riproduce molte delle caratteristiche di ARDS a livello molecolare, cellulare e tissutale, non riassume completamente ARDS umano. La definizione di ARDS comprende il coinvolgimento polmonare bilaterale3, mentre il metodo di instillazione descritto qui risulta per progettazione nella malattia polmonare unilaterale. Inoltre, gli animali non richiedono ventilazione meccanica continua, immobilità o sedazione parenterale. I risultati qui presentati (vide supra) e altrove6,9,11,12,13 dimostrano che la lesione polmonare unilaterale indotta dall'acido riproduce la maggior parte delle caratteristiche patologiche ARDS, fornendo al contempo l'opportunità unica di utilizzare il polmone giusto come controllo interno e di studiare la fase di risoluzione di questa malattia. Come tale, il modello discusso qui modella la patobiologia ARDS, ma consente anche di struzzismo meccanicistico delle risposte fondamentali dei tessuti polmonari alle lesioni e ai meccanismi di risoluzione che possono essere rilevanti per affrontare questa importante malattia.
L'instillazione di HCl rappresenta una lesione polmonare acuta diretta, quindi è la modellazione degli aspetti della fisiopatologia associata alla polmonite da aspirazione. Inoltre, l'insulto polmonare sinistro iniziale in questo modello viene generato utilizzando sterile HCl piuttosto che contenuto gastrico carico di batteri visto in alcuni eventi di aspirazione umana che possono anche portare a polmonite14. Nell'uomo, l'aspirazione di batteri patogeni può provocare polmonite batterica secondaria che esacerba la risposta infiammatoria acuta, prolungando la lesione polmonare iniziale e aumentando la suscettibilità del paziente a sviluppare ARDS14. Questa potenziale limitazione è stata affrontata dagli sperimentatori che instillano intenzionalmente batteri patogeni Escherichia coli (E. coli)15 dopo sterile HCl. Inoltre, questo metodo è stato utilizzato per studiare i batteri mediati dal patogeno infiammazione; polmonite batterica unilaterale può essere indotta dall'instillazione polmonare sinistra selettiva di batteri, come E. coli16,17, Pseudomonas aeruginosa16, e Streptococcus pneumoniae18 . Il modello di lesione polmonare acuta auto-limitato descritto qui può essere utilizzato anche per studiare lesioni polmonari indotte dal ventilatore (VILI), un'importante causa di aumento della mortalità nell'ARDS umano19. I modelli animali sperimentali di VILI di solito comportano la ventilazione meccanica in topi ingenui con volumi di marea molto superiori a quelli clinicamente utilizzati per causare lesioni polmonari (>15 mL/kg; vedi lavoro precedente20,21). Verso un modello clinicamente più rilevante di VILI, l'instillazione dell'acido intra-bronchiale come descritto qui può essere utilizzata per la prima volta per indurre lesioni polmonari non letali seguite da ventilazione meccanica a volumi di marea all'interno della gamma clinica (6-12 mL/kg). Questo ipotetico modello animale può consentire agli sperimentatori di studiare VILI in modo clinicamente rilevante una volta sviluppato e convalidato. Insieme, questi modelli murini evidenziano la versatilità del metodo di instillazione intrabronchiale selettivo per generare insulti polmonari unilaterali che assomigliano molto alle patologie associate alle malattie polmonari umane.
Oltre a consentire l'instillazione selettiva di vari agenti nocivi al polmone sinistro, la tecnica di instillazione intra-bronchiale dopo la tracheostomia non richiede un addestramento prolungato, un lungo periodo di procedure o attrezzature complesse, e in mani esperte causa un disagio minimo per gli animali. Nonostante ciò, possono verificarsi diversi problemi durante la procedura di instillazione C-HCl selettiva che può avere un impatto sui risultati sperimentali. Una cannulazione impropria del bronco dello stelo principale sinistro può provocare lesioni polmonari bilaterali che diminuiscono la sopravvivenza dei topi