Name: Biomeccanica edonteliale perturbatrice tramite Connexin 43 Disgregazione strutturale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Scopri un metodo biomeccanico per disgregare la connexin 43 e misurare le trazioni e le sollecitazioni intercellulari nelle cellule endoteliali. Questa tecnica integra analisi biochimiche e biomeccaniche per studiare processi fisiopatologici come metastasi tumorali e aterosclerosi.

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Questo lavoro è stato sostenuto dai fondi di start-up dell'Università della Florida centrale e dal National Heart, Lung, And Blood Institute del National Institute of Health sotto il premio K25HL132098.

1. Produrre gel poliacrilammide (PA)
<ol><li>
Preparazione del piatto Petri
	<ol>
<li>Preparare la soluzione legare la soluzione silarante mescolando 200 mL di acqua ultrapura con 80 .L acido acetico e 50 .L di 3-(trimethoxysilyl)methacrylato. Bind silane è una soluzione utilizzata per funzionalizzare la superficie della piastra Petri fondo di vetro per l'attacco idrogel.</li>
		<li>Mescolare la soluzione di sbarramento su una piastra di mescolare per almeno 1 h.</li>
		<li>Trattare il pozzo centrale della piastra Petri con soluzione silano a scalo per 45 min.</li>
		<li>Rimuovere la soluzione silaceri di rilegamento e sciacquare la piastra Petri con acqua ultra-pura 2x-3x.</li>
		<li>Asciugare la superficie del piatto Petri e conservarla a temperatura ambiente per un uso futuro.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparazione della soluzione idrogel
	<ol>
<li>Mescolare acqua ultra-pura, 40% acrilammide e 2% bis-acrilamide in un tubo di centrifuga di 15 mL secondo la tabella 1.</li>
		<li>Aggiungere 80 gradi di perline fluorescenti alla soluzione idrogel.</li>
		<li>Scuotere delicatamente il tubo per mescolare le perline con la soluzione di gel.</li>
		<li>Stringere leggermente il tappo del tubo sul tubo di centrifuga e posizionarlo in una camera a vuoto.</li>
		<li>Degas la soluzione gel per almeno 45 min nella camera a vuoto.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Polimerizzazione idrogel
	<ol>
<li>In primo luogo, aggiungere 75 L del 10% di persolto di ammonio (disciolto in acqua ultrapura) e poi aggiungere 8 -L di TEMED (N,N,N',N'-tetramethylethane-1,2-diamine) alla soluzione idrogel.</li>
		<li>Collocare 24 - L di soluzione idrogel al centro del piatto Petri (vedi tabella 2).</li>
		<li>Utilizzare un coperchio da 18 mm per appiattire l'idrogel. Questo darà un'altezza di 100 m.</li>
		<li>Attendere almeno 30-40 min per la polimerizzazione gel.</li>
		<li>Immergere l'idrogel polimerizzato in acqua ultrapura per prevenire la disidratazione del gel.</li>
		<li>Coprire il piatto Petri con un foglio di alluminio per evitare il fotosbiancamento di perline fluorescenti e conservare a 4 gradi centigradi. NOTA: Gli idrogel possono essere conservati per un periodo fino a 3 mesi, ma si suggerisce che questi gel siano utilizzati non più di 1 settimana dopo la fabbricazione per ottenere i migliori risultati.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Cultura cellulare
<ol><li>Coltura cellule endoteliali ombelicali (HUVEC) nel mezzo di coltura cellulare 200 (vedi Tabella dei materiali) integrato con 1% penicillina-streptomicina su flaconi rivestiti di gelatina 0.1% a 37 gradi centigradi e 5% CO2.</li>
</ol>3. Preparazione stencil Micropattern
<ol><li>Curare un sottile strato di polidimetetiloxane (PDMS) in una parabola Petri da 100 mm mescolando la base in silicone con l'agente di polimerazione in silicone a un rapporto di 20:1 (base: agente di polimerità). NOTA: È possibile utilizzare altri rapporti agente di base (ad es. 10:1 o 30:1). Tuttavia, un rapporto tra base e agente di polimerità inferiore produrrà un modello più rigido, mentre un rapporto base-agente di stagionatura più alto produrrà un modello più morbido.</li>
	<li>Preparare una soluzione PDMS 20:1 (agente di base:stagionatura) e mescolare con cura in un tubo di centrifuga di 50 mL. Invertire il tubo capovolto e agitare vigorosamente più volte per garantire una corretta miscelazione della soluzione PDMS, in quanto la miscelazione non uniforme si tradurrà in una polimerizzazione incompleta.</li>
	<li>Rimuovere le bolle introdotte dal passaggio precedente centrifudendo la soluzione PDMS per 1 min a 190 x g.</li>
	<li>Versare 5-6 mL di soluzione PDMS al centro di una parabola Petri da 100 mm e agitare il piatto fino a quando la soluzione PDMS copre l'intera superficie della piastra Petri.</li>
	<li>Curare la soluzione PDMS durante la notte a 50-60 gradi centigradi. Il PDMS può anche essere curato a temperatura ambiente.</li>
