Name: Le cellule staminali derivate dallag virale specifico t linfociti sopprimeno la replica HBV nei topi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-25T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: Scopri il trasferimento cellulare adottivo di linfociti T specifici per antigeni virali derivati da iPSC per sopprimere la replicazione dell'HBV nei topi. Questo metodo offre una terapia immunologica mirata contro l'epatite B.

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Gli autori ringraziano il Dr. Adam J Gehring del Toronto General Hospital Research Institute per aver fornito cDNA per HBs183-91 (s183) (FLLTRILTI) - specifici geni TCR umano-murine con restrizioni A2, e il Dr. Pei-Jer Chen della National Taiwan University per aver fornito pAAV/HBV 1.2. Questo lavoro è supportato dal National Institute of Health Grant R01AI121180, R01CA221867 e R21AI109239 a J. S.

Tutti gli esperimenti sugli animali sono approvati dal Texas A&M University Animal Care Committee (IACUC; #2018-0006) e sono condotti in conformità con le linee guida dell'Associazione per la valutazione e l'accreditamento della cura degli animali di laboratorio. I topi vengono utilizzati durante 6-9 settimane di età.
1. Generazione di cellule virali specifiche dell'ag8- T da iPSC (iPSC-CD8- cellule T)
<ol><li>Creazione dei costrutti retrovirali N.B.: I geni TCR e - sono collegati alla sequenza di auto-fessura 2A. Il vettore retrovirale MSCV-IRES-DsRed (MiDR) èDsRed 23.<ol>
<li>I geni TCR ibridi a basso clone183-191 (FLLTRILTI) specifici di A2(Figura 1A ) specifici del Multiqu (V-34 e V-28) specifici del MiDR per creare il costrutto MiDR s183 ( Figura 1A)25.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Trasduzione retrovirale NOTA: Le cellule Platinum-E (Plat-E) vengono utilizzate per confezionare retrovirus (portando geni TCR s183), che verranno utilizzati per la trasduzione retrovirale. Le cellule Plat-E sono un efficace retrovirus delle cellule che annoiano le cellule 293T, che sono state sviluppate mediante costrutti di imballaggio unici tramite il promotore di EF1 per esprimere la proteina della struttura retrovirale, tra cui gag, pol ed ecotropic env.<ol>
<li>Su un piatto di coltura 100 mm, semi 3 x 106 cellule Plat-E in 8 mL di mezzo di coltura DMEM contenente 10% siero di vitello fetale (FCS) in un'incubatrice a 37 s con 5% di CO2, 1 giorno prima della trasfezione.</li>
		<li>Il giorno 0, trasfecare il costrutto MiDR s183 nelle cellule Plat-E utilizzando un reagente di trasfezione del DNA25.</li>
		<li>Il primo giorno, il seme 1 x 106 iPSCs (GFP) in un piatto di coltura pre-rivestito di gelatina.</li>
		<li>Nei giorni 2-3, raccogliere retrovirus-contenente soppaldante dalla coltura cellulare Plat-E per trasduciare iPSC con il s183 TCR in presenza di 1,6-dibromohexane soluzione25.</li>
		<li>Il giorno 4, provare gli iPSC trasdotti dal gene TCR s183, centrifugare a 400 x g per 5 min e semi 3 x 105 iPSCs in un piatto di coltura 100 mm pre-rivestito con 3 x 106 irradiato SNL76/7 (irSNL76/7) celle alimentazione25.</li>
		<li>Il giorno 5 o 6 di confluenza, provare le cellule, centrifugare a 400 x g per 5 min ed elaborare per lo smistamento cellulare. Gating su cellule vive, ordinare GFP e DsRED cellule doppio-positive (iPSC transdotta dal gene TCR s183) utilizzando una selezionatrice cellulare ad alta velocità. Analogamente al passaggio 1.2.5, la cocoltura delle celle ordinate nelle celle dell'alimentatore irSNL76/7 per un utilizzo futuro25.</li>
	</ol></li>
	<li>Differenziazione delle cellule iPSC-CD8 specifiche dell'HBV NOTA: Le celle stromali OP9-DL1/DL4 sovraesprimono sia i ligandri Dich DL1 e DL4, sia gli iPSC co-culminanti con gli iPSC possono promuovere la differenziazione delle cellule T mediata dalla segnalazione di Notch26.<ol>
<li>Coltiva iPSC trandotti dal gene TCR s183 (s183/iPSCs) nel monostrato di cellule OP9-DL1-DL4 su supporti me-minimi essenziali (MEM) contenenti il 20% del siero bovino fetale (FBS)27. Includere murine Flt3 ligando (mFlt-3L; concentrazione finale - 5 ng/mL) nella coltura.</li>
		<li>Il giorno 0, il seme 0,5–1,0 x 105 S183/iPSC in un piatto di coltura di 10 cm precedentemente coltivato con cellule OP9-DL1-DL4. Verificare che le celle OP9-DL1-DL4 siano in una condizione di confluenza dell'80%-90%.</li>
		<li>Il giorno 5, risciacquare gli iPSC con 10 mL di salina con fosfato-buffer (PBS), aspirare al largo del PBS, aggiungere questo a 4 mL di 0,25% di trypsin, e incubare in un incubatore di 37 gradi C per 10 min. Accumulare tutte le soluzioni digestive contenenti le cellule e centrifugare a 400 x g per 5 min a 15-30 gradi centigradi.</li>
		<li>Aspirare il supernatante e resospendere le cellule in 10 mL di supporti iPSC. Trasferire la sospensione cellulare in una nuova piastra Petri da 10 cm e incubare in un'incubatrice per 30 min a 37 gradi centigradi.</li>
		<li>Dopo 30 min, raccogliere il supporto iPSC contenente le celle galleggianti. Passare la sospensione cellulare attraverso un colino cellulare di 70 m e calcolare il numero di cella.</li>
		<li>Seme 5 x 105 cellule nel piatto di coltura precedentemente coltivate cellule OP9-DL1-DL4 con una condizione di 80%–90% confluente come descritto nel passaggio 1.3.1. NOTA: per la differenziazione delle cellule T, ogni 2-3 giorni, le cellule derivate da iPSC devono essere nuovamente sottoposte a seeding con un nuovo strato delle celle OP9-DL1-DL4.</li>
	</ol></li>
	<li>valutazione f<ol>
<li>Cambiamenti morfologici di differenziazione degli iPSC<ol>
<li>Osservare le cellule al microscopio in vari giorni. NOTA: Al giorno 5, le colonie hanno caratteristiche simili al mesoderma, che presentano una moderna morfologia classica a forma di mandrino simile ai fibroblasti dermici umani e alla crescita sostenuta in vitro. Al giorno 8, iniziano a comparire piccoli gruppi rotondi di celle.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Analisi delle differenziazione degli iPSC per citometria di flusso<ol>
<li>In vari giorni di co-coltura, analizzare le cellule derivate da iPSC come descritto in precedenza25 (Figura 1B,C).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Analisi funzionale degli iPSC differenzianti<ol>
<li>Il giorno 28 della co-coltura, raccogliere le cellule iPSC-CD8- T dalle colture attraverso la raccolta delle cellule galleggianti, provare le cellule rimaste con 0.25% trypsin, ri-sospendere in 8 mL di supporti iPSC, centrifugare per 5 min a 400 x g a 15-30 C, rimuovere il supporto, quindi risospendere le celle in 10 mL di supporti.</li>
			<li>Conservare le celle risospese in un piatto fresco di 10 cm in un'incubatrice di 37 gradi centigradi per 30 min e assemblare le cellule galleggianti. Quindi sciacquare le cellule una volta con un PBS freddo.</li>
			<li>Incubare 3 x 106 T splenociti impoveriti di cellule (CD4-CD8-) da milza di h-2 di classe I knockout, topi HLA-A2.1-transgenici (HHD) con 5 s183 peptide (FLLTRILTI) in 200 litri di supporti a 4 gradi centigradi per 30 min.</li>
			<li>Produrre una miscela di cellule iPSC-CD8- T con splenociti pulsati con peptide s183 (cellule T: splenociti - 1:4; utilizzare 0,75 x 106 cellule T). Incubare la miscela di cellule a 37 gradi centigradi in un'incubatrice di CO2 per 40 h. Durante le ultime 7 h, aggiungere 4 . L di brefeldin A diluito nella coltura (concentrazione finale di 1.000x, che sarà diluito in 1x supporti di coltura) per bloccare i processi di trasporto durante l'attivazione cellulare.</li>
			<li>Macchiare le cellule ed eseguire l'analisi citometrica del flusso di IFN-z intracellulare come descritto in precedenza(Figura 2).</li>
		</ol>