sperimentali e confonde l'uso del polmone destro come controllo interno illeso. Questo può essere evitato pescando il catetere sufficientemente verso il polmone sinistro durante la connulation fino a raggiungere la resistenza. Dopo l'iniezione di HCl, un bolo d'aria deve essere iniettato, il catetere rapidamente rimosso, e la scheda chirurgica portato in posizione verticale ad un angolo di 60 gradi. Questi passaggi sono cruciali per garantire che l'acido raggiunga le vie aeree distali del polmone sinistro e previene il reflusso di acido nel polmone destro e nella trachea, che possono causare lesioni propimali. Entro 24 h a seguito dell'instillazione, la lesione nel polmone sinistro è diffusa con un esteso edema polmonare, che colpisce sia il polmone sinistro distale che quello prossimale.
Durante lo sviluppo del metodo nei topi adulti di 8-12 settimane, 2,5 mL/kg di HCl intra-bronchiale ha prodotto lesioni polmonari acute sostanziali ma sublethal; dosi più basse di HCl non hanno provocato lesioni polmonari riproducibili e omogenee. Anche se non abbiamo eseguito questo modello in topi più giovani (ad es. 3-6 settimane) o anziani (ad esempio, 10-14 mesi), prevediamo che il dosamento basato sul peso di HCl si tradurrà in un fenotipo di lesione polmonare simile a quello che si nota nei topi di 8-12 settimane. Raccomandiamo ai ricercatori di titolare le dosi di HCl per ottenere il grado desiderato di lesione polmonare prima di eseguire esperimenti con topi a condizioni estreme di peso.
Questa procedura di instillazione selettiva dell'acido offre un modello murino non letale di infiammazione del tessuto sterile che riduce la necessità di cure di supporto, come la ventilazione meccanica. Con la sopravvivenza estesa dei topi feriti, l'infiammazione indotta dagli acidi ha abbastanza tempo per auto-risolversi. La fase di risoluzione di questo modello è stata utilizzata per identificare mediatori di lipidi bioattivi endogeni regolati temporalmente, designati mediatori specializzati pro-risoluzione (SPM), come la lipossina A4 (LXA4),la cavalla 1 (MaR1) e le risolvine6 ,11,12,16. La somministrazione di SPM esogeni ai topi feriti velocizza la risoluzione della lesione polmonare indotta dall'acido smorzando i meccanismi infiammatori e promuovendo la catabasi del tessuto polmonare ferito. Questi SGM promuovono lo sgombero dell'edema alveolare12, aumentano l'efferocitosi dei neutrofili apoptotici mediante macrofagi reclutati16, e accelerano la reepitelializzazione delle vie aeree e degli alveoli12 per ridurre vascolare perdite e ipossia tissutale. In un modello di lesione polmonare indotta da patogeni, 15-epi-resolvin D1 ha anche esibito azioni antimicrobiche attraverso una maggiore fagocitosi batterica da parte dei macrofagi e una maggiore distanza batterica dal polmone infetto16. Lo studio di questi meccanismi di risoluzione endogeni fornisce informazioni su potenziali nuove strategie terapeutiche per i pazienti con ARDS5.
Per studiare al meglio la regolazione spatiotemporale dei meccanismi di risoluzione, sono necessari modelli sperimentali in vivo. I modelli di lesioni polmonari acute devono includere risposte infiammatorie acute rilevanti e disfunzioni degli organi con l'impegno della risoluzione dell'ospite che promuove i processi molecolari e cellulari. Questi meccanismi possono essere quantificati utilizzando indici di risoluzione stabiliti22. Il metodo di instillazione intra-bronchiale selettivo per generare lesioni polmonari acute unilaterali si è dimostrato utile a questo proposito per sondare mediatori e percorsi di risoluzione endogeni. Studi futuri che approfondiscono la nostra comprensione di questi processi di risoluzione attiva promettono di portare agli agonisti terapeutici che imitano le bioazioni dei mediatori lipidi endogeni per migliorare la risoluzione dell'infiammazione e mitigare la morbilità mortalità di ARDS e altre importanti malattie polmonari.