	<li>Rimuovere uno stencil PDMS circolare di 16 mm di diametro con un perforatore.</li>
	<li>Utilizzare un punzone biopsia per creare piccoli fori nello stencil PDMS. Questo protocollo utilizza un punzone biopsia di 1,25 mm di diametro.</li>
	<li>Sterilizzare gli stencil PDMS prima immergendoli nel 70% di etanolo per 2-3 min, aspirando l'etanolo in eccesso e quindi posizionando sotto una luce UV per 5 min.</li>
</ol>4. Rivestimento idrogel collagen-i
<ol><li>Togliere il coperchio dall'idrogel e aspirare qualsiasi liquido in eccesso.</li>
	<li>Posizionare lo stencil PDMS sulla superficie dell'idrogel. NOTA: Le pinzette possono essere utilizzate per applicare una leggera pressione allo stencil PDMS per garantire una tenuta a tenuta d'acqua tra lo stencil PDMS e la superficie idrogel. I nostri stencil PDMS sono a tenuta d'acqua e quindi impediscono l'accesso all'acqua tra la superficie superiore del gel e la superficie inferiore dello stencil PDMS. Inoltre, la rigidità dell'idrogel non deve essere regolata rispetto alla rigidità del PDMS.</li>
	<li>Coprire la superficie idrogel con sulfosucciminimidyl-6-(4-azido-2-nitrophelamino) esanotato (sulfo-SANPAH) sciolto in una soluzione cuscinetto da 0,1 M HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinethanethanesulfonic) con una concentrazione di 1 : 1000 e posta sotto uv lampada (potenza 36 W) per 8 min.</li>
	<li>Aspirati la soluzione solfo-SANPAH e HEPES in eccesso e risciacquano due volte l'idrogel con 0,1 M DI HEPES seguiti da altri due risciacquo con acqua ultra-pura.</li>
	<li>Aspirare l'acqua ultrapura e gli idrogel del mantello con 0,1 mg/mL di collagene-I durante la notte a 4 gradi centigradi.</li>
	<li>Coprire i piatti e proteggere le perline fluorescenti dal fotosbiancamento. NOTA: gli stencil PDMS vengono utilizzati per creare monostrati micromodellati. I monostrati micropattern sono utilizzati in quanto consentono di osservare contemporaneamente più monostrati della stessa geometria e delle stesse dimensioni durante ogni esperimento. Tuttavia, se i micromodelli non sono desiderati, i passaggi precedenti possono essere seguiti con l'eccezione del passaggio 4.2.</li>
</ol>5. Creazione di monostrati HUVEC su idrogel
<ol><li>Utilizzare 1x di prova per staccare le cellule dai flaconi di coltura tissutale per 3-5 min nell'incubatrice.</li>
	<li>Dopo la prova, aggiungere i supporti di coltura cellulare alla soluzione trypsin e aggiungere al tubo di centrifuga di 15 mL.</li>
	<li>Centrifugare la soluzione cellulare per 3 min a 1710 x g. Un piccolo pellet bianco di cellule dovrebbe essere visibile nella parte inferiore del tubo di centrifuga.</li>
	<li>Aspirare il supernatante e risospendere le cellule nei media ad una concentrazione di 50 x 104 cellule / mL.</li>
	<li>Rimuovere il collagene-I dall'idrogel e risciacquare 1x con PBS.</li>
	<li>Aggiungete 75 x 103 celle nella parte superiore dello stencil PDMS e permettete alle cellule di attaccarsi alla superficie dell'idrogel per almeno 1 h nell'incubatrice a 37 e 5% di CO2.</li>
	<li>Rimuovere lo stencil PDMS e aggiungere almeno 2 mL di supporti al piatto Petri. Immergere lo stencil PDMS in 10x trypsin per rimuovere eventuali cellule collegate e sterilizzare spruzzando con 70% etanolo e poi mettendo sotto la luce UV per 5 min.</li>
	<li>Mettere il piatto Petri nell'incubatrice e attendere almeno 36 h o fino a quando non viene osservato un monostrato confluente.</li>
</ol>6. 2,5 trattamento dihydroxychalcone per l'interruzione di Cx43
<ol><li>Sciogliere 2,5 dihydroxychalcone (chalcone) in ditilfossido di dimetilzot (DMSO) per creare una soluzione stock da 0,1875 mg/mL.</li>
	<li>Diluire la soluzione di stock con i mezzi di coltura cellulare per creare una bassa concentrazione di chalcone (0,2 g/mL) e un'alta concentrazione di chalcone (2 g/mL) aliquota.</li>
</ol>7. Acquisizione dei dati
<ol><li>Individuare le isole cellulari con un microscopio.</li>
	<li>Acquisire il contrasto di fase e le immagini di perline per la morfologia delle cellule di immagine e spostamenti di idrogel, rispettivamente. NOTA: questo protocollo utilizzava un obiettivo 10x per l'acquisizione dei dati.</li>
	<li>Alla fine dell'esperimento, scollegare le cellule con 10x trypsin e acquisire un'immagine della superficie del gel senza cellule (immagine di riferimento).</li>
</ol>8. Immunostaining
<ol><li>Fissare monostrati con 4% formaldeide e incubare a 37 gradi centigradi per 15 min.</li>
	<li>Rimuovere il 4% di formaldeide e aggiungere 0.2% Triton X-100 per 5 min a 37 gradi centigradi per permeabilizzare le cellule.</li>
	<li>Rimuovere lo 0,2% Triton X-100 e risciacquare i monostrati con PBS 2x-3x.</li>
