Name: Indurre Meningococcal Meningitis Serogroup C in Topi tramite consegna intracisternale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 3 s
Description: Scopri come indurre la meningite meningococcica di sierogruppo C in topi tramite inoculazione intracisternale di Neisseria meningitidis. Questo modello murino riproduce gli eventi patologici della malattia umana per studiare le interazioni ospite-patogeno.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Gli studi sono stati sostenuti in parte da PRIN 2012 [grant number 2012WJSX8K]: "Modelli di interazione host-microbe nelle infezioni mucosali: sviluppo di nuove strategie terapeutiche" e da PRIN 2017 [2017SFBFER]: "Un approccio integrato per affrontare l'interazione tra adattamento, condizioni stressanti e resistenza antimicrobica di agenti patogeni impegnativi".

Questo protocollo è stato condotto per ridurre al minimo la sofferenza degli animali e il numero di topi in conformità con la direttiva del Consiglio delle Comunità europee del 24 novembre 1986 (86/609/CEE). Gli esperimenti in vivo riportati in questo studio sono stati approvati dall'Ethical Animal Care and Use Committee (Prot. numero 2, 14 dicembre 2012) e dal Ministero della Salute italiano (Prot. numero 0000094-A-03/01/2013). Tutte le procedure devono essere eseguite all'interno del Gabinetto per la biosicurezza 2 (BSC2) in una stanza BSL2 e i potenziali rifiuti infetti devono essere smaltiti in contenitori dedicati.
1. Infezione dei topi con N. meningitidis Serogroup C Strain
AVVISO: N. meningitidis è potenzialmente un agente patogeno dannoso e tutte le precauzioni necessarie devono essere prese quando si maneggia questo microrganismo. L'intera sperimentazione richiede il contenimento del livello di biosicurezza 2 (BSL2). Il ricercatore coinvolto negli studi sugli animali deve indossare dispositivi di protezione personale usa e getta (PPE) per tutta la durata dell'esperimento.
<ol><li>Preparazione di batteri per studi di infezione in vivo
	<ol>
<li>Scegli una singola colonia da una nuova cultura Meningitidis Neisseria su piastra di agar GC (Gonococcal) integrata con supplemento Polyvitox dell'1% (vol/vol) e inoculato in 10 mL di brodo GC.</li>
		<li>Far crescere i batteri a 37 gradi centigradi in un incubatore di shaker orbitale con una velocità di 220 giri/min. Continua a controllare l'O.D. della cultura con uno spettrometro. Far crescere la coltura fino alla fase esponenziale iniziale a una densità ottica OD600nm di 0,7, corrispondente a 7 x 108 CFU/mL.</li>
		<li>Una volta ottenuta la causa del sistema operativo richiesto, effettuare le scorte congelate aggiungendo il 10% di glicerolo. Distribuisci 1 mL della cultura nei crioviali. Conservare le fiale a -80 gradi centigradi fino all'uso. NOT:</</c5> Anche se è meglio usare la coltura batterica fresca, gli stock surgelati sono stati utilizzati per semplificare e standardizzare l'esperimento in vivo. Di solito le scorte congelate sono state impiegate entro circa 6 mesi dalla preparazione.</li>
		<li>Prima dell'infezione, scongelare i batteri congelati a temperatura ambiente.</li>
		<li>Raccogliere le cellule batteriche per centrifugazione per 15 min a 1.500 x g e rimovicare in 1 mL di brodo fresco GC contenente dextran di ferro (5 mg/kg). NOT:</</c7> Il brodo GC viene preparato con l'aggiunta di dextran di ferro (5 mg/kg) al fine di favorire la replicazione delle meningocci nel tessuto ospite14,18,27.</li>
		<li>Prima dell'uso, eseguire conteggi vitali di batteri per determinare il numero esatto di CFU per l'infezione. Per farlo, raccogliere 10 oL di sospensione batterica e procedere con diluizioni seriali e stendere ogni diluizione sulle piastre di agar GC e incubare a 37 gradi centigradi con 5% di CO2, per 18-24 h.</li>
	</ol></li>
	<li>Iniezione intra-cisternale di topi nota:L'intera procedura viene eseguita nell'armadio del flusso laminare per mantenere le condizioni asettiche.<ol><li>Topi da laboratorio di casa (8 settimane, balb/c femminili) in condizioni specifiche prive di agenti patogeni. Fornire pellet alimentari e acqua al libitum.</li>
		<li>Sistemare gli animali nel nuovo ambiente per 1 settimana prima di iniziare l'esperimento.</li>