</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Induzione della replicazione HBV attraverso la consegna idrodinamica del plasmide HBV
NOTA: il costrutto pAAV/HBV1.2 è stato generato come descritto in precedenza9. Il DNA completo HBV 1.2 è incorporato nel pAAV vettoriale.
<ol><li>Consegne idrodinamiche di plasmide HBV attraverso la vena posteriore<ol>
<li>Riscaldare i topi HHD utilizzando una lampada termica per 5 minuti nella gabbia al fine di dilatare la vena della coda.</li>
		<li>Trattenere l'animale tramite un carrello, e pulire le code di topo con 70% spray etanolo.</li>
		<li>Consegna di plasmide nel fegato.</li>
		<li>Misurare il peso corporeo del mouse utilizzando una scala di misurazione.</li>
		<li>Diluire 10 g di plasmide HBV nell'8% equivalente di massa corporea PBS (ad esempio, 1,6 mL per un mouse da 20 g). Caricare il plasmide diluito in una siringa da 3 mL con un ago ipodermico da 26 G x 1x2" (0,45 x 12 mm).</li>
		<li>Posizionare una delle due vene laterali della coda nel terzo centrale della coda e posizionare l'ago in entrambe le vene laterali. Somministrare l'iniezione contenente il plasmide HBV attraverso la vena posteriore entro 3 - 5 s.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Quantificazione della viremia dal siero di sangue dei topi infetti NOTA: la replica HBV avviene dal giorno 3-35 nel siero del mouse. La replicazione del DNA raggiunge il picco il giorno 7 e si riduce gradualmente. Il DNA HBV non viene eliminato dal siero fino al giorno 35.<ol>
<li>Raccolta del siero di sangue da topi infetti<ol>
<li>Raccogliere circa 0,1 mL di sangue in un tubo di microcentrifuga da ogni topo su 3, 5, 7 e 10 giorni dopo l'infezione mediante sanguinamento retroorbitale in un tubo di microcentrifuga da 1,5 ml, quindi incubare a temperatura ambiente (RT) per 20 min.</li>
			<li>Centrifugare il campione a 6.000 x g per 15 min a 4 gradi centigradi e raccogliere il siero supernatante dopo la centrifugazione.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Purificare il DNA dal siero del sangue utilizzando un kit di estrazione del DNA disponibile in commercio seguendo le raccomandazioni del produttore. In breve, lisi le cellule in una colonna a base di silice, eseguire i lavamenti ed estrarre il DNA aggiungendo 100% etanolo alla colonna di eluizione e centrifugando a 6000 x g per 1 min. Elute il DNA in 50 :L di acqua senza RNase.</li>
		<li>Utilizzare 100 ng di DNA HBV dall'eluzione per l'analisi PCR in tempo reale. Utilizzare i seguenti primer e sonde: forward 5' TAGGAGGCTGTAGGAAATTGG 3'; reverse 5' GCACAGCTTGGAGGCTGT 3'; sonda 5' TCACCTCTGCCTCTAATC 3'.<ol>
<li>Utilizzare il genoma HBV contenente plasmide (pAAV/HBV1.2) per la curva standard ed eseguire la PCR in tempo reale in un volume totale di 10(L 3).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Impostare la reazione PCR in un volume totale di 10 ,l, come mostrato nella Tabella 1.</li>
		<li>Impostare il programma PCR nel termociclore come illustrato nella tabella 2. Il tasso di transizione programmato della temperatura è di 20 gradi centigradi per la denaturazione/annealing e di 5 C/s per l'estensione. Misurare la fluorescenza alla fine della fase di annealing per ogni ciclo per il monitoraggio PCR in tempo reale.</li>
	</ol>