	<li>Coprire il monostrato con la soluzione 2% di albumina di siero bovino (BSA) per 45 min a 37 gradi centigradi.</li>
	<li>Rimuovere la soluzione BSA del 2% e risciacquare i monostrati con PBS 2x-3x.</li>
	<li>Aggiungere al campione l'anticorpo primario Cx43 ad una concentrazione di 1:400 e incubare pertutta la notte.</li>
	<li>Rimuovere l'anticorpo primario e risciacquare il campione con PBS 2x-3x.</li>
	<li>Aggiungere l'anticorpo secondario ad una concentrazione di 3:200 e incubare per 2 h a 37 . NOTA: i campioni devono essere coperti per evitare il fotosbiancamento.</li>
	<li>Rimuovere l'anticorpo secondario e risciacquare con PBS 2x-3x.</li>
	<li>Campione di copertura con supporto di montaggio (Fluromount-G DAPI) e guaritivo con coperchio da 18 mm.</li>
</ol>9. Implementazione della microscopia a forza di trazione (TFM) e della microscopia a stress monostrato (MSM)
<ol><li>
Calcolo della deformazione dell'idrogel NOTA: di seguito è riportata una procedura di calcolo dello spostamento passo-passo utilizzando MATLAB.<ol>
<li>Aprire il file traction.m principale in MATLAB (per tutte le routine MATLAB vedere Materiali supplementari). NOTA: seguire le istruzioni fornite nel codice per impostare la directory MATLAB.</li>
		<li>Definisci le seguenti variabili: formato immagine, conversione pixel-micron, modulo di Young, rapporto di Poisson e obiettivo del microscopio.</li>
		<li>Individuate il tallone, l'immagine trypsin e l'immagine di fase utilizzando la subroutine OpenFiles. NOTA: per set di dati di grandi dimensioni, è consigliabile denominare i file in ordine sequenziale. Ad esempio, i file devono essere denominati "nomefile1.tif", "nomefile2.tif" e così via.</li>
		<li>Definire un ROI quadrato (regione di interesse) intorno al monostrato di cella ed eseguire la subroutine cell_cropper per ritagliare l'immagine originale.</li>
		<li>Eseguire la subroutine di displacement_finder per calcolare gli spostamenti.</li>
		<li>Eseguire la subroutine Dedrift per rimuovere eventuali spostamenti non cellulari aggiuntivi che possono essere dovuti alla deriva dello stadio al microscopio.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Calcolo delle trazioni NOTA: Qui, le trazioni non vincolate vengono calcolate utilizzando la nostra routine MATLAB scritta su misura. Il calcolo della trazione passo dopo passo utilizzando la routine MATLAB menzionata in precedenza è riportato di seguito.<ol>
<li>Definire le seguenti variabili all'interno della routine traction.m: condizione limite, spessore del gel, altezza del gel e dedrift.</li>
		<li>Eseguire la subroutine traction_finder per calcolare le trazioni ed eseguire la subroutine plot_traction per tracciare le trazioni. Tutte le trazioni in direzione x (Tx) e direzione y (Ty) insieme alle corrispondenti posizioni dei pixel possono essere trovate in un file traction.dat che verrà generato dal codice.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Calcolo delle sollecitazioni intercellulari NOTA: Di seguito sono riportate le istruzioni passo passo per il calcolo della sollecitazione intercellulare utilizzando la routine MATLAB menzionata in precedenza.<ol>
<li>Eseguite la subroutine mark_circular_domain per specificare il limite del monostrato. Questa routine richiederà all'utente di disegnare manualmente un contorno intorno al monostrato per tutte le immagini di fase ritagliate in sequenza. Nota gli nXPt generati nella finestra di comando e usali in un secondo momento come parametri della griglia sia nell'asse X che nell'asse Y per l'analisi FEM (vedere il passaggio 9.3.2).</li>
		<li>Eseguire Run_StressCode per calcolare le sollecitazioni intercellulari. Questa subroutine legge direttamente i parametri dal file "model.in" ed esegue "island.exe" per eseguire l'analisi FEM. Prima di eseguire questa routine, assicurarsi che tutti i parametri nel file model.in, ad esempio i parametri della griglia nella conversione X e Y, pixel a micron, modulo di Young del gel, rapporto di Poisson, altezza del monostrato e pattern monostrato (striscia o foro), siano modificati Correttamente.</li>
		<li>Tracciate tutti i risultati FEM utilizzando la subroutine plot_FEM_results. NOTA: tutti i risultati generati verranno automaticamente memorizzati nella cartella Risultati nella directory MATLAB.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il nostro gruppo, così come altri, ha utilizzato con successo TFM e MSM per sondare l'influenza delle giunzioni cellula-cellula in vari processi cellulari patologici e fisiologici in vitro7,15,18,27 . Per esempio, Hardin e altri hanno presentato uno studio molto approfondito che suggerisce guide di trasmissione intercellulare della trasmissione della stress la formazione di gap paracellulare ne...