		<li>Prima di iniziare l'esperimento, pesare e valutare la loro temperatura corporea. NOT:</</c0> I topi femmina di Balb/c inbred di otto settimane pesano in media circa 19 g. La temperatura media dei topi di laboratorio è fisiologicamente variabile dai 36-38 gradicentigradi.</li>
		<li>Scruff l'animale dal collo, pulire l'area dell'addome con il 70% di etanolo e iniettare i.p. dextran di ferro (sciolto in 1 % fosfato tampone salina, 250 mg/kg) nel quadrante inferiore destro dell'addome murino utilizzando un ago da 25 G 0,5 mm x 16 mm circa 2-3 h prima dell'infezione. NOT:</</c0> L'iniezione intraperitoneale è stata eseguita nel quadrante inferiore destro dell'addome murino per evitare di danneggiare gli organi addominali come vescica urinaria, cecum, ecc. La somministrazione di sorgente di ferro esogena, sotto forma di dextran di ferro, agli animali prima dell'infezione favorisce la moltiplicazione batterica nell'ospite14,18,27.</li>
		<li>Dopo 2-3 h, eseguire l'anestesia animale con chetamina (50 mg/kg) e xilizina (3 mg/kg) e lubrificante oftalmico.</li>
		<li>Controllare la profondità dell'anestesia assicurando l'assenza di risposta al dolore dopo aver pizzicando il dito del dito del dito del tutto.</li>
		<li>Posizionare il mouse in decubito sternale e allungare con attenzione gli arti e la colonna vertebrale cervicale per mantenere la colonna vertebrale in posizione dritta.</li>
		<li>Mescolare delicatamente le sospensioni batteriche per mantenere una sospensione costante prima di caricare una siringa di 30 G ago x 8 mm. NOT:</</c0> Preparare la sospensione batterica il più vicino possibile al tempo di iniezione; nel frattempo, conservarlo a temperatura ambiente.</li>
		<li>Sulla base del titro batterico post scongelamento (CFU/mL), procedere con il calcolo della CFU totale da utilizzare, rispetto al numero totale di animali da infettare (dose batterica CFU per numero di animali). Procedere con il calcolo del volume esatto da prelevato dalla fiala per ottenere la CFU totale applicando una proporzione tra il titro batterico post scongelato (CFU/mL) e la CFU totale utile per l'infezione di n topi (CFU titro batterico post scongelato : ml : CFU totale : x). Stabilire il volume finale rispetto al numero totale di animali da infettare. NOT:</</c0> In questi esperimenti, è stata utilizzata una vasta gamma di titro da 104 a 109 per animale.</li>
		<li>Pulire l'area chirurgica con il 70% di etanolo.</li>
		<li>Identificare il punto di iniezione con l'aiuto di un ago e iniettare la CFU stabilita di meningococci (ceppo di tipo selvaggio e ceppo mutante isogenico), o brodo GC integrato con dextran di ferro (5 mg/kg) come controllo, in un volume totale di 10 l nella cisterna magna dei topi attraverso un foro di bava occipitale utilizzando un ago 30 G x 8 mm.<ol>
<li>Eseguire l'inoculo cisternale posizionando l'ago alla giunzione craniocervica, in particolare nello spazio subaracnoideo dorsale. Ventroflex la testa per rendere questo spazio accessibile28.</li>
			<li>In breve, mettere l'animale in recumbency laterale, tenere le orecchie fuori strada e flettere il collo moderatamente (da 90 a 100 gradi). Assicurarsi che la linea mediana del collo e della testa (dal naso all'occipite) siano perfettamente in posizione parallela rispetto al tavolo.</li>
			<li>Toccare le ali dell'atlante e assicurarsi che si sovrappongano, eliminando la rotazione assiale. Un'indentazione naturale di solito può essere toccata sulla linea mediana dove l'ago è più probabile che entri nel foro occipitale.</li>
			<li>Scartare la siringa e l'ago in modo sicuro dopo l'iniezione di topi con Neisseria.</li>
		</ol></li>
		<li>Mettere l'animale nella gabbia e attendere il risveglio e il pieno recupero del movimento.</li>
		<li>Tenere le gabbie con topi infetti sotto un armadio a flusso laminare.</li>
		<li>Monitorare i topi, 24 h dopo l'infezione, per i segni clinici di coma secondo la scala del coma29. Scala del coma: 1 coma, 2 - non sta in piedi dopo essere stato acceso sul retro, 3 - si erge entro 30 s, 4 - si erge entro 5 s, attività ambulatoriali minime, 5 - normale. 
