Sistema di analisi dell'angiogenesi tridimensionale utilizzando Gli spheroidi co-culturali formati da cellule formanti colonia endoteliale e cellule staminali mesenchiche

Questo sistema sferoide co-coltura 3D è progettato per imitare l'angiogenesi fisiologica. Sarà efficace per valutare potenziali modulatori angiogenici e fornirà informazioni prevedibili prima degli studi in vivo. Questo sistema utilizza sferoidi co-coltura formati da due cellule progenitrici vascolari e può essere usato per indagare le interazioni cellulari, la germogliazione e la maturazione tubolare dell'angiogenesi fisiologica.

Se possiamo usare le cellule del paziente per formare sferoidi co-coltura, possiamo usare questo sistema per sviluppare trattamenti personalizzati per malattie anomale legate all'angiogenesi, come il cancro. Questo sistema di dosaggio può aumentare la sensibilità e l'efficienza degli studi sull'angiogenesi e sullo sviluppo di farmaci. Iniziare utilizzando lo 05% di tripside-EDTA per scollegare ECFC e MTC dall'80 al 90% di colture cellulari confluenti rispettivamente per tre o cinque minuti in un incubatore di colture cellulari.

Disattivare la tripina con un mezzo DMEM fresco e completare le celle alcune volte per generare una singola sospensione cellulare. Raccogliere le cellule per centrifugazione, seguite da due lavaggi con mezzo privo di siero. Dopo il secondo lavaggio, diluire gli ECFC a tre volte 10 fino alle sei cellule per millilitro di media concentrazione e gli MCC a due volte 10 alle sei cellule per millimetro di concentrazione media in singoli tubi a microcentrifugo a due millilitri.

Pellet le cellule per centrifugazione e aspira con cura tutti tranne gli ultimi 15-25 microlitri di supernatante da ogni campione cellulare. Successivamente, resospedere ogni pellet in 250 microlitri di C diluito da un kit colorante fluorescente e pipettare delicatamente le sospensioni cellulari per garantire una completa dispersione. Aggiungere 250 microlitri di PKH67 a 20 micromolari appena preparati al tubo degli ECFC.

Aggiungere 250 microlitri di PKH26 a 12 micromolari al tubo dei CBC. Mescolare immediatamente entrambe le sospensioni cellulari. Dopo cinque minuti a temperatura ambiente con scuotimento, protetto dalla luce, interrompere il processo di colorazione con un minuto di incubazione in 0,5 millilitri di FBS per tubo.

Alla fine dell'incubazione, raccogliere le cellule per centrifugazione e rimuovere con cura il supernatante, seguito da due lavaggi in due millilitri di mezzo fresco completo per lavaggio. Quindi sospendere le celle nel rispettivo mezzo in tubi da 15 millilitri. Per la generazione di sferoidi, dopo il secondo lavaggio, diluire prima le sospensioni cellulari nell'appropriata concentrazione del mezzo di crescita cellulare endoteliale MV2 integrato con soluzione di cellulosa metile al 20% e concentrazione di siero bovino fetale del 5%.

Quindi, aggiungere ogni sospensione cellulare in un serbatoio rettangolare in polistirolo sterilizzato. Utilizzare una pipetta multicanale per aggiungere circa goccioline di celle da 125 microlitri sul coperchio di una piastra di coltura di 150 millimetri. Quando tutte le cellule sono state aggiunte, invertire la copertura sul fondo di un piatto contenente 15 millilitri di PBS e posizionare le piastre nell'incubatrice di coltura cellulare per 24 ore.

Il giorno successivo, sciacquare le coperture dei piatti con cinque millilitri di PBS in un tubo da 50 millilitri per piatto. Risciacquare le coperture con altri cinque millilitri di PBS per raccogliere eventuali sferoidi rimanenti e pellettizzare gli sferoidi per centrifugazione. Scartare con cura tutti tranne gli ultimi 100-200 microlitri di supernatante e toccare delicatamente la parete del tubo in modo che gli sferoidi siano liberamente sospesi nel supernatante rimanente.