Il campo che si riferisce allo studio degli effetti delle forze fisiche e delle proprietà meccaniche sulla fisiologia e patologia cellulare e tissutale è noto come meccanobiologia1. Alcune tecniche utili che sono state utilizzate nella meccanobiologia sono la microscopia a stress monostrato e la microscopia a forza di trazione. La microscopia a forza di trazione consente il calcolo delle trazioni generate nell'interfaccia del substrato cellulare, mentre la microscopia a sollecitazione del monostrato consente il calcolo delle sollecitazioni intercellulari generate tra celle adiacenti all'interno di un monostrato2 ,3,4,5,6. I risultati ottenuti dai metodi precedenti hanno suggerito che le sollecitazioni meccaniche derivate dalle cellule svolgono un ruolo cruciale nel determinare il destino di una serie di processi cellulari3,4,5. Ad esempio, dopo l'esposizione a una forza meccanica esterna, un gruppo di cellule che migrano collettivamente può alterare la loro morfologia e polarizzare la loro forma per allineare e migrare lungo la direzione della forza applicata, in parte, generando trazioni7, 8. Le trazioni forniscono una metrica che può essere utilizzata per valutare la contrattilità delle celle e vengono calcolate utilizzando la microscopia della forza di trazione (TFM). La microscopia della forza di trazione (TFM) inizia con la determinazione delle deformazioni del substrato indotte dalle cellule seguita dal calcolo del campo di trazione utilizzando un approccio computazionale matematicamente rigoroso e basato sulla meccanica. Dal momento che la capacità di calcolare le trazioni è stata intorno per un bel po 'di tempo, i ricercatori hanno utilizzato TFM per rivelare l'impatto che le trazioni hanno su una serie di processi, tra cui il cancro9, guarigione della ferita10 e valutazione del cardiaco ingegnerizzato tessuto11.
L'implementazione di TFM e MSM insieme può essere suddivisa in tre fasi essenziali che devono essere eseguite nel seguente ordine: in primo luogo, vengono determinate le deformazioni dell'idrogel prodotte dalle cellule; in secondo luogo, le trazioni vengono recuperate dalle deformazioni degli idrogel; e terzo, un approccio a elemento finito viene utilizzato per calcolare le sollecitazioni intercellulari normali e di taglio all'interno dell'intero monostrato. Per calcolare gli spostamenti di gel, le immagini di perline di fluorescenza con le cellule sono state confrontate con l'immagine di perline di riferimento (senza cellule) utilizzando una routine di velocitàmetria dell'immagine di particella (PIV) scritta su misura. Le dimensioni e la sovrapposizione della finestra di correlazione incrociata per l'analisi PIV sono state scelte rispettivamente per 32 x 32 pixel e 0,5. A questo punto, gli spostamenti dei pixel sono stati convertiti in micron moltiplicandosi con un fattore di conversione da pixel a micron (per il nostro microscopio, questo fattore di conversione è 0,65) per ottenere spostamenti in piano. Gli errori associati all'ignorare gli spostamenti fuori piano sono trascurabili12,13. Dopo il calcolo degli spostamenti in gel, ci sono due tipi di misurazioni di trazione che possono essere utilizzate, trazioni vincolate e trazioni non vincolate8,14. Le trazioni non vincolate forniscono il campo di trazione per l'intero campo visivo (comprese le regioni con e senza celle), mentre le trazioni vincolate forniscono il campo di trazione solo per le regioni che includono le celle14. Quindi, le sollecitazioni intercellulari vengono calcolate utilizzando la microscopia a stress monomero (MSM), che è un'estensione della microscopia a forza di trazione. L'attuazione di MSM si basa sull'assunto che le trazioni locali esercitate da un monostrato di cellule nell'interfaccia cellulare-substrato devono essere bilanciate da forze meccaniche trasmesse tra le cellule all'interfaccia cellulare, come richiesto dalle leggi di Newton7 ,12,13. Un presupposto chiave qui è che il monostrato cellulare può essere trattato come un foglio elastico sottile perché la distribuzione di trazione nel monostrato è nota e l'equilibrio di forza non dipende dalle proprietà del materiale cellulare. Un'altra ipotesi chiave è che le forze di trazione sono bilanciate da sollecitazioni intercellulari locali all'interno del campo visivo ottico (all'interno del monostrato) e l'influenza di questo equilibrio di forza è minima nella regione distale (al di fuori del monostrato)13. Pertanto, le condizioni di contorno definite da sollecitazioni intercellulari, spostamenti o una combinazione di entrambi al limite del monostrato sono cruciali per eseguire MSM13. Tenendo conto delle informazioni di cui sopra, utilizziamo MSM per eseguire un'analisi degli elementi finiti (FEM) per recuperare la sollecitazione massima principale(-max) e la sollecitazione principale minima(zmin)ruotando il piano di sollecitazione in ogni punto all'interno del Monostrato. Queste sollecitazioni principali vengono successivamente utilizzate per calcolare la media 2Ddella normale sollecitazione intercellulare [(((max 12,13. Questa procedura è descritta in dettaglio da Tambe etal.
