Name: Modello Murine di impatto corticale controllato per linduzione di lesioni cerebrali traumatiche (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-16T14:45:00.000+00:00
Duration: 5 min 1 s
Description: Impara il modello di impatto corticale controllato per indurre lesioni cerebrali traumatiche nei topi. Questo metodo standardizzato consente analisi comportamentali, di imaging e studi molecolari sul tessuto cerebrale.

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Questo lavoro è stato supportato dal National Institutes of Health Grant GM117341 e dall'American College of Surgeons C. James Carrico Research Fellowship a S.J.S.

Tutte le procedure sono state approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali della Northwestern University. I topi C57BL/6 sono stati acquistati presso il Jackson Laboratory e il gruppo ospitato in una struttura di barriera presso il Center for Comparative Medicine presso la Northwestern University (Chicago, IL). Tutti gli animali erano alloggiati in ciclo di luce/buio 12/12 h con libero accesso al cibo e all'acqua.
1. Indurre l'anestesia
<ol><li>Anestesizzare il topo con ketamina (125 mg/kg) e xylazina (10 mg/kg) iniettata per via intraperitonele.</li>
</ol>2. Monitoraggio dei segni vitali ogni 15 min
<ol><li>Monitorare la temperatura, la frequenza respiratoria e il colore della pelle. Il mouse dovrebbe sentire caldo al tatto. La pelle dovrebbe apparire rosa e ben perfusa. La velocità respiratoria dovrebbe variare 50-70 respiri al minuto.</li>
</ol>3. Procedure pre-chirurgiche
<ol><li>Pesare tutti i topi il giorno prima dell'induzione delle lesioni.</li>
	<li>Sterilizzare una serie di strumenti chirurgici automatizzando ogni soggetto sperimentale. Sterilizzare il dispositivo di impatto prima dell'uso.</li>
	<li>Preparare una gabbia di recupero posizionando una gabbia pulita su un pad di riscaldamento elettrico impostato su impostazione "bassa" e posizionato in modo tale che i topi possono allontanarsi dal calore una volta ambulatoriale.</li>
	<li>Impostare la sala operatoria all'interno di un cappuccio sterile a flusso laminare.<ol>
<li>Posizionare il telaio di funzionamento stereotaxic.</li>
		<li>Collegare il dispositivo d'urto al telaio stereotassico.</li>
		<li>Impostare il dispositivo di azionamento con i parametri biomeccanici desiderati per la velocità e il tempo di dimora. NOTA: In questo protocollo viene descritta una grave lesione cerebrale utilizzando una punta di impatto di 3 mm di diametro tramite una craniectomia di diametro di 5 mm con la velocità impostata a 2,5 m/s e un tempo di perdono di 0,1 s. Un'ampia gamma di parametri biomeccanici può essere utilizzata per indurre l'intero spettro di TBI.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Indossa nuove attrezzature protettive personali e guanti sterili.</li>
	<li>Rasare la pelliccia dal sito operativo utilizzando clipper elettrici.</li>
	<li>Applicare unguento opamico opfalico protettivo agli occhi del topo per evitare lesioni corneali e asciugatura.</li>
	<li>Posizionare il mouse nella sala operatoria.</li>
	<li>Preparare la pelle con uno scrub chirurgico a base di iodio alternato ad alcool tre volte.</li>
</ol>4. Applicazione dell'impatto corticale controllato
<ol><li>Incise il cuoio capelluto 1 cm nella linea mediana con un bisturi esponendo il cranio.</li>
	<li>Posizionare il mouse all'interno di un telaio operativo stereotassico fissando le ossa temporali bilaterali tra le barre delle orecchie in miniatura e bloccando gli incisivi all'interno di un morsetto incisivo creando una stabile presa a tre punti sulla testa del mouse.</li>
	<li>Ritirare il cuoio capelluto lontano dal sito operativo con un emostatico o pinze di bloccaggio per garantire che il cuoio capelluto non entri in contatto con la punta di perforazione durante la craniectomia.</li>
	<li>Identificare le suture sagittali e coronali sul cranio esposto. NOTA: Questo protocollo centra la craniectomia 2 mm a sinistra della sutura sagittale e 2 mm rostral alla sutura coronale.</li>
	<li>Eseguire una craniectomia utilizzando un trapano con una punta di perforazione trephine.<ol>
<li>Per eseguire la craniectomia, prima attivare il trapano alla massima velocità e quindi applicare la punta di perforazione trephine perpendicolare al cranio nel sito di craniectomia.</li>
		<li>Applicare una pressione delicata e uniforme al trapano una volta che il contatto è fatto con il cranio. Un leggero "dare" si farà sentire una volta che il trapano penetra attraverso il cranio. Non penetrare la dura sottostante. NOTA: Questo protocollo utilizza una punta di perforazione trephine da 5 mm per eseguire la craniectomia.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Utilizzare pinze e un piccolo ago ipodermico calibro per rimuovere il lembo osseo, esponendo completamente la dura mater sottostante.</li>
	<li>Ruotare la punta dell'impattante nel campo operativo e abbassarla fino a quando non entra in contatto con la dura mater esposta. Una volta effettuato il contatto, il sensore di contatto dello strumento emetterà un tono udibile per avvisare il chirurgo che il contatto è stato effettuato. Questo contrassegnerà il punto zero da cui è impostata la profondità di deformazione. NOTA: Questo protocollo utilizza una punta di impatto di 3 mm per generare una grave lesione. Per applicare lesioni più localizzate, possono essere utilizzate punte piccole come 1 mm.</li>
	<li>Ritirare la punta di impatto e impostare la profondità di impatto desiderata abbassando la posizione dell'impatto sul telaio stereotassico. NOTA: In questo protocollo viene descritta una lesione grave impostando la profondità di deformazione su 2 mm.</li>
	<li>Applicare la lesione attivando l'impatto sul dispositivo azionante.</li>
	<li>Ruotare il dispositivo di impatto fuori dal campo e rimuovere l'animale dal telaio stereotassico.</li>
</ol>5. Chiusura di siti chirurgici
<ol><li>Controllare il sanguinamento dal cranio e la superficie corticale ferita con la pressione diretta di un applicatore sterile in cotone con punta.</li>
	<li>Asciugare il cranio con un applicatore sterile con punta di cotone.</li>
	<li>Chiudere il cuoio capelluto sopra la craniectomia utilizzando un adesivo chirurgico o sutura monofilamento disponibile in commercio. NOTA: In questo protocollo viene utilizzato un adesivo chirurgico veterinario per chiudere il cuoio capelluto. Il lembo osseo non viene sostituito e viene scartato.</li>
</ol>6. Assistenza e monitoraggio post-operatorii
<ol><li>Somministrare l'analgesia post-operatoria (ad esempio, il rilascio prolungato di buprenorphine 0,1–0,5 mg/kg somministrato sottocutaneamente fornendo 72 h di analgesia sostenuta).</li>
	<li>Posizionare l'animale nella posizione di recupero del decubito laterale in una gabbia preriscaldata pulita.</li>
	<li>Osservare gli animali fino a quando sveglio e mobile, quindi restituire ogni topo alla sua gabbia di casa.</li>
	<li>Garantire l'accesso gratuito al cibo e all'acqua. L'assunzione normale di cibo e acqua in genere riprende entro una o due ore dall'infortunio.</li>
	<li>Misurare il peso corporeo ogni tre giorni durante l'esperimento.</li>
</ol>