</li>
</ol>3. Riduzione della replica HBV da parte dell'ACT delle cellule virali ag-CD8- T
<ol><li>Trasferimento di celle adottivo (ACT)<ol>
<li>Differenziare s183/iPSCs (1.3.7) sulle cellule stromali OP9-DL1-DL4 in presenza di mFlt-3L e mIL-7 per 8 giorni, come descritto nella sezione 1.3.</li>
		<li>Il giorno 22, raccogliere le cellule iPSC-CD8- T dalla piastra da 10 cm con la trypsin, quindi lavare e riavviare ogni piastra da 10 cm in 10 mL di supporti freschi. Aggiungere le cellule a una piastra fresca di 10 cm e tornare all'incubatrice per 30 min come fatto nella sezione 1.3. Dopo 30 min, raccogliere le cellule galleggianti.</li>
		<li>Utilizzare un colino di nylon da 70 m per passare le cellule per eliminare gli ammassi di cellule e contare il numero di cella. Adattare le cellule a una concentrazione di 1,5 x 107 celle/mL in soluzione PBS a freddo e utilizzare un colino di nylon da 70 m per passare le cellule per eliminare nuovamente i cluster di cellule, se necessario. Tenere le cellule sul ghiaccio fino all'ACT.</li>
		<li>Iniettare i mouse HHD di 200 (3 x 106 cellule) in mouse HHD di 4-6 settimane attraverso la vena posteriore.</li>
	</ol></li>
	<li>Induzione della replica HBV<ol>
<li>Il giorno 14 dopo il trasferimento cellulare, eseguire la consegna idrodinamica del plasmide HBV attraverso la vena posteriore come descritto nella sezione 2.1.</li>
	</ol></li>
	<li>Rilevamento di proteine virali da fegato infetto<ol>
<li>Sacrificare i topi nei giorni 3, 5, 7, 14 e 21 post-infezione. Per l'eutanasia, in ogni gabbia, utilizzare 1–2 L di anidride carbonica (CO2)nella prima fase. Quando l'animale sviluppa la perdita di coscienza, ottenere la portata di CO2 intorno a 4-5 L/min. Eseguire l'eutanasia del topo utilizzando l'inalazione di CO2.</li>
		<li>Separare il fegato tagliando la pelle superficiale del peritoneo utilizzando forbici e pinze e trascinando leggermente il fegato indietro per scoprire la pelle interna che rivestola la cavità peritoneale. Raccogliere e tagliare i campioni di fegato (lunghezza x larghezza x altezza x 0,5 cm x 0,5 cm x 0,3 cm) dei topi infetti per adattarsi facilmente alla cassetta di incorporamento e bloccare in formalina buffer neutro 10% per 4-24 h.</li>
		<li>Decalcificare i campioni di fegatoutilizzando 2,5 M di acido formica; risciacquo in xilene per 3 min, risciacquare 2x in 100% etanolo, risciacquare 2x nel 95% di etanolo, risciacquare 2x in acqua deionizzata (DI) per 2 min, quindi decalcificare i campioni di fegato in 1 mM di acido etilenetratratratraeacetica (EDTA) corrispondentemente. Maneggiare a una temperatura sub-ebollizione (90 gradi centigradi) per 20 min.</li>
		<li>Raffreddare i tessuti epatici fissi per 30 min. Sciacquare i tessuti con 1x PBS per 4 min e incorporare i tessuti in paraffina. Disidratare i tessuti in una serie di crescenti concentrazioni di etanolo per sostituire l'acqua, e quindi immergersi in immersione xilene. Incorporare i tessuti infiltrati in blocchi di cera. Fare un sezionamento uniformemente verticale e orizzontale per la colorazione. Preparare 4 sezioni con un microtoma scorrevole.</li>
		<li>Passare le sezioni attraverso la deparaffinizzazione e la reidratazione utilizzando xilene ed etanolo, quindi eseguire la colorazione immunofluorescente delle sezioni.</li>
		<li>Macchiare le sezioni con 200 l di anticorpo specifico AG della superficie HBV (1:100 diluizione nella soluzione di blocco). Incubare le sezioni con l'anticorpo per 2 h a RT in una camera umidificata 75%–100% e lavare 5 volte in 1 x PBS per 5 min.</li>
		<li>Utilizzare un reagente anti-dissolvenza contenente 4',6-diamidino-2-fenylindole (DAPI) per la colorazione nucleare per contrastare i vetrini. Aggiungere la coverslip con circa 300 gradi l della diluita soluzione di colorazione DAPI (300 nM in 1x PBS) e convalidare l'intero coperchio coperto coperto. Tenere i vetrini al buio a 4 gradi centigradi fino all'ispezione al microscopio fluorescente.</li>
	</ol></li>
	<li>Infiltrazione infiammatoria delle cellule nei topi infetti<ol>
<li>Sacrificare i topi come descritto al punto 3.3.1. Raccogliere il fegato e fare sezioni come descritto nel passaggio 3.3.4.</li>
		<li>Macchiare la sezione con ematossilina ed eosina (H&E) per valutare l'infiltrazione delle cellule infiammatorie nel fegato.</li>
		<li>Conservare i vetrini al buio a 4 gradi centigradi fino a completare un'ulteriore analisi al microscopio fluorescente.</li>
		<li>Visualizzare i vetrini al microscopio a fluorescenza per rilevare l'infiltrazione delle cellule infiammatorie nel fegato (Figura 4).</li>
	</ol></li>
	<li>Rilevamento del DNA HBV del fegato infetto<ol>
<li>Isolamento del DNA virale.</li>
		<li>Eutanasia topi e raccogliere i campioni di fegato secondo la sezione 3.3.</li>
		<li>Lyse i tessuti epatici in Nonindet P-40 (NP-40) lyssi buffer (50 mM Tris-HCL, 1 mM EDTA, 1% NP-40) contenente un cocktail inibitore proteasi.</li>
		<li>Centrifuga brevemente a 16.000 x g per rimuovere i nuclei e detriti cellulari.</li>
		<li>Incubare il lisacito citoplasmico con nucleale micrococcico (nucleato S7; 150 unità/mL) e CaCl2 (5 mM) a 37 s per 90 min per degradare l'acido nucleico al di fuori dei nucleocapsidi (NC).</li>
		<li>Inattivare il nuclease S7 con l'aggiunta di 10 mM EDTA.</li>
		<li>Precipitare i nucleocapsidi con glicole di polietilene (PEG), interrompere dello 0,5% solfato di sodio dodecyl (SDS) e digerire con la proteinasi K (PK) di 0,6 mg/mL a 37 gradi centigradi per 1 h.</li>
		<li>Recuperare gli acidi nucleici virali mediante estrazione di cloroformio fenolo e precipitazioni di etanolo.</li>
		<li>Risolvere il DNA virale estratto su un gel di agarose dell'1,2% e rilevarlo mediante l'analisi standard della macchia meridionale utilizzando una sonda di DNA HBV con etichetta32 P.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questo protocollo presenta un metodo per generare gli iPSC-CTL virali specifici di Ag da utilizzare come ACT per sopprimere la replica HBV in un modello murino. Nell'infezione cronica da HBV, il genoma virale forma un mini cromosoma stabile, il DNA circolare covalentmente chiuso (cccDNA) che può persistere per tutta la durata della vita dell'epatocito. Mirare alla clearance del mini cromosoma virale può provocare una cura dell'infezione cronica da HBV. L'attuale terapia antivirale si rivolge alla trascrizione inversa del...