La microscopia a stress monostrato (MSM) consente il calcolo delle sollecitazioni intercellulari cellulari generate all'interno di un monostrato6,7,8,12,13. Questi stress intercellulari sono stati suggeriti per essere importanti per la crescita e la riparazione dei tessuti, la guarigione delle ferite e la metastasi del cancro12,15,16,17. Inoltre, le sollecitazioni intercellulari sono state suggerite per essere importanti anche nella migrazione delle cellule endoteliali e nella funzione di barriera endoteliale17,18. Mentre le giunzioni cellulari-cellule come giunzioni strette e giunzioni di adesione sono state entrambe suggerite per svolgere un ruolo critico nella generazione e trasmissione della sollecitazione intercellulare endoteliale, il ruolo delle giunzioni gap rimane sfuggente. Le giunzioni gap collegano fisicamente celle adiacenti e forniscono un percorso per la corrente elettrica e le molecole (<1 KDa) per passare tra le celle vicine19,20,21. Sebbene le cellule endoteliali esprimano le giunzioni gap Cx37, Cx40 e Cx4319,22, Cx43 è probabilmente la più importante in termini di progressione della malattia23. Prova dell'importanza di Cx43 può essere trovato nel fatto che la delezione genetica di Cx43 nei topi si traduce in ipotensione24 e ha effetti negativi sull'angiogenesi25. Inoltre, Cx43 è stato documentato per essere importante per la migrazione cellulare e la proliferazione e nella progressione dell'aterosclerosi18,22,23,24,25 .
In questo protocollo, abbiamo usato TFM e MSM per studiare se la generazione di trazione e stress intercellulare all'interno del monostrato confluente e endoteliale sarebbe stata influenzata dall'interruzione della giunzione del gap endoteliale Cx43. Abbiamo interrotto Cx43 con 2,5-dihydroxychalcone (chalcone), una molecola documentata per inibire l'espressione Cx4326. Chalcone è stato usato per interrompere cx43 invece di siRNA come chalcone è stato segnalato in precedenza da Lee et al. per interrompere l'espressione Cx4326. Inoltre, eravamo particolarmente interessati all'influenza di chalcone sull'endotelio in quanto è stato anche segnalato per essere un composto anti-infiammatorio e anti-platelet che può essere potenzialmente utilizzato per la prevenzione e il trattamento di vari vascolari patologie26. I trattamenti Chalcone sono stati eseguiti un'ora dopo l'inizio dell'esperimento, i monostrati trattati con chalcone sono stati immagini per un totale di sei ore e l'elaborazione delle immagini è stata eseguita con un codice MATLAB scritto su misura per determinare le trazioni e successivamente intercellulare Sottolinea. I nostri risultati hanno mostrato una diminuzione complessiva delle trazioni e delle sollecitazioni intercellulari, suggerendo che il Cx43 gioca un ruolo chiave nella biomeccanica endoteliale.

