Name: Sistema microdrive ibrido con sonda Opto-Silicon recuperabile e tetrode per la registrazione ad alta densità a doppio sito in mouse in movimento libero (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: Scopri come costruire un sistema microdrive ibrido con tetrode e sonda opto-silicon per registrazioni elettrofisiologiche e manipolazioni optogenetiche in topi in movimento libero. Questo metodo consente registrazioni stabili ad alta densità in più regioni cerebrali.

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Questo lavoro è stato sostenuto in parte dalla Japan Society for the Promotion of Science Overseas Research Fellowships (HO), Endowed Scholar Program (TK), Human Frontier Science Program (TK), Brain Research Foundation (TK), Faculty Science and Technology Acquisition e Retention Program (TK), Brain & Behavior Research Foundation (TK), e dalla Sumitomo Foundation Research Grant (JY), NARSAD Young Investigator Research Grant (JY). Ringraziamo W. Marks per preziosi commenti e suggerimenti durante la preparazione del manoscritto.

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il protocollo dimostra come costruire e impiantare un array ibrido di microdrive che consente la registrazione di attività neurali da due aree cerebrali utilizzando tetrodi regolabili indipendenti e una sonda di silicio in topi che si comportano liberamente. Dimostra anche esperimenti optogenetici e il recupero della sonda di silicio dopo gli esperimenti. Mentre la sonda in silicone regolabile33 o l'impianto 36 della sonda opto-silicio sono dimostrati in precedenza nei topi...