		  NOT:</</c1> Quando negli animali è stato registrato dolore, è stata somministrata analgesia con melossicam (5 mg/kg i.p. per la durata dello studio).</li>
		<li>Procedere per la sopravvivenza degli animali o la CFU conta il saggio sugli animali infetti come descritto al punto 2.</li>
		<li>Eseguire l'eutanasia dei topi con un punteggio di 2 dalla lussazione cervicale e registrare come morto per l'analisi statistica.</li>
	</ol></li>
</ol>2. La sopravvivenza animale e i conteggi della CFU
<ol><li>
Sopravvivenza animale
	<ol>
<li>Preparare l'inocula batterica a diverse dosi (che vanno da 104 a 109 CFU per topo) per infettare gli animali dall'i.cist. percorso (vedere il punto 1.2).</li>
		<li>Topi da controllo inoculare con brodo GC, integrati con dextran di ferro (5 mg/kg), nello stesso modo.</li>
		<li>Monitorare gli animali per i sintomi clinici: pelliccia arruffata, aspetto curvo, ipotermia, perdita di peso, letargia, omoribondo 24,25,26,30, ogni giorno per tutto l'esperimento per 168 h (7 giorni) almeno due volte al giorno per tutta la durata dell'esperimento.</li>
		<li>Misurare il peso corporeo e la temperatura utilizzando un equilibrio digitale e un termometro rettale, rispettivamente ogni giorno.</li>
		<li>Registrare la sopravvivenza dei topi per una settimana. NOT:</</c11> Registrare la morte naturale dell'infezione post animale, mentre gli animali che raggiungono un valore di coma di 2 o che sopravvivono oltre 168 h di osservazione saranno eutanasia.</li>
		<li>Anestesizza i topi con un valore coma di 2 o che sopravvivono nel corso del tempo di osservazione con ketamina (50 mg/kg) e xilazina (3 mg/kg) e applica unguento oftalmico.</li>
		<li>Controllare che la risposta al dolore sia assente dal pizzico del dito del dito del dito.</li>
		<li>Eseguire l'eutanasia dei topi per lussazione cervicale e registrare come morto per l'analisi statistica.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Valutazione dei conteggi delle unità formanti di colonia (CFU) negli organi periferici
	<ol>
<li>Utilizzare una dose batterica subletale (5 x 105CFU/topi) sulla base dei risultati di sopravvivenza degli animali per inoculare gli animali da parte dell'i.cist. percorso (cfr. sottosezione 1.2).</li>
		<li>Monitorare la temperatura rettale ogni giorno durante l'infezione ed eseguire l'anestesia degli animali a 48 h post infezione, come indicato nel passaggio 2.</li>
		<li>Procedere con la disinfezione del 70% di etanolo del torace e prelevare 600-700 - l'l di sangue per foratura cardiaca della cavità toracica utilizzando un ago da 25 G 0,5 mm x 16 mm.</li>
		<li>Raccogliere il sangue in un tubo contenente il 3,8% di citrato di sodio e conservarlo a -80 gradi centigradi per i successivi conteggi di cellule batteriche vitali.</li>
		<li>Eseguire lussazione cervicale per sacrificare gli animali. Confermare la morte registrando l'assenza di battito cardiaco, dopo aver sacrificato il mouse secondo tutte le linee guida istituzionali ed etiche pertinenti.</li>
		<li>Posare il topo in posizione supina e utilizzare forbici e pinze per procedere con il taglio della pelliccia lungo il piano sagittale del corpo. Fissare la pelle con la pelliccia sui lati del corpo con spilli.</li>
		<li>Tagliare la membrana peritoneale con forbici affilate. Utilizzare forbici e pinze monouso per accise gli organi (ad esempio, milza e fegato) e mettere ciascuno in parabola Petri sterile con 1 mL di brodo GC integrato con 10% (vol/vol) glicerolo.</li>
		<li>Smaltire in modo sicuro il corpo del topo in base alle linee guida IACUC.</li>
		<li>Omogeneizzare gli organi meccanicamente a temperatura ambiente con lo stantuffo di una siringa 5 mL per circa 2-3 min fino a quando non si forma una sospensione a cella singola e trasferirlo in un tubo.</li>
		<li>Mettere immediatamente il tubo con il campione di tessuto omogeneizzato sul ghiaccio secco. NOT:</</c15> I campioni possono essere conservati a -80 gradi centigradi in un tubo sterile da 2 mL per eseguire la valutazione del numero di cellule batteriche vitali nei punti successivi.</li>
		<li>Fare piatti di agar GC con antibiotici quando necessario. Asciugare le piastre prima dell'uso pre-incubazione a 37 gradi centigradi per 2-3 h.</li>
		<li>Preparare diluizioni seriali di 10 volte dei campioni in brodo GC da ogni tessuto omogeneizzato e piastra su piastre di agar GC. Incubare pernottamento a 37 gradi centigradi con il 5% di CO2.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Preparazione dei tessuti cerebrali per il conteggio CFU
<ol><li>Utilizzare una dose batterica subletale (5 x 105 CFU/topi) sulla base dei risultati di sopravvivenza degli animali per inoculare gli animali da parte dell'i.cist. percorso (cfr. sottosezione 1.2).</li>
	<li>Eseguire l'anestesia degli animali al momento dell'infezione stabilito, come indicato nel passaggio 2.</li>
	<li>Eseguire l'eutanasia degli animali con lussazione cervicale.</li>
	<li>Pulire l'area chirurgica con il 70% di etanolo.</li>
	<li>Tagliare la testa del mouse con una grande forbice.</li>
	<li>Resect la pelliccia e la pelle con l'aiuto di piccole forbici chirurgiche e una sottile punta pinza d'acciaio, procedendo verso la parte superiore del cranio per essere in grado di vedere chiaramente le suture e di guidare l'apertura del cranio.</li>