La sindrome da distress respiratorio acuto (ARDS) è una causa importante di insufficienza respiratoria acuta1. È una malattia comune e letale o invalidante che si verifica nel 10% di tutti i pazienti ricoverati in unità di terapia intensiva in tutto il mondo2. Secondo la definizione di Berlino3, ARDS è definita dall'insorgenza acuta di insufficienza respiratoria ipossimale (<1 settimana) e si infiltra bilaterale polmonare su radiografie toraciche che non sono spiegate dall'insufficienza cardiaca4. La patobiologia sottostante è caratterizzata da una risposta infiammatoria eccessiva. Il polmone può essere ferito direttamente, come in polmonite o con aspirazione acido gastrico, o indirettamente, come nella sepsi o dopo trasfusioni multiple di sangue4. Dopo l'insulto iniziale, la patogenesi ARDS progredisce in tre fasi: fasi essuative, proliferative e fibrotiche1. Queste fasi sono caratterizzate da distinti meccanismi immunitari molecolari e cellulari e di riparazione che determinano la prognosi per i pazienti ARDS. L'assistenza di supporto rimane il pilastro per i pazienti ARDS; attualmente, non ci sono trattamenti farmacologici efficaci per ARDS, quindi c'è un urgente bisogno di nuove ricerche su questa condizione devastante4.
La disregolazione della risposta immunitaria innata durante la fase essudativa contribuisce all'insorgenza acuta di ARDS e all'insufficienza respiratoria associata1. La segnalazione di mediatori pro-infiammatori potente orchestra le risposte immunitarie iniziali, portando alla rottura della barriera alveolar-capillare, all'edema alveolare diffuso e all'infiltrazione dei neutrofili nel sito di lesioni del tessuto polmonare4. In ARDS, segnali di frenata inefficaci per l'infiammazione acuta predispongono all'insufficienza polmonare e possono ritardare la catabasi tempestiva del tessuto polmonare ferito5. A tal fine, l'indagine preclinica sui meccanismi endogeni di inizio e pro-risoluzione di ARDS può scoprire nuove strategie terapeutiche. Tale indagine richiede modelli sperimentali autolimitati in vivo di lesioni polmonari acute che assomigliano molto alle caratteristiche dell'ARDS umana, permettendo l'interrogatorio dei meccanismi alla base delle fasi di avvio e risoluzione della lesione tissutale.
Il modello murino qui presentato produce lesioni polmonari acute dirette che dimostrano i processi patobiologici cardinali dell'ARDS esudativo, vale a dire l'interruzione della barriera alveolar-capillare e l'infiltrazione dei neutrofili. Il metodo si basa sull'instillazione intra-bronchiale selettiva dell'HCl attraverso la canonulazione del bronco principale sinistro, localizzando la lesione e la risposta infiammatoria al polmone sinistro; il polmone destro illeso può essere utilizzato come controllo interno per determinazioni selezionate di lesioni e infiammazioni tissutali. Inoltre, la lesione polmonare unilaterale non è letale e svela un programma di risoluzione. Questo offre una finestra distinta nella risoluzione dell'infiammazione polmonare che può essere sfruttata per l'identificazione di mediatori endogeni pro-risoluzione e meccanismi cellulari e per aprire nuove vie terapeutiche per ARDS che enfatizza la fisiologia di risoluzione e Farmacologia.