Aggiungere il volume appropriato del mezzo di crescita delle cellule endoteliali MV2 integrato con siero bovino fetale al 5% e soluzione di cellulosa metile al 40% in ciascun tubo per rimostrare gli sferoidi a 100 sferoidi per millilitro di media concentrazione. Utilizzare una punta di pipetta da un millilitro tagliata a un diametro da tre a cinque millimetri per mescolare delicatamente le sospensioni sferoide. Utilizzare una nuova pipetta wide-tip da un millilitro per mescolare la soluzione di sospensione dello sferoide con un gel di collagene neutralizzato di tipo I con un rapporto uno a uno sul ghiaccio.

Aggiungere 900 microlitri di ogni soluzione di gel di collagene che sospende lo sferoide nei pozzi di una piastra preriscaldata da 24 pompoli. Lasciare polimerizzare le sospensioni per 30 minuti nell'incubatore di coltura cellulare, prima di coprire gli sferoidi con 100 microlitri di mezzo di crescita cellulare endoteliale MV2 integrati con 2,5% FBS e 50 nanogrammi per millilitro di VEGF agli sferoidi solo ECFC e mezzo integrato con FBS solo alle colture sferoide MSC ed ECFC-plus-MSC. Quindi posizionare ogni piastra in un registratore di cellule in tempo reale installato in un incubatore di coltura cellulare e concentrarsi casualmente su da cinque a 10 sferoidi con un ingrandimento di 10 volte per monitorare la formazione di germogliare di ogni sferoide etichettato a fluorescenza ogni ora per 24 ore.

Per quantificare la germinazione dello sferoide, importate i file di immagine in ImageJ e misurate il numero e la lunghezza dei germogli che esprimono il segnale fluorescente appropriato da cinque sferoidi selezionati casualmente per gruppo sperimentale. Per gli sferoidi ECFC-plus-MSC, il numero di germogli e la lunghezza cumulativa del germoglio sono significativamente più alti rispetto a quelli degli sferoidi solo ECFC in tutti i punti di tempo. Gli sferoidi solo MSC non formano germogli ma dimostrano una migrazione individuale della MSC al di fuori degli sferoidi.

L'etichettatura dell'ECFC con colorante verde-fluorescente e MSC con colorante rosso-fluorescente prima di combinarsi per generare sferoidi ECFC-plus-MSC dimostra che le strutture del germoglio mediate da ECFC sono coperte da MSC, suggerendo che i CCI combinati funzionano come cellule perivascolari durante la formazione del germoglio, migliorando la stabilità e la durata del germoglio attraverso la stretta associazione tra due cellule vascolari. Gli sferoidi ECFC-plus-MSC pretrattati con un inibitore dell'angiogenesi mostrano una diminuzione del numero di germogli e una lunghezza cumulativa del germoglio in modo dipendente dalla dose rispetto ai sferoidi ECFC-plus-MSC di controllo. Negli esperimenti paralleli, gli sferoidi solo ECFC pretrattati con l'inibitore seguito dalla stimolazione con VEGF dimostrano anche una diminuzione del numero di germogli indotta dal fattore di crescita e della lunghezza cumulativa del germoglio in modo dipendente dalla dose.

Da notare che è necessaria una maggiore concentrazione di inibitore dell'angiogenesi per inibire gli sferoidi ECFC-plus-MSC rispetto agli sferoidi solo ECFC. La crescita del tumore è significativamente inibita negli animali trattati con inibitori dell'angiogenesi ad alta dose rispetto agli animali trattati con controllo e agli animali trattati con inibitore dell'angiogenesi a bassa dose in un modello di topo tumorale allo xenografto umano. La concentrazione plasmatica di bevacizumab nei topi trattati con dosi elevate era di 568 più o meno 40,62 microgrammi per millilitro, che era più vicina al valore IC50 di bevacizumab per inibire la lunghezza cumulativa del germoglio negli sferoidi ECFC-plus-MSC piuttosto che negli sferoidi solo ECFC.

Ciò suggerisce che il sistema di co-coltura ECFC-plus-MSC è adatto per prevedere concentrazioni plasmatiche efficaci prima di uno studio sugli animali. L'uso di una pipetta wide-tip da un mL per mescolare delicatamente gli sferoidi mentre sono in gel di collagene sul ghiaccio è importante per proteggere l'integrità degli sferoidi. Possiamo modificare questo sistema per introdurre altri tipi di cellule come le cellule immunitarie e altre matrici extracellulari per indagare il crosstalk della matrice cellulare durante l'angiogenesi.