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<li>Makinde, H. M., Cuda, C. M., Just, T. B., Perlman, H. R., Schwulst, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonclassical+Monocytes+Mediate+Secondary+Injury%2C+Neurocognitive+Outcome%2C+and+Neutrophil+Infiltration+after+Traumatic+Brain+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Nonclassical Monocytes Mediate Secondary Injury, Neurocognitive Outcome, and Neutrophil Infiltration after Traumatic Brain Injury.</a> Journal of Immunology. 199 (10), 3583-3591 (2017).</li>
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<li>Marmarou, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+model+of+diffuse+brain+injury+in+rats.+Part+I%3A+Pathophysiology+and+biomechanics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurosurgery%22%5BJournal%5D)">A new model of diffuse brain injury in rats. Part I: Pathophysiology and biomechanics.</a> Journal of Neurosurgery. 80 (2), 291-300 (1994).</li>
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<li>Ma, X., Aravind, A., Pfister, B. J., Chandra, N., Haorah, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+Models+of+Traumatic+Brain+Injury+and+Assessment+of+Injury+Severity%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Animal Models of Traumatic Brain Injury and Assessment of Injury Severity.</a> Molecular Neurobiology. , (2019).</li>
<li>Makinde, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte+depletion+attenuates+the+development+of+posttraumatic+hydrocephalus+and+preserves+white+matter+integrity+after+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Monocyte depletion attenuates the development of posttraumatic hydrocephalus and preserves white matter integrity after traumatic brain injury.</a> PLoS One. 13 (11), e0202722(2018).</li>
<li>Osier, N. D., Dixon, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Controlled+Cortical+Impact+Model%3A+Applications%2C+Considerations+for+Researchers%2C+and+Future+Directions%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neurology%22%5BJournal%5D)">The Controlled Cortical Impact Model: Applications, Considerations for Researchers, and Future Directions.</a> Frontiers in Neurology. 7, 134(2016).</li>
<li>Iaccarino, C., Carretta, A., Nicolosi, F., Morselli, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+of+severe+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurosurgical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Epidemiology of severe traumatic brain injury.</a> Journal of Neurosurgical Sciences. 62 (5), 535-541 (2018).</li>
</ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse finanziari.