<table><tbody><tr><td>10x Fissativo allo zinco</td><td>BD Biosciences</td><td>552658</td><td></td></tr><tr><td>2-0 Sutura di seta intrecciata</td><td>Specialità chirurgiche</td><td>SP118</td><td></td></tr><tr><td>24 G x 3/4" Safelet monouso Catetere per flebo</td><td>Excel</td><td>26751</td><td></td></tr><tr><td>33 mm, 0,22 &; m unità filtro siringa</td><td>Millipore-Sigma</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>4" lunga seghettata leggera curva Graefe Pinze</td><td>Roboz</td><td>RS-5135</td><td></td></tr><tr><td>4" Punta lunga seghettata Full Curve Graefe Pinze</td><td>Roboz</td><td>RS-5137</td><td></td></tr><tr><td>4,5" Micro forbici da dissezione</td><td>Roboz</td><td>RS-5912</td><td></td></tr><tr><td>6" Crile Wood Needle Holder</td><td>Roboz</td><td>RS-7860</td><td></td></tr><tr><td>Siringa da 60 mL</td><td>BD Biosciences</td><td>309653</td><td></td></tr><tr><td>Anti-topo FITC-Ly6G anticorpo</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11-9668-82</td><td>Si può usare il fluoroforo preferito</td></tr><tr><td>Anti-topo PE-Ly6G</td><td>Anticorpo Thermo Fisher Scientific</td><td>12-9668-82</td><td>Si può usare il fluoroforo preferito</td></tr><tr><td>Sterilizzatore</td><td></td><td></td><td></td>di perline</tr><tr><td>Soluzione di betadine Swabstick</td><td>Betadine</td><td>67618-153-01</td><td></td></tr><tr><td>Buprenex</td><td>Reckitt Benckiser</td><td></td><td>NDC: 12496-0757-1, 12496-0757-5</td></tr><tr><td>Micropiastra trasparente a fondo piatto a 96 pozzetti</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12565501</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) di Dulbeccos senza tecnologie Ca2+ o Mg+</td><td>life</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Tosatrici</td><td></td><td></td><td></td>elettriche</tr><tr><td>Acido etilendiamminotetraacetico (EDTA)</td><td>Millipore-Sigma</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>Colorante blu Evans</td><td>Millipore-Sigma</td><td>E-2129</td><td></td></tr><tr><td>Termoforo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acido cloridrico, 37%</td><td>Millipore-Sigma</td><td>258148</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina</td><td>Henry-Schein</td><td>56344</td><td></td></tr><tr><td>Lettore di micropiastre (640, 720 nm)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipetta</td><td></td><td></td><td></td>P200</tr><tr><td>Puntali per pipette P200 Sonda</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td>pH</tr><tr><td>Supporto ad anello con morsetto</td><td></td><td></td><td></td>di prolunga</tr><tr><td>Tamponi sterili per la preparazione dell'alcol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22-363-750</td><td></td></tr><tr><td>Telo sterile per topi 8 "x 8" con fenestrazione adesiva ovale</td><td>Steris</td><td>88VCSTF</td><td></td></tr><tr><td>Guanti sterili in nitrile</td><td>Kimberly-Clark</td><td>56890</td><td></td></tr><tr><td>Telo sterile per asciugamani</td><td>Dynarex</td><td>4410</td><td></td></tr><tr><td>Sutura di seta intrecciata rivestita di cera 4-0</td><td>Covidien</td><td>SS733</td><td></td></tr><tr><td>Xilazina</td><td>AKORN</td><td></td><td>NDC: 59399-111-50</td></tr></tbody></table>