	<li>Inserire la punta di una piccola forbice attraverso il forame magnum per aprire il cranio.</li>
	<li>Tagliare verso il centro del cranio e attraverso la linea mediana dell'osso parietale sul lato opposto del cranio. Tagliare delicatamente lungo il bordo laterale della sutura lambdoid.</li>
	<li>Sollevare il cranio partendo dall'angolo parietale posteriore e tirarlo in diagonale verso l'alto per scoprire il cervello, utilizzando pinze sottili ribaltate.</li>
	<li>Assicurati che il tessuto cerebrale non sia attaccato ad alcun osso della testa, quando il cranio viene sollevato.</li>
	<li>Utilizzare pinze usa e getta per rimuovere qualsiasi tessuto connettivo tra il cranio e il cervello, per garantire che il tessuto cerebrale venga rimosso insieme al cranio.</li>
	<li>Non permettere che il tessuto cerebrale si asciughi troppo. Posizionare il cervello, usando pinze usa e getta, in un piatto Petri con 1 mL di brodo GC integrato con 10% (vol/vol) glicerolo.</li>
	<li>Omogeneizzare il cervello meccanicamente con lo stantuffo di una siringa da 5 mL (vedi passo 2.2.9). Trasferire i campioni in un tubo sterile da 2 mL e conservarli a -80 gradi centigradi per la successiva valutazione dei conteggi delle cellule batteriche vitali, come discusso al punto 2.2.</li>
</ol>

<ol><li>van Deuren, M., Brandtzaeg, P., van der Meer, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+on+meningococcal+disease+with+emphasis+on+pathogenesis+and+clinical+management%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Update on meningococcal disease with emphasis on pathogenesis and clinical management.</a> Clinical Microbiology Reviews. 13, 144-166 (2000).</li>
<li>Colicchio, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fitness+Cost+of+Rifampin+Resistance+in+Neisseria+meningitidis%3A+In+vitro+Study+of+Mechanisms+Associated+with+rpoB+H553Y+Mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Fitness Cost of Rifampin Resistance in Neisseria meningitidis: In vitro Study of Mechanisms Associated with rpoB H553Y Mutation.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (12), 7637-7649 (2015).</li>
<li>Talà, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serogroup-specific+interaction+of+Neisseria+meningitidis+capsular+polysaccharide+with+host+cell+microtubules+and+effects+on+tubulin+polymerization%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Serogroup-specific interaction of Neisseria meningitidis capsular polysaccharide with host cell microtubules and effects on tubulin polymerization.</a> Infection and Immunity. 82, 265-274 (2014).</li>
<li>Pagliarulo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+and+differential+expression+of+gdhA+encoding+NADP-specific+glutamate+dehydrogenase+in+Neisseria+meningitidis+clinical+isolates%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Regulation and differential expression of gdhA encoding NADP-specific glutamate dehydrogenase in Neisseria meningitidis clinical isolates.</a> Molecular Microbiology. 51, 1757-1772 (2004).</li>
<li>Plant, L., Jonsson, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contacting+the+host%3A+insights+and+implications+of+pathogenic+Neisseria+cell+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Scandinavian+Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Contacting the host: insights and implications of pathogenic Neisseria cell interactions.</a> Scandinavian Journal of Infectious Diseases. 35, 608-613 (2003).</li>
<li>Schryvers, A. B., Stojiljkovic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+acquisition+systems+in+the+pathogenic+Neisseria%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Iron acquisition systems in the pathogenic Neisseria.</a> Molecular Microbiology. 32, 1117-1123 (1999).</li>
<li>Virji, M., Makepeace, K., Ferguson, D. J., Watt, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carcinoembryonic+antigens+%28CD66%29+on+epithelial+cells+and+neutrophils+are+receptors+for+Opa+proteins+of+pathogenic+neisseriae%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Carcinoembryonic antigens (CD66) on epithelial cells and neutrophils are receptors for Opa proteins of pathogenic neisseriae.</a> Molecular Microbiology. 22, 941-950 (1996).</li>
<li>de Vries, F. P., van Der Ende, A., van Putten, J. P., Dankert, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invasion+of+primary+nasopharyngeal+epithelial+cells+by+Neisseria+meningitidis+is+controlled+by+phase+variation+of+multiple+surface+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Invasion of primary nasopharyngeal epithelial cells by Neisseria meningitidis is controlled by phase variation of multiple surface antigens.</a> Infection and Immunity. 64, 2998-3006 (1996).</li>
<li>Tinsley, C. R., Heckels, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variation+in+the+expression+of+pili+and+outer+membrane+protein+by+Neisseria+meningitidis+during+the+course+of+the+meningococcal+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Variation in the expression of pili and outer membrane protein by Neisseria meningitidis during the course of the meningococcal infection.</a> Journal of General Microbiology. 132, 2483-2490 (1986).</li>