<table><tbody><tr><td>Vetrino coprioggetti da 18 mm</td><td>ThermoFisher</td><td>18CIR-1</td><td>Essenziale per appiattire i gel di poliacrilammide</td></tr><tr><td>2% bis-acrilammide</td><td>BIO-RAD</td><td>1610143</td><td>Componente del gel di poliacrilammide</td></tr><tr><td>2&prime;,5&prime;-Diidrossicalcone</td><td>SIGMA</td><td>IDF00046</td><td>Per interrompere la struttura Cx43</td></tr><tr><td>3-(Trimetossisilil)metacrilato di propile</td><td>SIGMA</td><td>2530-85-0</td><td>Soluzione madre per legare la miscela di silani con acido acetico e acqua ultrapura</td></tr><tr><td>40% Acrilammide</td><td>BIO-RAD</td><td>1610140</td><td>Componente del gel di poliacrilammide</td></tr><tr><td>Acido acetico</td><td>Fisher-Sceintific</td><td>64-19-7</td><td>Essenziale per legare la soluzione salina</td></tr><tr><td>Alexa Fluro 488 capra anti-topo IgG;</td><td>ThermoFisher</td><td>Catalog # A-11001</td><td>Anticorpo secondario</td></tr><tr><td>Persolfato di ammonio</td><td>BIO-RAD</td><td>1610700</td><td>Agente polimerizzante su gel di poliacrilammide</td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina (BSA)</td><td>SIGMA</td><td>9048-46-8</td><td>Per realizzare una soluzione bloccante</td></tr> Soluzione <tr><td>di atelo-collagene bovino di tipo I, 3 mg/mL, 100 mL</td><td>Advance Biomatrix</td><td>5005-100ML</td><td>Utilizzare come matrice</td></tr> <tr><td>extracellulareCorning Cell Culture Soluzione salina tamponata con fosfato (1x)</td><td>Fisher-Sceintific</td><td>21040CV</td><td>Soluzione salina tampone necessaria per la coltura cellulare</td></tr><tr><td>Dimetilsolfossido, Fisher BioReagents</td><td>Fisher-Sceintific</td><td>67-68-5</td><td>Per sciogliere il calcone e fare la soluzione madre</td></tr><tr><td>Fluoromount-G con DAPI</td><td>ThermoFisher</td><td>00-4959-52</td><td>Terreno di montaggio per immunostaing utilizzato per colorare per DAPI</td></tr><tr><td>Microsfera fluorescente Perle modificate con carbossilato</td><td>ThermoFisher</td><td>F8812</td><td>Perle modificate con carbossilato da 0,5 micron (rosso), 2% di solidi Soluzione tampone</td></tr><tr><td>HEPES 1 M</td><td>SIGMA</td><td>7365-45-9</td><td>Essenziale per</td></tr><tr><td>LVES</td><td>ThermoFisher</td><td>A1460801</td><td>Integratore essenziale di terreni HUEVC 200</td></tr><tr><td>Terreno 200 ThermoFisher</td><td></td><td>M200500</td><td>Terreni essenziali per colture</td></tr> <tr><td>cellulari HUVECAnticorpo monoclonale di topo Cx43 (CX - 1B1)</td><td>ThermoFisher</td><td>Catalog #13-8300</td><td>Anticorpo primario per piastra di Petri Cx43</td></tr><tr><td>(diametro 35 mm)</td><td>CellVis</td><td>D35-20-1.5H</td><td>Piastra di Petri da 35 mm con pozzetto centrale da 20 mm</td></tr><tr><td>Sulfo-SANPAH Crosslinker 100 mg</td><td>Proteochem</td><td>102568-43-4</td><td>Essenziale per funzionalizzare la superficie del gel di poliacrilammide</td></tr><tr><td>Kit di elastomeri siliconici SYLGARD 184</td><td>DOW corning</td><td>2646340</td><td>Elastomero siliconico con agente indurente per la produzione di PDMS</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>BIO-RAD</td><td></td> 1610801 <td>Agente polimerizzante su gel di poliacrilammide</td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>SIGMA</td><td>9002-93-1</td><td>Per permeabilizzare le cellule</td></tr><tr><td>Tripsina -EDTA</td><td>ThermoFisher</td><td>25300054</td><td>Utilizzato per il distacco delle cellule</td></tr></tbody></table>

biomeccanica edonteliale perturbatrice tramite connexin 43 disgregazione strutturale

Perturbing Endothelial Biomechanics via Connexin 43 Structural Disruption

Sono state create cellule endoteliali per generare sollecitazioni e trazioni intercellulari, ma il ruolo delle giunzioni gap giocate nella generazione di stress e trazione intercellulare endoteliale è attualmente sconosciuto. Pertanto, presentiamo qui un protocollo basato sulla meccanica per sondare l'influenza della giunzione gap connexin 43 (Cx43) ha sulla biomeccanica endoteliale esponendo monostrati endoteliali confluenti a un noto inibitore Cx43 2,5-dihydroxychalcone (chalcone) e misurando l'impatto di questo inibitore sulle trazioni e sulle sollecitazioni intercellulari. Vi presentiamo risultati rappresentativi, che mostrano una diminuzione sia delle trazioni che delle sollecitazioni intercellulari sotto un alto dosaggio di chalcone (2 g/mL) rispetto al controllo. Questo protocollo può essere applicato non solo a Cx43, ma anche ad altre giunzioni di gap, supponendo che venga utilizzato l'inibitore appropriato. Crediamo che questo protocollo sarà utile nei campi della ricerca cardiovascolare e meccanobiologia.