A seguito di infezione acuta, il sistema immunitario adattivo (cioè l'immunità umorale e cellulare) controlla la maggior parte dell'epatite acuta correlata all'HBV. Tuttavia, un certo numero di persone nelle regioni HBV-endemiche non può eliminare i virus e successivamente convertirsi come individui cronici. Più del 25% dei pazienti cronici (>250 milioni di persone) in tutto il mondo sviluppa malattie epatiche progressive, con conseguente cirrosi epatica e/o carcinoma epatocellulare (HCC)1. Di conseguenza, l'eradicazione delle cellule infettate insistenza rimane un problema generale di salubrità, anche se esiste un vaccino2 disponibile e numerosi farmaci antivirali sono in fase di sviluppo. Il trattamento standard per l'infezione da HBV include analoghi IFN-z, nucleoside e nucleotide. Questi agenti hanno attività antivirale diretta e capacità modulativi immunitarie. Tuttavia, la sieroconversione dell'antigene HBe (Ag)- portatori con anticorpo anti-HBe (Ab) e perdita di acido deossiribonucleico HBV del siero compaiono individualmente in circa il 20% dei pazienti trattati e il controllo immunologico completo del virus verificata dalla privazione dell'HBsAg non superiore al 5%3. Inoltre, la risposta al trattamento spesso non è durevole. La vaccinazione profilattica con HBs Ag ricombinante è altamente efficace nella prevenzione dell'infezione, ma la vaccinazione terapeutica hBs Ag non è efficace. Chiaramente, le risposte immunitarie mediate dalle cellule T svolgono un ruolo fondamentale nel controllo dell'infezione da HBV e della compromissione del fegato; tuttavia, nei pazienti cronici con epatite, le cellule T reattive HBV sono spesso eliminate, disfunzionali o convertite esaurite4,5,6. Di conseguenza, in individui con infezione da HBV persistente, nessun tentativo di ripristinare l'immunità specifica dell'HBV (cioè l'immunità basata sulle cellule T) per mezzo di rimedio anti-virale, citochine immunomodulatori o immunizzazione curativa hanno raggiunto successo.
Il trasferimento di cellule adottive (ACT) di cellule T specifiche DI HBV Ag è un trattamento efficace diretto a sradicare infine i rimanenti epatociti wih HBV7,8. L'ACT dei CL specifici dell'HBV nei topi infetti da HBV ha dimostrato di causare un calo transitorio e lieve e un calo drammatico nelle trascrizioni di acido ribonucleico HBV (RNA) negli epatociti. In questi studi, i CTL non hanno inibito la trascrizione dei geni HBV, ma hanno migliorato la degradazione delle trascrizioni HBV9. Gli HBV specifici sono importanti per prevenire l'infezione virale e mediare l'autorizzazione dell'HBV10,11. Per i rimedi basati su ACT, l'espansione in vitro di cellule T specifiche HBV con un'elevata reattività per il reinsediamento in vivo è stata suggerita come metodo ideale12,13,14; tuttavia, gli attuali approcci sono limitati per quanto riguarda la loro capacità di generare, separare e far crescere quantità e qualità appropriate di cellule T specifiche dell'HBV dai pazienti per le potenziali terapie.
Anche se gli studi clinici presentano sicurezza, praticabilità e attività terapeutica prospettica di trattamenti basati sulle cellule per mezzo di cellule T ingegnerizzate specifiche per gli epatociti infettati da virus HBV, ci sono preoccupazioni circa gli effetti sfavorevoli che si verificano da risposte autoimmuni a causa della reattività incrociata da recettori cellulari T (TCR)15,16, riconoscimento Ag off-target da non specifico TCR17 e on-target off-toxicity da un recettore Ag chierico (CAR) 18 mi lato , 19 con tessuti sani. Attualmente, le cellule T geneticamente modificate, che hanno solo persistenza a breve termine in vivo, sono di solito cellule T intermedie o successive. Ad oggi, le cellule staminali pluripotenti (PSC) sono l'unica fonte disponibile per generare un numero elevato di ingenue cellule T singole di tipo G20,21,22,23. I PSC indotti (iPSC) vengono semplicemente convertiti dalle cellule somatiche di un paziente attraverso l'uso della trasduzione genica di diversi fattori di trascrizione. Di conseguenza, gli iPSC hanno caratteristiche simili a quelle delle cellule staminali embrionali (ESC)24. A causa della flessibilità e della possibilità per l'infinita capacità di auto-rinnovarsi, oltre alla sostituzione dei tessuti, i trattamenti basati su iPSC possono essere ampiamente applicati nella medicina rigenerativa. Inoltre, i reggimenti alla base degli iPSC possono migliorare notevolmente le attuali terapie basate sulle cellule.
L'obiettivo generale di questo metodo è quello di generare una grande quantità di CTL specifici HBV da iPSC (cioè iPSC-CTL) per l'immunoterapia basata su ACT. I vantaggi rispetto alle tecniche alternative sono che gli iPSC-CTL specifici dell'HBV hanno un tCR di tipo singolo e un fenotipo ingenuo, che si traduce in più sviluppo di cellule T di memoria dopo l'ACT. È dimostrato che l'ACT degli iPSC-CTL specifici dell'HBV aumenta la migrazione delle cellule cLAmone CD8 - cLAmmi funzionali nel fegato e riduce la replicazione dell'HBV sia nel fegato che nel sangue dei topi somministrati. Questo metodo rivela un potenziale uso di iPSC-CTL virali specifici dell'Ag per l'immunoterapia HBV e può essere adattato per generare altre cellule iPSC-T virali specifiche dell'Ag per l'immunoterapia virale.