<li>Gorringe, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+disease+models+for+the+assessment+of+meningococcal+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Experimental disease models for the assessment of meningococcal vaccines.</a> Vaccine. 23, 2214-2217 (2005).</li>
<li>Newcombe, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infection+with+an+avirulent+phoP+mutant+of+Neisseria+meningitidis+confers+broad+cross-reactive+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Infection with an avirulent phoP mutant of Neisseria meningitidis confers broad cross-reactive immunity.</a> Infection and Immunity. 72, 338-344 (2004).</li>
<li>Oftung, F., Lovik, M., Andersen, S. R., Froholm, L. O., Bjune, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+model+utilising+human+transferrin+to+study+protection+against+Neisseria+meningitidis+serogroup+B+induced+by+outer+membrane+vesicle+vaccination%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Immunology+and+Medical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A mouse model utilising human transferrin to study protection against Neisseria meningitidis serogroup B induced by outer membrane vesicle vaccination.</a> FEMS Immunology and Medical Microbiology. 26, 75-82 (1999).</li>
<li>Salit, I. E., Tomalty, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+meningococcal+infection+in+neonatal+mice%3A+differences+in+virulence+between+strains+isolated+from+human+cases+and+carriers%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Experimental meningococcal infection in neonatal mice: differences in virulence between strains isolated from human cases and carriers.</a> Canadian Journal of Microbiology. 30, 1042-1045 (1984).</li>
<li>Salit, I. E., Tomalty, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+neonatal+mouse+model+of+meningococcal+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Investigative+Medicine%22%5BJournal%5D)">A neonatal mouse model of meningococcal disease.</a> Clinical and Investigative Medicine. 9, 119-123 (1986).</li>
<li>Mackinnon, F. G., Gorringe, A. R., Funnell, S. G., Robinson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intranasal+infection+of+infant+mice+with+Neisseria+meningitidis%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Pathogenesis%22%5BJournal%5D)">Intranasal infection of infant mice with Neisseria meningitidis.</a> Microbial Pathogenesis. 12, 415-420 (1992).</li>
<li>Mackinnon, F. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Demonstration+of+lipooligosaccharide+immunotype+and+cap-+sule+as+virulence+factors+for+Neisseria+meningitidis+using+an+infant+mouse+intranasal+infection+model%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Pathogenesis%22%5BJournal%5D)">Demonstration of lipooligosaccharide immunotype and cap- sule as virulence factors for Neisseria meningitidis using an infant mouse intranasal infection model.</a> Microbial Pathogenesis. 15, 359-366 (1993).</li>
<li>Yi, K., Stephens, D. S., Stojiljkovic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+evaluation+of+an+improved+mouse+model+of+meningococcal+colonization%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Development and evaluation of an improved mouse model of meningococcal colonization.</a> Infection and Immunity. 71 (4), 1849-1855 (2003).</li>
<li>Holbein, B. E., Jericho, K. W. F., Likes, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neisseria+meningitidis+infection+in+mice%3A+influence+of+iron%2C+variations+in+virulence+among+strains%2C+and+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Neisseria meningitidis infection in mice: influence of iron, variations in virulence among strains, and pathology.</a> Infection and Immunity. 24, 545-551 (1979).</li>
<li>Saukkonen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+meningococcal+meningitis+in+the+infant+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Pathogenesis%22%5BJournal%5D)">Experimental meningococcal meningitis in the infant rat.</a> Microbial Pathogenesis. 4, 203-211 (1988).</li>
<li>Johansson, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD46+in+meningococcal+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">CD46 in meningococcal disease.</a> Science. 301, 373-375 (2003).</li>
<li>Zarantonelli, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+mice+expressing+human+transferrin+as+a+model+for+meningococcal+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Transgenic mice expressing human transferrin as a model for meningococcal infection.</a> Infection and Immunity. 75, 5609-5614 (2007).</li>
<li>Join-Lambert, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meningococcal+interaction+to+microvasculature+triggers+the+tissular+lesions+of+purpura+fulminans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Infection+Disease%22%5BJournal%5D)">Meningococcal interaction to microvasculature triggers the tissular lesions of purpura fulminans.</a> Journal of Infection Disease. 208, 1590-1597 (2013).</li>