un modello di lesione polmonare acuta autolimitata dall'instillazione unilaterale dell'acido intra-bronchiale

A Model of Self-limited Acute Lung Injury by Unilateral Intra-bronchial Acid Instillation

L'instillazione intra-bronchiale selettiva dell'acido cloridrico (HCl) al bronco principale sinistro murino provoca lesioni acute ai tessuti con risultati istopatologici simili alla sindrome da distress respiratorio acuta umana (ARDS). L'edema alveolare risultante, il danno da barriera alveolar-capillare e l'infiltrazione leucocite colpiscono prevalentemente il polmone sinistro, preservando il polmone destro come controllo illeso e permettendo agli animali di sopravvivere. Questo modello di lesione polmonare acuta autolimitata consente di sbaragliare meccanismi di risoluzione dei tessuti, come l'efferocitosi macrofalosi dei neutrofili apoptotici e la restituzione dell'integrità della barriera alveolar-capillare. Questo modello ha aiutato a identificare ruoli importanti per la risoluzione degli agonisti, tra cui mediatori specializzati pro-risoluzione (SPM), fornendo una base per lo sviluppo di nuovi approcci terapeutici per i pazienti con ARDS.

L'instillazione di HCl intrabronchiale selettiva provoca lesioni polmonari acute unilaterali
Il metodo di instillazione intra-bronchiale selettiva dell'HCl nel bronco principale sinistro è illustrato nella figura 1A. La conseguente lesione polmonare acuta coinvolge l'intero polmone sinistro e, dopo la somministrazione endovenosa di EBD e della perfusione polmonare, l'EBD è rimasto solo nel polmone sinistro (Figura 1B). L'estravaganza EBD nel polmone sinistro è stata quantificata e risulta essere significativamente aumentata rispetto alla finta instillazione selettiva (Figura1C; adattata da Abdulour et al. 20146). In risposta alla lesione polmonare, i leucociti circolanti si diapedesi nel tessuto infiammato. In questo modello, i neutrofili vascolari subiscono una migrazione trans-endoteliale nell'interstizio polmonare ferito. Neutrofili interstiziali accumulati nel polmone sinistro 24 h dopo l'instillazione di HCl, in contrasto con il polmone destro dove si osservano pochi neutrofili interstiziali (Figura 1D). Questi risultati indicano che il metodo di instillazione intra-bronchiale sinistro selettivo ha provocato lesioni polmonari acute murine che è stato in gran parte localizzato al polmone sinistro e ha prodotto cambiamenti patologici che si vedono anche con ARDS umano, tra cui barriera alveolar-capillare e infiltrazione neutrofila.
La lesione polmonare acuta unilaterale consente lo studio dei meccanismi di risoluzione
Per studiare la fase di risoluzione dei topi a lesione polmonare acuta indotta dall'acido devono essere in grado di sopravvivere all'insulto iniziale. Distinta dall'HCl intratracheale, l'instillazione solo nel bronco del tronco sinistro porta ad una lesione autolimitata con una sopravvivenza uniforme in topi altrimenti sani. I polmoni possono essere ottenuti dai topi in corrispondenza dei tempi precoci o successivi, come illustrato nella Figura 2A. L'istologia polmonare mostra lesioni e infiammazioni tissutali a livello di organo e cellulare con infiammazione esodativa 24 h dopo lesioni caratterizzate da edema alveolare marcato e infiltrazione di neutrofili nel polmone sinistro. Si noti che non vi è alcuna lesione significativa o afflusso di leucocito nel polmone destro di controllo illeso (Figura 2A). 72 h dopo lesioni, edema e infiltrati cellulari sono sostanzialmente diminuiti, che rappresentano una fase di espropriazione di risoluzione. I neutrofili alveolari possono essere monitorati dalla citometria di flusso (CD45-/CD68-/F4/80-/Ly6G-/CD11b) ottenuta da un'intera lavanda polmonare. I neutrofili aumentano nel polmone sinistro 24 h a seguito della lesione iniziale e diminuiscono sostanzialmente a 48 e 72 h (Figura 2B). Se si studiano punti temporali successivi, il numero di neutrofili tornerà alla linea di base e i meccanismi nelle fasi successive della catalibasis, come le risposte fibrocificanti.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60024/60024fig1v2.jpg"> Figura 1: L'instillazione clabontica intrabronchiale selettiva produce lesioni polmonari unilaterali definite da violazione della barriera alveolare e infiltrazione di neutrofili. (A) Rappresentazione della cannulazione del murino del bronco principale sinistro per l'instillazione selettiva dell'HCl nel polmone sinistro. (B) I polmoni resiusati a destra (RL) e a sinistra (LL) esposti all'instillazione selettiva dell'acido e perfusi a seguito del colorante blu di Evan per via endovenosa. (C) Quantificazione del colorante blu dell'Evan interstiziale da polmone omogeneizzato e perfuso 24 h dopo lesioni acidi o controllo fittizio; un dato adattato da Abdulnour et al. 20146. I valori rappresentano la media , SEM, dove n è 5. - p &lt; 0,05, Mann-Whitney U Test. (D) Citometria di flusso rappresentativa dei neutrofi intravascolari (I.V.; fluoroforo 1) e interstiziali (I.S.; fluorophore 2) come percentuale del CD45 totale- cellule nel polmone elaborato 24 h dopo lesioni acide. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60024/60024fig1v2large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60024/60024fig2.jpg"> Figura 2: Lesione polmonare acuta unilaterale si auto-risolve. (A) Rappresentante H&amp;E istologia (10x) di polmoni sinistri ottenuti da topi ingenui (0 h) o topi 24, 48, 72 h dopo infortunio, insieme al polmone destro associato dallo stesso topo (barra di scala - 250 m). (B) Citometria di flusso rappresentativa dei neutrofili alveolari (Ly6G, CD11b ) ottenuta da un'intera lavanda polmonare come percentuale del CD45 totale- cellule in topi o topi ingenui (0 h) 24, 48 e 72 h dopo lesioni acidi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60024/60024fig2large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

L'instillazione selettiva dell'acido intrapchiale al polmone sinistro nei topi provoca lesioni polmonari acute unilaterali e autolimitate che modella la sindrome da distress respiratorio acuto umano (ARDS) indotta dall'aspirazione dell'acido gastrico.