<table><tbody><tr><td>Topi HHD</td><td>Institut Pasteur, Parigi, Francia</td><td></td><td>H-2 classe I knockout, topi HLA-A2.1-transgenici (HHD)</td></tr><tr><td>iPS-MEF-Ng-20D-17</td><td>RIKEN Cell Bank</td><td>APS0001</td><td></td></tr><tr><td>SNL76/7</td><td>ATCC</td><td>SCRC-1049</td><td></td></tr><tr><td>OP9</td><td>ATCC</td><td>CRL-2749</td><td></td></tr><tr><td>pAAV/HBV1.2 plasmide</td><td>Dr. Dr. Pei-Jer Chen (National Taiwan University Hospital, Taiwan)</td><td></td><td>Costrutto del DNA dell'HBV</td></tr><tr><td>Geni TCR specifici per HBs183-91(s183) (FLLTRILTI)</td><td>Dr. Adam J Gehring (Toronto General Hospital Research Institute, Toronto, Canada)</td><td></td><td>Geni TCR ibridi umano-murino ristretti A2-specifici per FLLTRILTI (V&alfa; 34 e V&beta; 28)</td></tr><tr><td>OVA257&ndash; 264-specifici Geni TCR</td><td>Dr. Dario A. Vignali (Università di Pittsburgh, PA)</td><td>Geni SIINFEKL-specifici H-2Kb-restricted TCR Anticorpo</td>Anti-CD3 (17A2) Biolegend 100236 Anticorpo Anti-CD44 (IM7) BD Pharmingen 103012 Anticorpo Anti-CD4 (GK1.5) Biolegend 100408 Anticorpo Anti-CD8 (53-6.7) Biolegend <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td>100732</tr><tr><td>Anti-IFN-&gamma; (XMG1.2) anticorpo</td><td>Biolegend</td><td>505810</td><td></td></tr><tr><td>Anti-TNF-a (MP6-XT22) anticorpo</td><td>Biolegend</td><td>506306</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-MEM</td><td>Invitrogen</td><td>A10490-01</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-HBs</td><td>Thermo Fisher</td><td>MA5-13059</td><td></td></tr><tr><td>ACK Tampone di lisi</td><td>Lonza</td><td>10-548E</td><td></td></tr><tr><td>Brefeldin A Sigma</td><td></td><td>B7651</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>ABCD1234</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Hyclone</td><td>SH3007.01</td><td></td></tr><tr><td>FACSAria Selezionatore cellulare di fusione</td><td>BD</td><td>656700</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina</td><td>MilliporeSigma</td><td>G9391</td><td></td></tr><tr><td>GeneJammer</td><td>Agilent</td><td>204130</td><td></td></tr><tr><td>HLA-A201-HBs183-91-PE pentamero</td><td>Proimmune</td><td>F027-4A - 27</td><td></td></tr><tr><td>HRP Anticorpo secondario anti-topo</td><td>Invitrogen</td><td>A27025</td><td></td></tr><tr><td>mFlt-3L</td><td>Peprotech</td><td>250-31L</td><td></td></tr><tr><td>mIL-7</td><td>Peprotech</td><td>217-17</td><td></td></tr><tr><td>Nucleasi S7</td><td>Roche</td><td>10107921001</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>MilliporeSigma</td><td>P6148-500G</td><td>Attenzione: allergenico, cancerogeno, tossico</td></tr><tr><td>Tampone di permeabilizzazione</td><td>Biolegend</td><td>421002</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>MilliporeSigma</td><td>107689</td><td></td></tr><tr><td>ProLong&trade; Mountant antisbiadimento in oro con DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>P36931</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp MinElute Kit di rotazione del virus</td><td>Qiagen</td><td>57704</td><td></td></tr></tbody></table>