Le immagini a contrasto di fase del controllo, 0,2 g/mL e 2 monostrati di chalcone trattati con chalcone di fase sono state scattate 30 minuti prima del trattamento dei chalcone (Figura 1A-C) e 2 ore dopo il trattamento dei chalcone (Figura 1D-F). Sono stati osservati spostamenti di perline indotta da cellule (m) diminuire sia nelle condizioni di chalcone a bassa dose che in condizioni di chalcon...

Qui, presentiamo un protocollo basato sulla meccanica per interrompere la giunzione gap connexin 43 e misurare l'impatto successivo che questo ha sulla biomeccanica endoteliale attraverso l'osservazione di trazioni e sollecitazioni intercellulari.

Biomeccanica edonteliale perturbatrice tramite Connexin 43 Disgregazione strutturale

Endothelial cells have been established to generate intercellular stresses and tractions, but the role gap junctions play in endothelial intercellular ...

Questo protocollo è significativo in quanto consente di inucidare il ruolo delle forze cellulari in molti processi fisiologici e patologici, come la guarigione delle ferite e le metastasi tumorali, per esempio. Il principale vantaggio di questa tecnica basata sulla meccanica è la sua capacità di interrompere simultaneamente le giunzioni cellulari e misurare il suo impatto sulle forze meccaniche generate dalle cellule, principalmente trazioni e fattori di stress intercellulari. Il nostro protocollo è applicabile a una vasta gamma di processi fisiopatologici, come metastasi tumorali, aterosclerose e ipertensione, per esempio.I nostri metodi possono essere integrati per eseguire analisi biochimiche e biomeccaniche con modelli organo su chip, costrutti di tessuti bio-ingegnerizzati, sistemi di somministrazione di farmaci in vitro e sistemi di co-coltura tissutale. Il nostro protocollo è abbastanza semplice da eseguire. Tuttavia, consigliamo a coloro che es fanno questo protocollo per la prima volta di avere pazienza e di non affrettarsi attraverso i passaggi di questo protocollo.Il nostro protocollo ha passaggi unici che potrebbero non essere chiari per gli utenti per la prima volta. Pertanto, incoraggiamo gli utenti a seguire le nostre procedure dettagliate scritte e a utilizzare le dimostrazioni visive come guida. Per iniziare, preparare la soluzione blind-silane mescolando 200 millilitri di acqua ultra pura con 80 microlitri di acido acetico e 50 microlitri di metacrilato di silane.Mescolare la soluzione Bind-silane su una piastra di agitazione per almeno un'ora. Trattare il pozzo centrale di una piastra di Petri con la soluzione Bind-silane per 45 minuti. Rimuovere la soluzione Bind-silane e sciacquare la piastra di Petri con acqua ultra pura da due a tre volte.Asciugare la superficie della piastra di Petri e conservare a temperatura ambiente per un uso futuro. Per preparare la soluzione di idrogel, mescolare 12,49 millilitri di acqua ultra pura a 2,062 millilitri di acrilammide al 40% e 375 microlitri di 2%bisacrilammide in un tubo di centrifuga da 15 millilitri. Aggiungere 80 microlitri di perline fluorescenti alla soluzione di idrogel.Agitare delicatamente il tubo per mescolare le perline con la soluzione di gel. Tenere il cappuccio sciolto sul tubo di centrifuga e posizionarlo in una camera a vuoto. De-gas la soluzione di gel per almeno 45 minuti nella camera a vuoto.Per polimerizzare l'idrogel, aggiungere prima 75 microlitri di persolfato di ammonio al 10%, quindi aggiungere otto microlitri di TEMED alla soluzione di idrogel. Posizionare 24 microlitri della soluzione di idrogel al centro della piastra di Petri. Premere sull'idrogel con un coperchio di 18 millimetri scivolare per appiattire l'idrogel e fare un'altezza di circa 100 micrometri.Attendere almeno 30-40 minuti per la polimerizzazione del gel. Immergere l'idrogel polimerizzato in acqua ultra pura per prevenire la disidratazione del gel. Coprire la piastra di Petri con un foglio di alluminio per evitare il fotolicenza delle perline fluorescenti e conservare a quattro gradi Celsius.In primo luogo, mescolare la base in silicone PDMS con l'agente polimerizzante in silicone con un rapporto di 20 a uno in un tubo di centrifuga da 50 millilitri. Invertire il tubo capovolto e agitare vigorosamente più volte per garantire una corretta miscelazione della soluzione PDMS. Rimuovere le bolle nella soluzione PDMS centrifugando per un minuto a 190 volte G.Versare da cinque a sei millilitri della soluzione PDMS al centro di una piastra di Petri da 100 millimetri e agitare la piastra fino a quando la soluzione PDMS copre l'intera superficie della piastra di Petri.Curare la soluzione PDMS durante la notte a 50-60 gradi Celsius. Quindi, rimuovere uno stencil PDMS circolare di 16 millimetri di diametro con un perforatore. Utilizzare