Ci sono diversi passaggi che sono fondamentali per l'applicazione di un infortunio affidabile e coerente. In primo luogo, il topo deve raggiungere un piano profondo di anestesia chirurgica garantendo nessun movimento durante l'esecuzione della craniectomia. Mentre numerosi regimi anestetici possono essere utilizzati per indurre l'anestesia generale nei roditori, gli anestetici che inducono depressione respiratoria come anestetici inalazionali possono provocare l'arresto respiratorio quando combinato con un Grave TBI. Que...

I Centers for Disease Control e Prevenzione degli infortuni stimano che circa 2 milioni di americani subiscano una lesione cerebrale traumatica (TBI) ogni anno1,2. Infatti, TBI contribuisce a oltre il 30% di tutti i decessi correlati alle lesioni negli Stati Uniti con costi sanitari prossimi a 80 miliardi di dollari all'anno e quasi 4 milioni di dollari a persona all'anno che sopravvivono a un grave TBI3,4,5. L'impatto della TBI è evidenziato dalle significative complicazioni neurocognitive e neuropsichiatriche a lungo termine subite dai suoi sopravvissuti con l'insidiosa insorgenza di disturbi comportamentali, cognitivi e motori chiamati Encefalopatia cronica traumatica (CTE) 6 È possibile: , 7 (in questo stato , 8 (IN vio , 9 (in vie , 10.Anche gli eventi concussivi subclinici, quegli impatti che non provocano sintomi clinici, possono portare a disfunzione neurologica a lungo termine11,12.
I modelli animali per lo studio della TBI sono statiimpiegati dalla fine del 1800 13 . Negli anni '80, è stato sviluppato un impattore pneumatico allo scopo di modellare TBI. Questo metodo è ora indicato come impatto corticale controllato (CCI)14. Il controllo e la riproducibilità del CCI hanno portato i ricercatori ad adattare il modello per l'uso nei roditori15. Il nostro laboratorio utilizza questo modello per indurre TBI tramite un impattonte disponibile in commercio e un dispositivo di azionamento elettronico16,17. Questo modello è in grado di produrre una vasta gamma di stati TBI clinicamente applicabili a seconda dei parametri biomeccanici utilizzati. La valutazione istologica dei cervelli TBI dopo una grave lesione indotta nel nostro laboratorio dimostra una significativa perdita corticale e ippocampale ipsilaterale, nonché edema e distorsione contralaterali. Inoltre, CCI produce un compromissione costante della funzione motoria e cognitiva misurata da analisi comportamentali18. Le limitazioni alla CCI includono la necessità di craniotomia e le spese per l'acquisizione dell'impactor e l'azionamento del dispositivo.
Esistono diversi modelli aggiuntivi di TBI e sono ben consolidati nella letteratura, tra cui il modello di percussioni fluide laterali, il modello di goccia di peso e il modello di lesione esplosiva19,20,21. Mentre ognuno di questi modelli ha i loro vantaggi distinti i loro principali inconvenienti sono lesioni miste, alta mortalità e mancanza di standardizzazione, rispettivamente22. Inoltre, nessuno di questi modelli offre l'accuratezza, la precisione e la riproducibilità del CCI. Regolando i parametri biomeccanici inseriti nel dispositivo azionante, il modello CCI consente allo sperimentatore un controllo preciso sulle dimensioni della lesione, sulla profondità della lesione e sull'energia cinetica applicata al cervello. Questo dà agli investigatori la capacità di applicare l'intero spettro di TBI ad aree specifiche del cervello. Permette anche la più grande riproducibilità dall'esperimento alla sperimentazione.