Un modello di lesione polmonare acuta autolimitata dall'instillazione unilaterale dell'acido intra-bronchiale

Selective intra-bronchial instillation of hydrochloric acid (HCl) to the murine left mainstem bronchus causes acute tissue injury with histopathologic ...

Il metodo intrabronchiale selettivo è significativo perché offre agli investigatori un modello riproducibile e non letale per lo studio della lesione polmonare acuta, una delle principali cause della sindrome da distress respiratorio acuto nell'uomo. Il vantaggio della tecnica intrabronchiale selettiva è la localizzazione della risposta infiammatoria al polmone sinistro offrendo il polmone destro come controllo illeso e riducendo al minimo il disagio animale. A dimostrare questa procedura sarà Alexander Tavares, tecnico e studente laureato nel nostro laboratorio.Per preparare 0,1 acido cloridrico normale, aggiungere 11 millilitri di acqua distillata doppia a una bottiglia di vetro ambrato, seguita dalla lenta aggiunta di un millilitro del 37%12 di acido normale. Successivamente, aggiungere lentamente quattro millilitri di un normale stock di lavoro acido in 35 millilitri doppie acque distillate in un tubo conico da 50 millilitri. Quindi utilizzare una sonda elettronica per pH per misurare il pH della soluzione di stock normale 0.1, titrando a un pH di 1,1 usando idrossido di sodio o soluzione di stock acido secondo necessità per un volume finale di 40 millilitri.Prima di iniziare la procedura, filtrare da uno a due millilitri della soluzione acida attraverso un filtro sterile da 0,22 microlitri in un tubo di microcentrifugo sterile e confermare una mancanza di risposta al riflesso del dolore in un topo anestetizzato. L'uso di tosatrici elettriche in colpi lenti verso il basso rade delicatamente l'area chirurgica sulla superficie ventrale del topo sotto il mento nella regione cervicale della gola. Rimuovere i capelli sciolti e tamponare la pelle esposta con tre soluzioni consecutive di povidone-iodio e tamponi di alcol isopropile al 70%.Una volta che la pelle è stata predisposta, posizionare il mouse in posizione supina su una tavola chirurgica pulita e coprire l'animale con un drappo chirurgico sterile. Fare un'apertura longitudinale di 0,5 centimetri nella pelle sopra la trachea e le ghiandole salivari e utilizzare forcep seghettate leggermente curve per ritrarre attentamente la pelle. Separare delicatamente le ghiandole salivari per esporre i muscoli tracheali e utilizzare forcep seghettate leggermente curve per allontanare delicatamente i muscoli paratracheali.Prendere in giro la fascia che circonda la trachea fino a quando gli anelli cartilaginei della trachea sono completamente esposti e utilizzare forcelle seghettate completamente curve per lavorare via il tessuto connettivo tra la retrotrachea e la retrofascia. Far scorrere le forcep seghettate completamente curve dietro la trachea e sollevare la trachea. Una volta che la punta delle forcep è dietro la trachea, afferrare un pezzo da 10 a 15 centimetri di sutura di seta intrecciata 4-0 con le punte delle forcep e tirare la sutura dietro la trachea in modo che ci sia una lunghezza uniforme su entrambi i lati.La tavola chirurgica può essere girata per avvicinare l'area chirurgica alla mano dominante per i passaggi successivi. Quindi tirare delicatamente le estremità della sutura verso la parte anteriore del mouse e tenere le estremità in posizione. Per la cannulazione del bronco del mainstem sinistro, esporre l'ago di un angiocatetere da 24 calibri da 3/4 pollici e inserire il lato smussato dell'ago nella regione interna della trachea tra il primo e il secondo anello tracheale.Quando la punta dell'ago può essere visualizzato all'interno del lume tracheale, rilasciare la sutura e far avanzare la cannula sopra l'ago nella trachea che penzola verso il lato posteriore sinistro del mouse. Quando si incontrano resistenze, ritirare l'ago. Una volta che la cannula è in