le cellule staminali derivate dall'ag virale specifico t linfociti sopprimeno la replica hbv nei topi

Stem Cell-Derived Viral Ag-Specific T Lymphocytes Suppress HBV Replication in Mice

L'infezione da virus dell'epatite B (HBV) è un problema di salute globale. Con oltre 350 milioni di persone colpite in tutto il mondo, l'infezione da HBV rimane la principale causa di cancro al fegato. Si tratta di una delle principali preoccupazioni, soprattutto nei paesi in via di sviluppo. Il fallimento del sistema immunitario per montare una risposta efficace contro l'HBV porta a infezioni croniche. Anche se il vaccino HBV è presente e si stanno creando nuovi farmaci antivirali, l'eradicazione delle cellule del serbatoio del virus rimane un importante argomento sanitario. Qui è descritto un metodo per la generazione di antigene virale (Ag) specifico CD8- linfociti T citotossici (CTL) derivati da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) (cioè iPSC-CTL), che hanno la capacità di sopprimere la replicazione HBV. La replicazione HBV è indotta in modo efficiente nei topi attraverso l'iniezione idrodinamica di un plasmide di espressione HBV, pAAV/HBV1.2, nel fegato. Quindi, i mouse specifici di HBV Ag iPSC-CTL vengono trasferiti adottivamente, il che sopprime notevolmente la replicazione dell'HBV nel fegato e nel sangue e previene l'espressione Di HbV surface Ag negli epatociti. Questo metodo dimostra la replicazione HBV nei topi dopo l'iniezione idrodinamica e che i CTL virali specifici di Ag- delle cellule staminali possono sopprimere la replicaHBV. Questo protocollo fornisce un metodo utile per l'immunoterapia HBV.

Come mostrato qui, HBV virale Ag-specifico iPSC-CD8- le cellule T sono generate da un sistema di coltura in vitro. Dopo l'ACT di questi iPSC-CD8 virali specifici di Ag8- Le cellule T sopprimono sostanzialmente la replica HBV in un modello murino (File supplementare 1). Mouse iPSC sono tradotti con il costrutto retrovirale MIDR codificando un gene ibrido HBV TCR umano-mouse (HBs183-191-specific,s183), quindi gli iPSC trandotti dal gene sono co-coltivati con cellule OP9-DL1...