<table><tbody><tr><td>Soluzione sterile di xilazina per iniezione AnaSed</td><td>LLOYD, Inc.</td><td></td><td></td>5939911020</tr><tr><td>Buprenorfina SR Lab 0,5 mg/mL</td><td>Zoopharm-Wildlife Pharmaceuticals USA</td><td>BSRLAB0.5-182012</td><td></td></tr><tr><td>Micromotore rotativo ad alta velocità KiT0</td><td>Foredom Electric Company</td><td>K.1070</td><td></td></tr><tr><td>Imapact one per Stereotaxix CCI</td><td>Leica Biosystems Nussloch GmbH</td><td>39463920</td><td></td></tr><tr><td>Ketathesia Ketamine HCl Injection USP</td><td>Henry Schein, Inc</td><td>56344</td><td></td></tr><tr><td>Base stereotassica specifica per mouse</td><td>Leica Biosystems Nussloch GmbH</td><td>39462980</td><td></td></tr><tr><td>Trephines per Micro Drill</td><td>Fine Science Tools, Inc</td><td>18004-50</td><td></td></tr></tbody></table>

modello murine di impatto corticale controllato per l'induzione di lesioni cerebrali traumatiche

Murine Model of Controlled Cortical Impact for the Induction of Traumatic Brain Injury

I Centers for Disease Control e La Prevenzione degli Infortuni stimano che quasi 2 milioni di persone subiscano una lesione cerebrale traumatica (TBI) ogni anno negli Stati Uniti. Infatti, la TBI è un fattore che contribuisce a oltre un terzo di tutta la mortalità legata alle lesioni. Ciò nonostante, i meccanismi cellulari e molecolari alla base della fisiopatologia della TBI sono poco compresi. Pertanto, i modelli preclinici di TBI in grado di replicare i meccanismi di lesione pertinenti alla TBI nei pazienti umani sono un'esigenza critica di ricerca. Il modello a impatto corticale controllato (CCI) di TBI utilizza un dispositivo meccanico per avere un impatto diretto sulla corteccia esposta. Sebbene nessun modello possa riassumere pienamente i diversi modelli di lesione e la natura eterogenea della TBI nei pazienti umani, cCI è in grado di indurre un'ampia gamma di TBI clinicamente applicabili. Inoltre, il CCI è facilmente standardizzato, consentendo agli investigatori di confrontare i risultati tra esperimenti e gruppi investigativi. Il seguente protocollo è una descrizione dettagliata dell'applicazione di un CCI grave con un dispositivo di impatto disponibile in commercio in un modello murino di TBI.

L'impattore si monta direttamente sul telaio stereotassico consentendo fino a 10 m di risoluzione per il controllo del punto di impatto, profondità e penetrazione. Le forze elettromagnetiche impiegate possono impartire velocità di impatto che vanno da 1,5 a 6 m/s. Ciò consente una precisione e una riproducibilità senza precedenti su tutta la gamma di TBI clinicamente rilevanti. I ricercatori possono eseguire esperimenti pilota modificando i parametri della lesione, come la dimensione della punta dell'impatto, la velocità...

Qui descriviamo un protocollo per l'induzione di lesioni cerebrali traumatiche murine attraverso un impatto corticale controllato a testa aperta.

Modello Murine di impatto corticale controllato per l'induzione di lesioni cerebrali traumatiche

The Centers for Disease Control and Injury Prevention estimate that almost 2 million people sustain a traumatic brain injury (TBI) every year in the ...

L'impatto corticale controllato è facile da standardizzare tra soggetti ed esperimenti e consente l'applicazione dell'intero spettro di lesioni cerebrali traumatiche a regioni del cervello definite con precisione. A dimostrare questa procedura è Mecca Islam, un tecnico di ricerca nel mio laboratorio. Questa tecnica rimane la forma più coerente e riproducibile di indurre lesioni cerebrali traumatiche nei roditori.Prima di iniziare la procedura, collegare il dispositivo di impatto al telaio operativo stereotassico. Se il dispositivo di azionamento con i parametri biomeccanici desiderati per la velocità sperimentale appropriata e il tempo di pozzo. Indossare nuovi dispositivi di protezione individuale e guanti sterili e confermare la mancanza di risposta al dito del piedi nel mouse sperimentale anestetizzato.Usa i tosaerba per radere la pelliccia per il sito chirurgico e applicare un unguento agli occhi dell'animale. Quindi posizionare il mouse in sala operatoria e predire la pelle rasata con tre scrub chirurgici sequenziali a base di iodio e alcol. Per indurre una lesione cerebrale corticale controllata, utilizzare prima un bisturi per fare un'incisione di un centimetro lungo la line

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Questo video mostra la procedura per indurre una lesione cerebrale traumatica a cranio aperto in un topo praticando un'incisione del cranio sulla linea mediana, perforando il cranio e rimuovendo il lembo osseo per esporre la corteccia cerebrale e applicando un'alta pressione per indurre un trauma. La ferita viene quindi suturata per preparare il modello murino per gli esperimenti successivi.