posizione, afferrare saldamente la porta di iniezione per evitare che il catetere si sposti e fissare una punta in micropipetta P-200 all'interno della porta.Quindi infondere 50 microlitri della soluzione acida normale filtrata 0.1 nel catetere, seguiti da un volume uguale di aria. Questo passaggio richiede una manipolazione precisa della cannula, mentre le vie aeree sono ostrute, e deve essere completato rapidamente e senza intoppi per ripristinare il corretto flusso d'aria e ridurre al minimo i danni alle vie aeree. Ritirare rapidamente il catetere e inclinare la tavola chirurgica con un angolo di 60 gradi.Dopo 30 secondi, posare la tavola chirurgica piatta e rimuovere la sutura da dietro la trachea. Quindi utilizzare una sutura di seta intrecciata rivestita di cera 4-0 per chiudere l'incisione cutanea con due o tre punti. La lesione polmonare acuta derivante dall'instillazione dell'acido intrabronchiale coinvolge l'intero polmone sinistro.Infatti, in seguito alla somministrazione endovenosa di colorante blu Evans e perfusione polmonare, il colorante viene rilevato solo all'interno del polmone sinistro. La quantificazione dell'estravasazione del colorante nel polmone sinistro è significativamente aumentata rispetto all'instillazione selettiva fittizia. I neutrofili interstiziali si accumulano nel polmone sinistro 24 ore dopo l'instillazione acida in contrasto con il polmone destro in cui si osservano pochi neutrofili interstiziali.L'istologia polmonare rivela lesioni tissutali e infiammazione a livello dell'organo e cellulare con infiammazione essudativa 24 ore dopo la lesione, caratterizzata da marcato edema alveolare e infiltrazione neutrofila all'interno del polmone sinistro. Si noti che la mancanza di lesioni significative o l'afflusso di leucociti nel polmone destro di controllo illeso. 72 ore dopo l'infortunio l'edema e gli infiltrati cellulari sono sostanzialmente diminuiti rappresentando una fase essudativa risolutiva.Come valutato dalla citometria del flusso, i neutrofili alveolari aumentano nel polmone sinistro 24 ore dopo la lesione iniziale e diminuiscono sostanzialmente a 48 e 72 ore. È importante visualizzare il catetere nella trachea prima di avanzare. Inclinare la cannula verso il bronco del mainstem sinistro durante l'inserimento e seguire l'instillazione acida con 50 microlitri d'aria.L'analisi dei fluidi lavage broncoalveolari, l'istologia polmonare, la fenotipizzazione delle cellule immunitarie mediante citometria a flusso, l'imaging vivo del topo e il test della funzione polmonare possono essere eseguiti per valutare l'infiammazione e la risoluzione. Lo sviluppo di questo modello auto-limitato di lesione polmonare acuta ha permesso ai ricercatori di dare contributi significativi al campo della biologia della risoluzione. Ricorda che l'acido cloridrico concentrato è pericoloso e che dovrebbe essere maneggiato in una cappa chimica che indossa i dispositivi di protezione individuale appropriati.

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Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Un modello murino per lesioni ventilatore polmonare indotta è un importante strumento per studiare una lesione acuta del...

Pressione di ventilazione controllata per indurre lesioni polmonari acute nei topi

Abbiamo sviluppato un modello di lesione polmonare nel topo mediante iniezione intra-tracheale del batterio Pseudomonas aeruginosa. Questo modello imita il danno polmonare durante la polmonite ed è clinicamente rilevante.

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Modello

Questo protocollo induce un danno polmonare acuto in un topo che ha una stretta fedeltà alla patogenesi della polmonite acida osservata nell'uomo. Generiamo una lesione polmonare acuta massimale non letale a basso pH e teniamo conto delle differenze nella struttura respiratoria anatomica del roditore utilizzando una tracheostomia aperta accoppiata a un rilascio di pressione circonferenziale.