È fondamentale capire come l'attività neuronale supporta il processo cognitivo, come l'apprendimento e la memoria, studiando come diverse regioni del cervello interagiscono dinamicamente tra loro. Per chiarire le dinamiche dell'attività neurale alla base dei compiti cognitivi, l'elettrofisiologia extracellulare su larga scala è stata condotta in animali liberamente in movimento con l'aiuto di array di microdrive1,2,3, 4. Negli ultimi due decenni, diversi tipi di array di microdrive sono stati sviluppati per impiantare elettrodi in più regioni cerebrali per ratti5,6,7,8 e topi9, 10 del sistema , 11 Del sistema di , 12.Tuttavia, gli attuali progetti di microtrasmissioni generalmente non consentono l'uso di più tipi di sonde, costringendo i ricercatori a scegliere un singolo tipo di elettrodo con vantaggi e limitazioni specifici. Ad esempio, gli array di tetrodo funzionano bene per regioni cerebrali densamente popolate come l'ippocampo dorsale CA11,13, mentre le sonde in silicio danno un profilo geometrico migliore per studiare le connessioni anatomiche14 , 15.
Tetrodi e sonde in silicio sono spesso utilizzati per la registrazione cronica in vivo, e ognuno ha i propri vantaggi e svantaggi. Tetrode hanno dimostrato di avere vantaggi significativi in un migliore isolamento unità singola rispetto agli elettrodi singoli16,17, oltre all'efficacia dei costi e rigidità meccanica. Forniscono inoltre maggiori rese di attività a unità singola se combinate con microdioni8,18,19,20. È essenziale aumentare il numero di neuroni registrati contemporaneamente per comprendere la funzione dei circuiti neurali21. Ad esempio, è necessario un gran numero di cellule per studiare piccole popolazioni di tipi di cellule funzionalmente eterogenee, come22 celle correlate al tempo o codici di ricompensa23 celle. Sono necessari numeri di cella molto più alti per migliorare la qualità di decodifica delle sequenze di picco13,24,25.
I tetrodi, tuttavia, hanno uno svantaggio nella registrazione di cellule distribuite spazialmente, come nella corteccia o nel talamo. A differenza dei tetrodi, le sonde in silicio possono fornire la distribuzione spaziale e l'interazione dei potenziali di campo locale (LFP) e le attività di chiodare all'interno di una struttura locale14,26. Le sonde in silicio multi-shank aumentano ulteriormente il numero di siti di registrazione e consentono la registrazione su strutture singole o vicine27. Tuttavia, tali array sono meno flessibili nel posizionamento dei siti di elettrodi rispetto ai tetrodi. Inoltre, sono necessari complessi algoritmi di ordinamento dei picchi nelle sonde ad alta densità per estrarre informazioni sui potenziali d'azione dei canali vicini per specchiare i dati acquisiti dai tetrodi28,29,30. Di conseguenza, la resa complessiva delle singole unità è spesso inferiore a i tetrodi. Inoltre, le sonde in silicio sono svantaggiose a causa della loro fragilità e dei costi elevati. Pertanto, la scelta delle sonde tetrodi contro silicio dipende dall'obiettivo della registrazione, che è una questione di ottenere un alto rendimento di unità singole o profilazione spaziale nei siti di registrazione è prioritaria.
Oltre a registrare l'attività neurale, la manipolazione optogenetica è diventata uno degli strumenti più potenti in neuroscienza per esaminare come specifici tipi di cellule e/o percorsi contribuiscono alle funzioni del circuito neurale13,31, 32,33. Tuttavia, gli esperimenti optogenetici richiedono un'ulteriore considerazione nella progettazione di array di microdrive per collegare il connettore in fibra per stimolare le sorgenti luminose34,35,36. Spesso, il collegamento di fibre ottiche richiede una forza relativamente grande, che può portare a uno spostamento meccanico della sonda nel cervello. Pertanto, non è un compito banale combinare una fibra ottica impiantabile agli array di microdrive convenzionali.
Per i motivi di cui sopra, i ricercatori sono tenuti a ottimizzare la selezione del tipo di elettrodo o per impiantare una fibra ottica a seconda dello scopo della registrazione. Ad esempio i tetrodi vengono utilizzati per ottenere una maggiore resa unitaria nell'ippocampo1,13, mentre le sonde di silicio vengono utilizzate per studiare il profilo di profondità laminare delle aree corticali, come la corteccia entorinale medianale (MEC)37. Attualmente, microdrive per l'impianto simultaneo di tetrodi e sonde di silicio erano stati segnalati per i ratti5,11. Tuttavia, è estremamente difficile impiantare più tetrodi e sonde in silicio nei topi a causa del peso dei microdrive, dello spazio limitato sulla testa del mouse e dei requisiti spaziali per la progettazione del microdrive per impiegare sonde diverse. Sebbene sia possibile impiantare sonde in silicio senza micromotore, questa procedura non consente la regolazione della sonda e abbassa il tasso di successo del recupero della sonda di silicio12,38. Inoltre, gli esperimenti optogenetici richiedono considerazioni aggiuntive nella progettazione di array di microdrive. Questo protocollo dimostra come costruire e impiantare un array di microdrive per la registrazione cronica in topi liberamente in movimento, che consente l'impianto di nove tetrodi regolabili in modo indipendente e una sonda opto-silicone regolabile. Questo array di microdrive facilita anche gli esperimenti optogenetici e il recupero della sonda di silicio.