Generazione di un modello murino di lesione cerebrale traumatica utilizzando una sonda impattante

Questo video mostra la procedura per indurre una lesione cerebrale traumatica (TBI) in un modello murino. Un topo anestetizzato con un cranio esposto viene prelevato per creare un'apertura nel cranio, quindi viene indotta una lesione corticale controllata utilizzando un dispositivo di impatto. La lesione danneggia il tessuto cerebrale, causando una compromissione della funzione cognitiva e della coordinazione motoria.

Generazione di un modello murino di lesione cerebrale traumatica utilizzando un dispositivo di impatto

Fonte: Macheda, T., et. al. Modello a testa chiusa controllato elettromagneticamente di lieve lesione cerebrale traumatica nei topi. J. Vis. Exp. (2022)Questo video mostra la procedura per indurre una lesione alla testa chiusa in un modello murino utilizzando un frame stereotassico. L'impatto controllato replica la lesione cerebrale traumatica lieve, consentendo ai ricercatori di studiare gli effetti neurologici e il recupero misurando i riflessi e il comportamento post-infortunio.

Induzione di una lieve lesione cerebrale traumatica in un modello murino

Le lesioni cerebrali traumatiche (TBI) rimangono un serio problema di salute. Utilizzando il modello di chirurgia a impatto corticale controllato, possono essere eseguite ricerche sugli effetti del trauma cranico e sui possibili metodi di trattamento.

Controllata corticale modello Impact per trauma cranico

Gli atleti assorbono ogni anno centinaia di lievi infezioni traumatiche cerebrali (mTBI) / concussioni; Tuttavia, la conseguenza di queste nel cervello è poco capita. Pertanto, un modello animale di mTBI singolo e ripetitivo che replica costantemente sintomi clinicamente rilevanti fornisce i mezzi per avanzare lo studio di mTBI e concussione.

Un modello di mouse del singolo e ripetitivo dolore cerebrale traumatico lieve

Questo protocollo dimostra le metodologie per un modello murino di lesioni cerebrali traumatiche a cranio aperto e il trapianto di cellule derivate da cellule staminali pluripotenti indotte umane coltivate nel sito della lesione. Test comportamentali e istologici dei risultati di queste procedure sono descritti anche in breve.

Modello di impatto corticale controllato di lesioni cerebrali del topo con trapianto terapeutico di cellule neurali derivate da cellule staminali indotte dall'uomo

L'emorragia intraparenchimale e la neuroinfiammazione accompagnate da contusione cerebrale possono innescare gravi lesioni cerebrali secondarie. Questo protocollo descrive in dettaglio un modello di impatto corticale controllato (CCI) sui topi, che consente ai ricercatori di studiare l'emorragia, la contusione e le risposte immunitarie post-traumatiche ed esplorare potenziali terapie.

Un modello preclinico di impatto corticale controllato per emorragia traumatica, contusione e neuroinfiammazione

Il protocollo descrive una lieve lesione cerebrale traumatica in un modello murino. In particolare, viene spiegato un protocollo passo-passo per indurre un lieve trauma cranico chiuso della linea mediana e la caratterizzazione del modello animale.

Modello elettromagnetico controllato a testa chiusa di lieve lesione cerebrale traumatica nei topi

Qui, presentiamo un protocollo per stabilire un modello animale di trauma cranico chiuso che replica l'esito della neuroimmagine di una lesione cerebrale traumatica lieve non complicata con la struttura cerebrale preservata nella fase acuta e l'atrofia cerebrale a lungo termine. La risonanza magnetica longitudinale è il metodo principale utilizzato per l'evidenza.

Sviluppo di un modello non complicato di lesione cerebrale traumatica lieve modificato con il metodo della caduta di peso ed evidenziato dalla risonanza magnetica

Laterale fluido percussioni (LFP), un modello stabilito di lesioni cerebrali traumatiche nei topi, è dimostrato. LFP soddisfa tre criteri principali per i modelli animali: rilevanza validità, l'affidabilità e la clinica. La procedura, che consiste di craniotomia chirurgica, la fissazione del mozzo seguita da induzione di lesioni, con conseguente lesioni focali e diffuse, è descritto.

Fluido laterale Percussioni: Modello delle lesioni cerebrali traumatiche nei topi

Impara il modello di impatto corticale controllato per indurre lesioni cerebrali traumatiche nei topi. Questo metodo standardizzato consente analisi comportamentali, di imaging e studi molecolari sul tessuto cerebrale.

Modello Murine di impatto corticale controllato per l'induzione di lesioni cerebrali traumatiche

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