Aprire tracheostomia gastrico acido aspirazione Modello murino di lesioni polmonari acute Risultati in massima acuta non letale Lung Injury

Presentato qui è una procedura passo-passo per indurre lesioni polmonari acute nei topi mediante instillazione lipopolysaccharide intracheale diretta ed eseguire l'analisi FACS di campioni di sangue, liquido di lavaggio bronchoalveolar e tessuto polmonare. La minima invasività, la manipolazione semplice, la buona riproducibilità e la titolazione della gravità della malattia sono vantaggi di questo approccio.

Indurre lesioni polmonari acute nei topi mediante instillazione diretta del lipopolioaccaride intracheale

Descriviamo un modello di sindrome da distress respiratorio acuto indotto da acido cloridrico (ARDS) in suinetti sottoposti a sedazione con agenti alogenati, isoflurano e sevoflurano, attraverso un dispositivo utilizzato per la sedazione in terapia intensiva inalatoria. Questo modello può essere utilizzato per studiare i meccanismi biologici degli agenti alogenati sulle lesioni polmonari e sulla riparazione.

Somministrazione di agenti alogenati in modelli suini di sindrome da distress respiratorio acuto tramite un dispositivo di tipo unità di terapia intensiva

Una combinazione di washout del tensioattivo con soluzione salina allo 0,9% (35 ml/kg di peso corporeo, 37 °C) e ventilazione ad alto volume di marea con basso PEEP per causare lesioni polmonari indotte da un ventilatore moderato (VILI) provoca la sindrome sperimentale da distress respiratorio acuto (ARDS). Questo metodo fornisce un modello di danno polmonare con reclutabilità bassa / limitata per studiare l'effetto di varie strategie di ventilazione per periodi prolungati.

L'esaurimento dei tensioattivi combinato con la ventilazione dannosa si traduce in un modello riproducibile della sindrome da distress respiratorio acuto (ARDS)

Il presente protocollo descrive un modello di danno polmonare nei topi che utilizza acido oleico per imitare la sindrome da distress respiratorio acuto (ARDS). Questo modello aumenta i mediatori dell'infiammazione sull'edema e diminuisce la compliance polmonare. L'acido oleico viene utilizzato sotto forma di sale (oleato) poiché questa forma fisiologica evita il rischio di embolia.

Modello murino di sindrome da distress respiratorio acuto indotto da acido oleico

Questo manoscritto descrive la creazione di un modello infettivo di polmonite nei topi e la rispettiva caratterizzazione della risoluzione delle lesioni insieme ai metodi per la crescita dei batteri e l'instillazione intratracheale. Viene inoltre descritto un nuovo approccio che utilizza la citometria a flusso ad alta dimensione per valutare il panorama immunitario.

Modello sperimentale per valutare la risoluzione della polmonite

Qui, proponiamo un protocollo per la somministrazione di lipopolisaccaridi intratracheali (LPS) tramite intubazione endotracheale orofaringea non invasiva. Questo metodo riduce al minimo il trauma della procedura chirurgica per l'animale e fornisce accuratamente LPS alla trachea e quindi ai polmoni.

Instillazione di lipopolisaccaridi intratracheali non invasivi nei topi

In questo studio, una tecnica di instillazione endotracheale non invasiva è dimostrata per sviluppare l'ALI nei ratti utilizzando un laringoscopio di base per garantire una precisa somministrazione di LPS ai polmoni. La LPS viene immessa tramite un tubo endotracheale tramite un laringoscopio. L'entità della lesione polmonare viene valutata in più momenti temporali.

Somministrazione endotracheale non invasiva di lipopolisaccaridi per indurre lesioni polmonari acute nei roditori

Scopri un modello di lesione polmonare acuta autolimitata mediante instillazione unilaterale di acido intra-bronchiale nel topo. Questo metodo riproduce l'ARDS umano da aspirazione gastrica per studiare la risoluzione dell'infiammazione.

Un modello di lesione polmonare acuta autolimitata dall'instillazione unilaterale dell'acido intra-bronchiale

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