<li>Melican, K., Michea Veloso, P., Martin, T., Bruneval, P., Duménil, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesion+of+Neisseria+meningitidis+to+dermal+vessels+leads+to+local+vascular+damage+and+purpura+in+a+humanized+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogen%22%5BJournal%5D)">Adhesion of Neisseria meningitidis to dermal vessels leads to local vascular damage and purpura in a humanized mouse model.</a> PLoS Pathogen. 9, 1003139(2013).</li>
<li>Colicchio, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+meningococcal+ABC-Type+L-glutamate+transporter+GltT+is+necessary+for+the+development+of+experimental+meningitis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">The meningococcal ABC-Type L-glutamate transporter GltT is necessary for the development of experimental meningitis in mice.</a> Infection and Immunity. 77, 3578-3587 (2009).</li>
<li>Colicchio, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virulence+traits+of+serogroup+C+meningococcus+and+isogenic+cssA+mutant%2C+defective+in+surface-exposed+sialic+acid%2C+in+a+murine+model+of+meningitis%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Virulence traits of serogroup C meningococcus and isogenic cssA mutant, defective in surface-exposed sialic acid, in a murine model of meningitis.</a> Infection and Immunity. , 00688-00718 (2019).</li>
<li>Ricci, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+matrix+metalloproteinases+attenuates+brain+damage+in+experimental+meningococcal+meningitis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Inhibition of matrix metalloproteinases attenuates brain damage in experimental meningococcal meningitis.</a> BMC Infectious Diseases. 14, 726(2014).</li>
<li>Schryvers, A. B., Gonzalez, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+abilities+of+different+protein+sources+of+iron+to+enhance+Neisseria+meningitidis+infection+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Comparison of the abilities of different protein sources of iron to enhance Neisseria meningitidis infection in mice.</a> Infection and Immunity. 57, 2425-2429 (1989).</li>
<li>Beverly, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+105+-+Cerebrospinal+Fluid+Sampling+Small+Animal%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chapter 105 - Cerebrospinal Fluid Sampling Small Animal.</a> Critical Care Medicine. , 448-452 (2009).</li>
<li>Liechti, F. D., Grandgirard, D., Leppert, D., Leib, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+metalloproteinase+inhibition+lowers+mortality+and+brain+injury+in+experimental+pneumococcal+meningitis%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Matrix metalloproteinase inhibition lowers mortality and brain injury in experimental pneumococcal meningitis.</a> Infection and Immunity. 82, 1710-1718 (2014).</li>
<li>Pagliuca, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+Approach+for+Evaluation+of+Bacteroides+fragilis+Protective+Role+against+Bartonella+henselae+Liver+Damage+in+Immunocompromised+Murine+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Novel Approach for Evaluation of Bacteroides fragilis Protective Role against Bartonella henselae Liver Damage in Immunocompromised Murine Model.</a> Frontiers in Microbiology. 7, 1750(2016).</li>
<li>Trampuz, A., Steinhuber, A., Wittwer, M., Leib, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+diagnosis+of+experimental+meningitis+by+bacterial+heat+production+in+cerebrospi-+nal+fluid%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Rapid diagnosis of experimental meningitis by bacterial heat production in cerebrospi- nal fluid.</a> BMC Infectious Diseases. 7, 116(2007).</li>
<li>Tuomanen, E. I., Saukkonen, K., Sande, S., Cioffe, C., Wright, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduction+of+inflammation%2C+tissue+damage%2C+and+mortality+in+bacterial+meningitis+in+rabbits+treated+with+monoclonal+antibodies+against+adhesion-promoting+receptors+of+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Reduction of inflammation, tissue damage, and mortality in bacterial meningitis in rabbits treated with monoclonal antibodies against adhesion-promoting receptors of leukocytes.</a> Journal of Experimental Medicine. 170, 959-969 (1989).</li>
<li>Goldschneider, I., Gotschlich, E. C., Artenstein, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+immunity+to+the+meningococcus.+I.+The+role+of+humoral+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Human immunity to the meningococcus. I. The role of humoral antibodies.</a> Journal of Experimental Medicine. 129, 1307-1326 (1969).</li>
<li>Goldschneider, I., Gotschlich, E. C., Artenstein, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+immunity+to+the+meningococcus.+II.+Development+of+natural+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Human immunity to the meningococcus. II. Development of natural immunity.</a> Journal of Experimental Medicine. 129, 1327-1348 (1969).</li>
<li>World Health Organization. Laboratory methods for the diagnosis of meningitis caused by Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae, and Haemophilus influenzae: WHO manual, 2nd Edition. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22World+Health+Organization%22">World Health Organization</a>. , Geneva: WHO. (2011).</li>