un punzone di biopsia di 1,25 millimetri di diametro per creare piccoli fori nello stencil PDMS.Sterilizzare gli stencil PDMS immergendoli in etanolo al 70% per due o tre minuti, aspirando l'etanolo in eccesso e quindi posizionandoli sotto una luce UV per cinque minuti. Aspirare qualsiasi liquido in eccesso e rimuovere lo scivolo di copertura dall'idrogel. Posizionare lo stencil PDMS sulla superficie dell'idrogel e utilizzare le pinzette per applicare una leggera pressione allo stencil PDMS per garantire una tenuta a tenuta d'acqua tra lo stencil PDMS e la superficie dell'idrogel.Coprire la superficie dell'idrogel con Sulfo-SAMPA sciolto in soluzione tampone HEPES molare 0.1 ad una concentrazione da uno a 1.000 e posizionare l'idrogel sotto una lampada UV con una potenza di 36 watt per otto minuti. Aspirare l'eccesso di soluzione Sulfo-SAMPA e HEPES e sciacquare l'idrogel due volte con HEPES molare 0.1 seguito da altri due risciacqui con acqua ultra pura. Aspirare l'acqua ultra pura in eccesso e utilizzare una pipetta da 200 microlitri per rivestire l'idrogel con 0,1 milligrammi per millilitro di Collagene-1.Coprire il piatto per proteggere le perline fluorescenti dal fotolicenza e conservare l'idrogel a quattro gradi Celsius durante la notte. Ora, aggiungere tre millilitri di 1X Tripina nel pallone e posizionarlo nell'incubatrice a 37 gradi Celsius per tre o cinque minuti per staccare le cellule dal pallone di coltura tissutale. Dopo la tripsidenza, aggiungere tre millilitri di mezzi di coltura cellulare nel pallone, ruotare per mescolare e trasferire la miscela in un tubo di centrifuga da 15 millilitri.Centrifugare la soluzione cellulare per tre minuti a 1.710 volte G.Aspirare il supernatante e sospendere di nuovo le cellule in mezzo a una concentrazione di 50 volte 10 alle quattro cellule per millilitro. Eserti il piatto di idrogel dal frigorifero. Rimuovere il Collagene-1 dall'idrogel e risciacquare una volta con PBS.Aggiungere 75 per 10 alle terze cellule nella parte superiore dello stencil PDMS e consentire alle cellule di attaccarsi alla superficie dell'idrogel per almeno un'ora nell'incubatore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Rimuovere lo stencil PDMS e immergere lo stencil PDMS in 10X Trypsin per 10-15 secondi per rimuovere eventuali celle collegate. Aggiungere almeno due millilitri di supporto alla piastra di Petri e sterilizzare lo stencil spruzzando con il 70% di etanolo, quindi posizionandolo sotto la luce UV per cinque minuti.Posizionare la piastra di Petri nell'incubatrice per almeno 36 ore o fino a quando non si osserva un monostrato confluente. Immagini di contrasto di fase di 30 minuti prima del trattamento concalcono e due ore dopo il confronto del trattamento con il calcone. Gli spostamenti di perline indotti dalle cellule sono stati osservati diminuire sia in condizioni di calcone a bassa dose che di calcone ad alta dose rispetto ai monostrati HUVEC di controllo.Prima del trattamento con chalcone, le trazione RMS erano circa 51 Pascal per tutte le condizioni. Dopo il trattamento con calcone, c'è stato un piccolo aumento delle trazioni RMS a 59 Pascal nei monostrati trattati con calcone a basse dosi e una diminuzione quasi doppia delle trazioni RMS a 18 Pascal in monostrati trattati con calcone ad alta dose rispetto al controllo. Il trattamento con Chalcone ha aumentato la magnitudine media normale dello stress intercellulare con bassa dose, ma ha diminuito significativamente la magnitudine media normale dello stress intercellulare con dose elevata rispetto al controllo.Il trattamento concalcono ha anche diminuito le sollecitazioni intercellulari massime a bassa e alta concentrazione di calcone rispetto al controllo. L'impatto del trattamento con calcone è statisticamente significativo sulla base sia dei test T che del test ANOVA a fattore singolo. Durante il posizionamento dello stencil PDMS sopra il gel, assicurarsi che il gel sia abbastanza asciutto da garantire una tenuta a tenuta d'acqua tra lo stencil PDMS e il gel.Questo protocollo può anche essere applicato per sondare il contributo biomeccanico di una varietà di giunzioni cellulari, proteine citoscheletriche, molecole di adesione a matrice cellulare o molecole extracellulari con imaging vivo. Con questo protocollo in vitro, i ricercatori possono ora indagare con successo una serie di proprietà biomeccaniche, così come biochimiche durante la riparazione dei tessuti, la guarigione delle ferite o metastasi tumorali senza modello animale. Consigliamo ai nostri spettatori di stare molto attenti durante la gestione del calcone e del DMSO poiché l'inalazione di questi farmaci è segnalata come dannosa.

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