Presentato qui è un protocollo per l'effettiva soppressione della replicazione del virus dell'epatite B (HBV) nei topi utilizzando il trasferimento di cellule adottive (ACT) di antigeni virali (Ag) specifici di cellule staminali. Questa procedura può essere adattata per una potenziale immunoterapia basata su ACT dell'infezione da HBV.

Le cellule staminali derivate dall'ag virale specifico t linfociti sopprimeno la replica HBV nei topi

Hepatitis B virus (HBV) infection is a global health issue. With over 350 million people affected worldwide, HBV infection remains the leading cause of ...

Questo metodo può aiutare a rispondere alle domande chiave nel trasferimento cellulare adottivo di cellule T specifiche dell'antigene virale derivate da iPSC per una soppressione efficace della replicazione HBV nei topi. Il principale vantaggio di questa tecnica è che le cellule T specifiche dell'antigene virale derivate dall'iPSC hanno un recettore delle cellule T di singolo tipo e un fenotipo ingenuo. Per la differenziazione delle cellule T positive iPSC CD8-positive dell'HBV, le lamiere s183 T receptor gene-transduced iPSCs su un monostrato OP9-DL1/DL4 in mezzo alfa-minimo integrato con siero bovino fetale al 20% e ligando murino Flt3 per la loro cocoltura in un incubatore di coltura cellulare.Monitorare regolarmente la co-coltura per valutare la morfologia cellulare. Il giorno 28, rimuovere le celle supernatanti e galleggianti e scollegare le cellule aderenti con lo 0,25% di tripside. Quando le cellule si sono alzate dal fondo del contenitore di coltura, interrompere la reazione enzimatica con otto millilitri di mezzo iPSC e raccogliere le cellule per centrifugazione.Resuspend il pellet in 10 millilitri di mezzo fresco. Diluire le cellule in una cellula T CD8-positiva derivata da iPSC a quattro splenociti pulsati da peptidi s183 per un'incubazione di 40 ore nell'incubatore di coltura cellulare. Nelle ultime sette ore, aggiungere quattro microlitri di brefeldina A diluita alla coltura, per bloccare i processi di trasporto durante l'attivazione cellulare.Macchiare le cellule per l'analisi citometrica del flusso delle citochine intracellulari di interesse secondo protocolli standard. Per l'erogazione idrodinamica del plasmide HBV attraverso la vena della coda, diluire 10 microgrammi di plasmide HBV in un equivalente dell'8% della massa corporea di PBS. Caricare il plasmide in una siringa da tre millilitri dotata di un ago da 26 e 1/2 pollice per topo.Riscaldare i topi HHD sotto una lampada termica per cinque minuti per dilatare le vene della coda e tirare con cura un topo in un limitatore di plastica. Individuare una vena laterale dilatata della coda nel terzo centrale della coda e inserire l'ago parallelo alla vena per fornire l'intero volume di plasmide attraverso la vena della coda per un periodo da tre a cinque secondi. Per il trasferimento cellulare adottivo della cellula T CD8-positive derivato da iPSC, derivato dall'antigene virale, raccogliere le cellule T cd8-positive iPSC il giorno 22 della coltura come dimostrato e seminare le cellule su un nuovo piatto di coltura cellulare di 10 centimetri.Dopo 30 minuti nell'incubatore di coltura cellulare, filtrare le cellule galleggianti attraverso un colino di nylon da 70 micrometri e contare le cellule vitali. Diluire le cellule a un 1,5 per 10 alle sette cellule per millilitro di concentrazione di PBS. Iniettare 200 microlitri di cellule in singoli topi HHD di quattro o sei settimane, nella vena della coda come appena dimostrato.Il giorno 14 dopo il trasferimento cellulare, eseguire un'erogazione idrodinamica di plasmide HBV come dimostrato. Agli endpoint sperimentali appropriati dopo l'infezione, raccogliere il fegato da ogni animale infetto e tagliare i fegati in campioni di tessuto da 0,5 per 0,5 per 0,3 centimetri. Mettere i campioni in formalina tampone neutra al 10% per quattro-24 ore, seguita da decalcificazione in acido formico 2,5 molare per sei-24 ore.Successivamente, sciacquare i campioni in xilene per tre minuti, seguiti da due risciacqui di due minuti in etanolo al 100%, 95% di etanolo e acqua deionizzata. Dopo l'ultimo lavaggio dell'acqua, decalcificare i tessuti in EDTA millimolare a 90 gradi Celsius, seguito da un'incubazione di 30 minuti a temperatura ambiente. Quando il tessuto si è raffreddato, sciacquare i campioni in PBS per quattro minuti e utilizzare xilene ed etanolo per deparaffinizzare e reidratare i campioni.Per l'etichettatura immunofluorescente, macchiare le sezioni con 200 microlitri di anticorpi specifici dell'antigene superficiale HBV per due ore a temperatura ambiente in una camera umidificata dal 75 al 100%. Al termine dell'incubazione, lavare i campioni con cinque lavaggi di cinque minuti in PBS fresco per ogni lavaggio. Etichettare le celle con DAPI secondo protocolli standard prima di montare le diapositive con coverlips per l'imaging mediante microscopia a fluorescenza.Per l'analisi immunoistochimica, macchiare le sezioni con ematossilina ed eosina secondo protocolli standard e valutare l'infiltrazione di cellule infiammatorie nel fegato mediante microscopia ottica. L'analisi citometrica del flusso della popolazione CD8-positiva CD3-positiva derivata da iPSC rivela che la trasduzione del recettore cellulare HBV T aumenta drasticamente la generazione di cellule T cd8 positive virali specifiche di s183. Dopo la stimolazione con splenociti impoveriti a T pulsati con peptide s183, le cellule T mono-positive CD4-negative CD8 derivate da iPSC producono grandi quantità di gamma di interferone, come rilevato dall'analisi citometrica del flusso intracellulare e dall'ELISA.Dopo l'infezione da HBV per iniezione idrodinamica, la replicazione del DNA raggiunge il sesto giorno e si riduce gradualmente, come osservato dall'analisi PCR in tempo reale. Inoltre, la replicazione virale è significativamente ridotta in tutti i punti di tempo nei topi che ricevono cellule T antigeniche virali HBV rispetto ai topi che ricevono cellule di controllo. La proteina superficiale HBV è anche notevolmente diminuita nei topi che ricevono linfociti citotossici pre-iPSC specifici dell'antigene virale HBV rispetto ai topi trattati con cellule di controllo, dimostrando chiaramente che le cellule T cd8 positive iPSC specifiche dell'antigene virale hanno la capacità di ridurre la replicazione dell'HBV in un modello murino.Ora dovresti avere una buona comprensione di come generare cellule T specifiche dell'antigene virale da iPSC per l'immunoterapia adottiva.