<table><tbody><tr><td>#00-90 vite</td><td>J.I. Morris</td><td>#00-90-1/8</td><td>viti EIB</td></tr><tr><td>#0-80 dado</td><td>Piccole parti</td><td>B00DGB7CT2</td><td>dado in ottone per il fissaggio del supporto della ghiera in fibra</td></tr><tr><td>#0-80 vite</td><td>per piccole parti</td><td>B000FMZ57G</td><td>della macchina in ottone per il montaggio del connettore della sonda, il supporto della ghiera in fibra e il cono di schermatura</td></tr><tr><td>22 Ga tubi in polietereterchetone</td><td>Piccole parti</td><td>SLPT-22-24</td><td>per il fissaggio alla navetta, diametro interno 0,025 pollici</td></tr><tr><td>Tubo inossidabile 23 Ga Piccole</td><td>parti</td><td>HTX-23R</td><td>per tetrodo</td></tr><tr><td>Filo inossidabile 23 Ga</td><td>Piccole parti</td><td>HTX-23R-24-10</td><td>per cavo a forma di L/supporto</td></tr><tr><td>Filo inossidabile 26 Ga</td><td>Piccole parti</td><td>GWX-0200</td><td>per pali di guida</td></tr><tr><td>Filo inossidabile 30 Ga</td><td>Piccole parti</td><td>HTX-30R</td><td>per tetrodo</td></tr><tr><td>pacchetto software CAD 3D</td><td>Dassault Syst&egrave; mes</td><td>SolidWorks 2003</td><td></td></tr><tr><td>stampante 3D</td><td>FormLab</td><td>Form2</td><td></td></tr><tr><td>5.5mil tubi isolanti in poliimmide</td><td>HPC Medical</td><td>72113900001-012</td><td></td></tr><tr><td>nastro in foglio di alluminio</td><td>Tyco</td><td>Tyco Adhesives 617022 nastro in foglio di alluminio</td><td>per il cono di schermatura alternativo</td></tr><tr>pasta<td>conduttiva</td><td>YSHIELD</td><td>HSF54</td><td>per cono</td></tr> <tr><td>di schermaturaviti personalizzate per microdrive con sonda al silicio</td><td>AMT</td><td>UNM1.25-HalfMoon</td><td>vite a mezzaluna in acciaio inox, diametro 1,5 mm, 300 e micro; Viti personalizzate con passo filettatura m</td></tr><tr><td>per tetrodo microdrive</td><td>AMT</td><td>Yamamoto_0000-160_9mm</td><td>vite inox con intaglio, diametro 0,5 mm, 160 &; m passo della filettatura, su misura per il nostro design</td></tr><tr><td>acrilico dentale</td><td>Stoelting</td><td>51459</td><td></td></tr><tr><td>resina per modelli dentali</td><td>FormLab</td><td>RS-F2-DMBE-02</td><td></td></tr><tr><td>Utensile rotante Dremel</td><td>modello 800</td> una punta da <td>trapano per smerigliatrice</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fine Science Tool</td><td>19007-05</td><td></td></tr><tr><td>scheda di interfaccia elettrica</td><td>Neuralynx</td><td>EIB-36-Narrow</td><td></td></tr><tr><td>epossidico</td><td>Devcon</td><td>GLU-735.90</td> 5 minuti unguento <td>oculare epossidico</td></tr><tr><td></td><td>Dechra</td><td>Puralube Unguento oftalmico</td><td>per evitare che gli occhi dei topi si secchino durante l'intervento chirurgico</td></tr><tr><td>foglio di lucidatura delle fibre</td><td>Thorlabs</td><td>LFG5P</td><td>per lucidare le</td></tr><tr><td>pinzette fini</td> in fibra ottica <td>Protech International</td><td>15-368</td><td>per caricare/recuperare l'oro della sonda in silicone</td></tr><tr><td> perni</td><td>Neuralynx</td><td>EIB Pins Piccolo</td><td></td></tr><tr><td>filo di terra</td><td>A-M Systems</td><td>781500</td><td>0,010 pollici filo d'argento nudo</td></tr><tr><td>headstage preamplificatore</td><td>Neuralynx</td><td>HS-36</td><td></td></tr><tr><td>impedenziometro</td><td>BAK electronics</td><td>Modello IMP-2</td><td>1 kHz frequenza di prova</td></tr><tr><td>olio minerale</td><td>ZONA</td><td>36-105</td><td>per la lubrificazione di viti e fili</td></tr><tr><td>fibra ottica</td><td>Doric</td><td>MFC_200/260-0.22_50mm_ZF1,25(G)_FLT</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di registrazione</td><td>Neuralynx</td><td>Digital Lynx 4SX</td><td></td></tr><tr><td>scriba in fibra di rubino</td><td>Thorlabs</td><td>S90R</td><td>per la scissione del grasso al silicio in fibra ottica</td></tr><tr><td></td><td>Fine Science Tool</td><td>29051-45</td><td></td></tr><tr><td>sonda al silicio</td><td>Neuronexus</td><td>A1x32-Edge-5mm-20-177</td><td>Fig. 3, 4A, 4B, 5</td></tr><tr><td>sonda in silicone</td><td>Neuronexus</td><td>A1x32-6mm-50-177</td><td>Fig. 4C</td></tr><tr><td>soluzione per il lavaggio della sonda in silicone</td><td>Alcon</td><td>AL10078844</td><td>detergente per lenti a contatto</td></tr><tr><td>lubrificante in silicone</td><td>Smooth-On</td><td>Dragon Skin 10 FAST</td><td>per la preparazione di stampi per microdrive</td></tr><tr><td>vernice d'argento</td><td>GC electronic</td><td>22-023</td><td>rivestimento in argento stampato, utilizzato per fili di terra</td></tr><tr><td>vite del cranio</td><td>Otto Frei</td><td>2647-10AC</td> Forbici chirurgiche standard <td>diametro 0,8 mm, passo filettatura 0,200 mm</td></tr> Apparecchio stereotassico <tr><td></td><td>ROBOZ</td><td>RS-5880</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Kopf</td><td>Modello 942</td><td></td></tr><tr><td>Super colla</td><td>Loctite</td><td>LOC230992</td><td>per l'applicazione su perni</td></tr><tr><td>guida Pinzette chirurgiche</td><td>ROBOZ</td><td>RS-5135</td><td></td></tr><tr><td>Tetrode Twister</td><td>Jun Yamamoto</td><td>TT-01</td><td></td></tr><tr><td>fili tetrodo</td><td>Sandvik</td><td>PX000004</td><td></td></tr></tbody></table>