<li>Chiavolini, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+inducing+experimental+pneumococcal+meningitis+in+outbred+mice%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiolology%22%5BJournal%5D)">Method for inducing experimental pneumococcal meningitis in outbred mice.</a> BMC Microbiolology. 4, 36(2004).</li>
<li>Zhang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracranial+Subarachnoidal+Route+of+Infection+for+Investigating+Roles+of+Streptococcus+suis+Biofilms+in+Meningitis+in+a+Mouse+Infection+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Intracranial Subarachnoidal Route of Infection for Investigating Roles of Streptococcus suis Biofilms in Meningitis in a Mouse Infection Model.</a> Journal of Visualized Experiments. (1), e137(2018).</li>
<li>Pagliuca, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+of+Bacteroides+fragilis+protection+from+Bartonella+henselae-induced+damage%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Evidence of Bacteroides fragilis protection from Bartonella henselae-induced damage.</a> PLoS One. 7, 49653(2012).</li>
<li>Larson, J. A., Howie, H. L., So, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neisseria+meningitidis+accelerates+ferritin+degradation+in+host+epithelial+cells+to+yield+an+essential+iron+source%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Neisseria meningitidis accelerates ferritin degradation in host epithelial cells to yield an essential iron source.</a> Molecular Microbiology. 53, 807-820 (2004).</li>
<li>Festing, M. F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+variability+of+inbred+and+outbred+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Phenotypic variability of inbred and outbred mice.</a> Nature. 263, 230-232 (1976).</li>
<li>Festing, M. F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Warning%3A+the+use+of+heterogeneous+mice+may+seriously+damage+your+research%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Aging%22%5BJournal%5D)">Warning: the use of heterogeneous mice may seriously damage your research.</a> Neurobiology of Aging. 20, 237-244 (1999).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

In questo studio, descriviamo un protocollo sperimentale per indurre la meningite meningococcica nei topi adulti da i.cist. inoculazione di batteri meningococcici. A nostra conoscenza, nessun altro modello di meningite meningococcica è stato sviluppato in topi di laboratorio infettati da i.cist. percorso; in passato, in questo modo è stato esplorato per fornire modelli di meningite meningococcale sia in ratto31 che in coniglio32. È noto che il più alto tasso di malattia men...

Neisseria meningitidis è un Gram negativo - proteobacterium limitato all'ospite umano, ben noto per essere una delle cause più comuni di meningite e sepsi nella popolazione umana in tutto il mondo. Colonizza il tratto respiratorio superiore (naso e gola) di portatori sani e asintomatici (2-30% della popolazione), ma il batterio a volte elude varie difese immunitarie dell'ospite e si diffonde dal flusso sanguigno al cervello causando un locale incontrollato infiammazione, conosciuta come meningite meningococcale. Una combinazione di fattori ospiti e batterici sembra contribuire alla transizione dal comportamento commensale al comportamento invasivo1.
N. meningitidis è specializzata esclusivamente nella colonizzazione umana e nell'infezione. Ha una gamma di ospiti ristretta e, quindi, ha limitato gli studi di patogenesi in vivo a causa della mancanza di modelli animali adatti che riproducono la malattia meningococcale umana. Di conseguenza, aveva portato a lacune fondamentali nella comprensione per quanto riguarda la patogenesi della setticemia e meningite causata dal meningococco. Negli ultimi decenni, lo sviluppo di molti sistemi in vitro ha permesso l'identificazione di diversi fattori di virulenza meningococcica2,3,4. Sebbene questi preziosi studi abbiano fornito importanti informazioni per comprendere il ruolo di questi fattori per un'infezione meningococcica di successo, questi modelli non hanno permesso di valutare le conseguenze delle interazioni batteriche con l'ortore e il cellulare sistema immunitario e ancor meno con l'intero tessuto. I modelli animali in vivo di infezione sono di grande rilevanza anche per la valutazione del grado di protezione conferito dalle formulazioni del vaccino. Come patogeno umano-tropico, il meningococco possiede determinanti appropriati necessari per un'infezione di successo come le strutture superficiali (cioè, i pili di tipo IV e le proteine di opacità) e i sistemi di assorbimento del ferro per i recettori umani e le proteine di trasporto (ad es. transferrin e lattoferina)5,6,7 per aderire correttamente, sopravvivere e invadere l'ospite umano. Infine, le capacità di variazione genetica del patogeno per eludere e/o bloccare la risposta immunitaria umana contribuiscono ulteriormente al tropismo ad alta specie8,9. Pertanto, l'assenza di specifici fattori ospiti, coinvolti nell'interazione, può bloccare i passi del ciclo di vita dell'agente patogeno, stabilendo notevoli difficoltà nello sviluppo di piccoli modelli animali che riassumono il ciclo di vita meningococcico.