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Immunologia e Infezioni

Un rapido, protocollo semplice e conveniente per la generazione di donatore-derivati ​​multivirus specifici CTL (RCtl) per infusione a trapianto allogenico di cellule staminali emopoietiche (HSCT) a rischio di sviluppare infezioni da CMV, EBV o Adv. Questo processo di fabbricazione è GMP e deve assicurare l'applicazione più ampia di cellule T immunoterapia al di là di centri specializzati.

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Qui si descrive la prima pratica di fabbricazione (GMP) conforme metodo per produrre virus-specifici linfociti T citotossici (CTL) da sangue del cordone ombelicale, fonte di cellule T prevalentemente ingenuo.

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Sviluppo di un virus System Reporter dell&#39;epatite B per monitorare la fasi iniziali del ciclo di replicazione

Questo protocollo descrive l'uso di singola catena MHC di classe I complessi di indagare interazioni molecolari nell'attivazione di cellule T CD8 + umano: generazione di cellule che esprimono la catena singola presentanti l'antigene ingegnerizzato costruisce, cultura del clone di cellule T CD8 + umano ed esperimenti di attivazione delle cellule T.

Uso della tecnologia di MHC di singola catena di indagare Co-agonismo in umano CD8 + attivazione delle cellule T

Questo manoscritto descrive un protocollo dettagliato per l'infezione da virus dell'epatite B (HBV) in nuove cellule 293T ingegnerizzate (293T-NE-3NRs, che esprime NTCP umana, HNF4, RXR e PPAR) e cellule epatiche tradizionali (HepG2-NE, che esprimono NTCP umani).

Modellazione dell'infezione da virus dell'epatite B nelle cellule non epatiche 293T-NE-3NRs

Sulla base di una matrice peptidica derivata dal virus dell'epatite B (HBV), le risposte delle cellule T CD4 specifiche dell'HBV potrebbero essere valutate in parallelo con l'identificazione di epitopi di cellule T CD4 specifiche per HBV.

Analisi delle risposte delle cellule T CD4 specifiche dell'HBV e identificazione degli epitopi delle cellule T CD4 con restrizioni HLA-DR basati su una matrice peptidica

Presentiamo un protocollo per lo screening dei composti del virus anti-epatite B (HBV) mirati alle fasi del ciclo di vita di ingresso pre e post-virale, utilizzando la calorimetria isotermica di titolazione per misurare l'affinità di legame (KD) con il polipeptide cotrasportante del taurocolato di sodio ospite. L'efficacia antivirale è stata determinata attraverso la soppressione dei marcatori del ciclo di vita virale (formazione del cccDNA, trascrizione e assemblaggio virale).

Un modello di epatociti competente che esamina l'ingresso del virus dell'epatite B attraverso il taurococolato di sodio che trasporta il polipeptide come bersaglio terapeutico

L'attuale studio mostra protocolli per valutare l'impegno precoce del destino delle cellule TFH specifiche del virus e manipolare l'espressione genica in queste cellule.

Accesso alla differenziazione precoce della cellula T CD4+ helper follicolare virus-specifica nei topi acuti con infezione da LCMV

Scopri il trasferimento cellulare adottivo di linfociti T specifici per antigeni virali derivati da iPSC per sopprimere la replicazione dell'HBV nei topi. Questo metodo offre una terapia immunologica mirata contro l'epatite B.

Le cellule staminali derivate dall'ag virale specifico t linfociti sopprimeno la replica HBV nei topi

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