sistema microdrive ibrido con sonda opto-silicon recuperabile e tetrode per la registrazione ad alta densità a doppio sito in mouse in movimento libero

Hybrid Microdrive System with Recoverable Opto-Silicon Probe and Tetrode for Dual-Site High Density Recording in Freely Moving Mice

Le registrazioni neurali multi-regionali possono fornire informazioni cruciali per comprendere le interazioni della scala cronologica fine tra più regioni del cervello. Tuttavia, i progetti di microtrasmissioni convenzionali spesso consentono l'uso di un solo tipo di elettrodo per registrare da regioni singole o multiple, limitando la resa delle registrazioni del profilo a unità singola o di profondità. Spesso limita anche la capacità di combinare le registrazioni degli elettrodi con strumenti optogenetici per indirizzare l'attività specifica del percorso e/o del tipo di cellula. Qui è presentato un array di microdrive ibrido per mouse liberamente in movimento per ottimizzare la resa e una descrizione della sua fabbricazione e riutilizzo dell'array di microdrive. L'attuale progetto impiega nove tetrodi e una sonda opto-silicone impiantata in due diverse aree cerebrali contemporaneamente in topi liberamente in movimento. I tetrodi e la sonda opto-silicone sono regolabili in modo indipendente lungo l'asse dorsoventrale nel cervello per massimizzare la resa delle attività di unità e oscillatorie. Questo array di microdrive incorpora anche un set-up per la manipolazione optogenetica leggera e di mediazione per studiare le risposte e le funzioni specifiche del tipo di cellule o regionali o dei circuiti neurali dei circuiti neurali a lungo raggio. Inoltre, la sonda opto-silicone può essere recuperata in modo sicuro e riutilizzata in modo sicuro dopo ogni esperimento. Poiché l'array di microdrive è costituito da parti stampate in 3D, la progettazione di microdrive può essere facilmente modificata per adattarsi a varie impostazioni. Primo descritto è la progettazione dell'array di microdrive e come collegare la fibra ottica a una sonda di silicio per esperimenti di optogenetica, seguita dalla fabbricazione del fascio di tetrodo e dall'impianto dell'array in un cervello di topo. La registrazione dei potenziali sul campo locale e dell'unità di spinking combinata con la stimolazione optogenetica dimostrano anche la fattibilità del sistema di micro-operatori in topi in movimento libero.

L'array di microdrive è stato costruito entro 5 giorni. La tempistica della preparazione del microdrive è descritta nella Tabella 2. Utilizzando questo microdrive, nove tetrodi e una sonda di silicio sono stati impiantati nell'ippocampo CA1 e MEC del topo [21 settimana prima/29 g peso corporeo maschio pOxr1-Cre (C57BL/6 sfondo)], rispettivamente. Questo topo transgenico esprime Cre nei neuroni piramidali dello strato MEC III. Il topo è stato iniettato con 200 nL di AAV5-DIO-ChR2-YFP (titro: 7,7 x 10...

Questo protocollo descrive la costruzione di un array ibrido di microdrive che consente l'impianto di nove tetrodi regolabili in modo indipendente e una sonda opto-silicone regolabile in due regioni cerebrali in topi in movimento libero. Di dimostrato è anche un metodo per recuperare e riutilizzare in modo sicuro la sonda opto-silicone per molteplici scopi.

Sistema microdrive ibrido con sonda Opto-Silicon recuperabile e tetrode per la registrazione ad alta densità a doppio sito in mouse in movimento libero

Multi-regional neural recordings can provide crucial information to understanding fine-timescale interactions between multiple brain regions. However, ...

Il nostro design ibrido microdrive consente agli sperimentatori non solo di registrare da più regioni cerebrali, ma anche di scegliere diversi tipi di elettrodi per ottimizzare la resa e la stabilità. Abbiamo combinato nove tetrodi, una sonda lineare al silicio e fibre ottiche regolabili e riutilizzabili in un array di microdrive per esperimenti in vivo con topi che si muovono liberamente. Questa tecnica può essere facilmente adattata ad altri animali più grandi come ratti o marmotte.Le sonde di silicio sono estremamente fragili. Dobbiamo stare attenti quando abbiamo a che fare con le sonde, ad esempio, quando adattiamo la fibra ottica e quando si ruota il gruppo navetta nel microdrive. L'array di microdrive è composto da cinque parti.Per preparare la vite del microdrive per la sonda di silicio, stampare prima in 3D un motivo plastico del microdrive e posizionare il nastro attorno al modello per creare una parete temporanea intorno al modello. Versare gel di silicio liquido nel modello e rimuovere le bolle d'aria con delicati scuotimenti. Quando il silicio è stato polimerinato, rimuovere con cura lo stampo in gel di silicio dal modello.Successivamente utilizzare una smerigliatrice rotante per tagliare lunghezze di 18 e 9,5 mm di tubo metallico in acciaio inossidabile calibro 23 e utilizzare la smerigliatrice per sgrossare i primi 2-3 mm dei tubi. Applicare un piccolo volume di olio di silicio su una vite personalizzata e impostare i tubi e la vite nello stampo. Versare l'acrilico dentale nello stampo e utilizzare una siringa per eliminare eventuali bolle d'aria intorno ai tubi e alla vite.Quando l'acrilico dentale è completamente polimero, rimuovere la vite del microdrive dallo stampo e utilizzare pinze per piegare 6 mm da un'estremità della punta del filo da 18 mm a un angolo di 60 gradi. Utilizzando uno strumento di tornitura ruotare la vite del microdrive per verificare la qualità, quindi installare la vite del microdrive nel corpo dell'array di microdrive e ruotare la vite per verificare se è in grado di muoversi su e giù senza intoppi. Per preparare la navetta per la sonda di silicio utilizzare forbici affilate per tagliare due lunghezze di 5 mm di PEEK e allineare i tubi su entrambi i lati dello shuttle.Incollare i tubi alla navetta con epossidico e applicare un piccolo volume di olio di silicio sui posti guida. Quando l'epossidico si è asciugato, posizionare la navetta sopra i posti guida del corpo dell'array di microdrive per verificare la qualità. La navetta dovrebbe muoversi senza intoppi senza attrito eccessivo.Per preparare l'optorode utilizzare una fresa Rubi per scindere un pezzo di fibra ottica a 21 mm di lunghezza e macinare la punta della fibra fino a quando non è piatta e lucida. Quando la punta è pronta, posizionare delicatamente la fibra ottica sul lato anteriore della sonda di silicio da 200 a 300 micrometri sopra la parte superiore dei siti dell'elettrodo e fissare temporaneamente la fibra con nastro trasparente, quindi incollare la fibra ottica alla base della sonda di silicio con un piccolo volume di epossidico e consentire all'epossidico di polimerizzarsi per cinque ore. Per collegare la navetta alla sonda di silicio applicare un piccolo volume di epossidico sul retro della base della sonda di silicio e tenere delicatamente la parte inferiore dello shuttle contro la base della sonda di silicio per due o tre minuti per evitare la formazione di uno spazio tra la navetta e la base della sonda di silicio.Quando l'epossidico si è completamente polimerizzato tenere la scanalatura della navetta con pinzette fini e utilizzare un microscopio per posizionare con cura i tubi navetta sui posti guida del corpo principale. Ruotare la vite per inserire la vite del microdrive nel foro della vite e inserire la punta del tubo a forma di L nella scanalatura della testa dello shuttle per innestare la sonda di silicio e la vite del microdrive. Quindi tagliare due viti numero 0 a una lunghezza del filetto di 3,5 mm e macinare le punte per rimuovere le bave.Posizionare il supporto del connettore della sonda sul corpo dell'array e inserire il connettore elettrico della sonda di silicio nel supporto. Inserire le viti numero 0 per contenere il supporto del connettore della sonda. Utilizzare epossidico per fissare il connettore della sonda di silicio nel supporto facendo attenzione a non incollare la sonda al corpo dell'array di microdrive.Per collegare il porta ferrule alla sonda opto-silicio e al corpo dell'array di microdrive, tagliare due viti numero 0 a una lunghezza del filetto di 6 mm e macinare le punte. Macinare l'esterno di due dadi a vite della macchina numero 0 per realizzare piccoli dadi esagonale con diametri esterni da 2,5 a 3 mm e inserire la vite numero 0 nel componente A del supporto. Incollare le teste delle viti con epossidico.Applicare un piccolo volume di grasso di silicio sui componenti A e B per ridurre l'attrito con il corpo. Utilizzare pinzette inverse per inserire temporaneamente il componente A nel corpo e posizionare il componente B sulle viti del componente A.Infilare i dadi personalizzati sulle viti e utilizzare pinze per stringere i dadi per fissare il portavite sul corpo. Inserire il ferrule in fibra nella scanalatura del portaregola in fibra facendo attenzione che il ferrule in fibra si attacchi da 4 a 5 mm dal supporto.Applicare una piccola quantità di epossidico tra il ferrule e la scanalatura del supporto. Quando l'epossidico è polimerizzato, allentare i dadi e ruotare la vite del microdrive per controllare la navetta e il porta ferrule per un movimento fluido, quindi confermare che la punta della sonda si ritrae completamente nel corpo quando il portaregola si trova nella posizione superiore e i tubi navetta sono ancora associati ai posti guida. Per fissare il cono dello scudo, fissare due viti numero 0 da 3,5 mm dall'esterno del cono per tenere il microdrive in posizione.L'array di microdrive può essere impostato entro cinque giorni se la costruzione viene completata in base alla sequenza temporale delineata nella tabella. Dopo la regolazione del tetrodo le prestazioni comportamentali possono essere testate su una pista lineare e in un campo aperto. In entrambi i tipi di esperimenti il mouse può esplorare liberamente per circa 30 minuti mentre i segnali elettrofisiologici vengono registrati senza rumori gravi legati al movimento durante la sessione di registrazione.La stimolazione della luce può quindi essere eseguita alla corteccia entorinale mediale per stimolare i neuroni mediali della corteccia entorinale strato 3 che si proiettano nel sottocampo CA1 dell'ippocampo. Le attività spontanee di spiking e le potenzialità di campo locali vengono quindi registrate dai tetrodi e dalla sonda di silicio quando il mouse dorme. In questo esperimento rappresentativo i potenziali di campo sinistro registrati nei tetrodi hanno dimostrato grandi attività a catena suggerendo che tutti i tetrodi erano posizionati in prossimità dello strato cellulare piramidale CA1.Le attività reattive indotte dalla luce in questo saggio sono state osservate per la prima volta nella corteccia entorinale mediale seguite da attività all'interno di CA1 con 13-18 millisecondi di latenza. Fare attenzione a inserire la sonda opto-silicio nel corpo del microdrive in un ambiente privo di elettrostatica. Il cono di schermatura può essere sostituito con materiali come un foglio di carta e nastro adesivo.Ciò ridurrà la velocità del microdrive fino al 20%Il nostro design microdrive offre scelte flessibili per una combinazione efficace di elettrodi di registrazione per misurare e manipolare più regioni cerebrali e per indagare le dinamiche e le interazioni delle diverse strutture cerebrali.

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