Negli ultimi decenni, sono stati sviluppati diversi approcci per migliorare la nostra comprensione del ciclo infettivo meningococcico. Le infezioni di due modelli animali, topo e ratto, sia per via intraperitonelale (i.p.) o per intranasale (i.n.), sono state sviluppate per riprodurre la malattia meningococcica10,11,12,13,14 ,15,16,17. Il topo da laboratorio è probabilmente uno degli animali più versatili per indurre l'infezione da meningococco sperimentale.
Tuttavia, il modo di infezione i.p. porta allo sviluppo di sepsi grave anche se non imita la via naturale dell'infezione, mentre la via dell'infezione i.n. è stata utile per valutare la patogenesi meningococcica, anche se può indurre l'infezione polmonare prima della sepsi10,11,12,13,14,15,16,17.
Il modello di mouse i.p. è stato strumentale per valutare la protezione dalla sfida meningococcico10,11,12. Il modello murino della colonizzazione meningococcica basata sulla via dell'infezione i.n. è stato sviluppato con topi infantili, in quanto sono più suscettibili alle meningococchi, per riprodurre un'infezione invasiva che imita il decorso della malattia meningococcica nell'uomo 13,14,15,16,17. Inoltre, per promuovere la replicazione meningococcica nell'ospite murino, sono state applicate anche un numero crescente di strategie tecniche tra cui la somministrazione del ferro agli animali per migliorare l'infezione, l'uso di inoculumbatterico elevato , ceppo batterico del passaggio di topo e l'impiego di ospiti animali infantili o immunocompromessi10,13,15,18,19. L'espressione di fattori umani specifici come CD4620 o transferrin21 ha aumentato la suscettibilità dei topi a questo batterio umano-tropico; l'impiego del modello xenotrapianto della pelle umana è stato utile anche per valutare la capacità di adesione di meningococci all'endotelio umano22,23. Collettivamente, il recente sviluppo di topi transgenici umanizzati ha migliorato la comprensione della patogenesi meningococcica e delle sue interazioni con l'ospite.
In precedenza, abbiamo sviluppato un modello murino di meningite meningococco dove l'inoculazione dei batteri è stata eseguita nella cisterna magna di topi adulti con batteri passati daitopi 24. I parametri clinici e il tasso di sopravvivenza dei topi infetti hanno dimostrato la creazione di meningite con caratteristiche paragonabili a quelle osservate nell'ospite umano, nonché le analisi microbiologiche e istologiche del cervello. Da questi topi infetti, i batteri sono stati, anche, recuperati dal sangue, fegato, e milza, e carichi batterici da organi periferici correlati con la dose infettiva. In particolare, questo modello è stato impiegato per valutare la virulenza di un ceppo mutante isogenico difettoso nel trasportatore L-glutammato GltT24. Recentemente, utilizzando il nostro modello murino di meningite meningococcica basata su i.cist. percorso con ceppo C sierogruppo C 93/42862,24 e un mutante isogenico difettoso nella codifica genica cssA per UDP-N-acetylglucosamine 2-epimerase2,abbiamo analizzato il ruolo dell'acido sialico esposto nello stabilimento della malattia nei topi.
In questo protocollo, descriviamo un metodo semplice per indurre meningite sperimentale meningococcica basata sull'i.cist. dell'infezione nei topi adulti balb/c. Questo metodo è particolarmente utile per la caratterizzazione dell'infezione da meningococco in un ospite murino, nonché per la valutazione della virulenza tra ceppi di riferimento di tipo selvaggio e mutanti isogenici. La via intra-cisternale dell'infezione garantisce la consegna completa delle meningocci direttamente nella cisterna magna, che a sua volta facilita la replica batterica nel liquido cerebrospinale (CSF) e induce la meningite con caratteristiche che imitano quelle presentesull'uomo 2,24,25,26.

<table><tbody><tr><td>1,8 Cryovial con gonna Con filettatura esterna</td><td>Starlab</td><td>E3090-6222</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Provetta conica in polipropilene</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td>30 mm x 115 mm</td></tr><tr><td>Pinza Adson</td><td>F.S.T.</td><td>11006-12</td><td>Termometro</td></tr> di <tr><td>allarme</td> in acciaio inossidabile <td>TESTO</td><td></td> 9000530 <td></td></tr><tr><td>BactoTM Proteose Peptone</td><td>BD</td><td>211693</td><td></td></tr><tr><td>BD Siringa Micro Fine</td><td>BD</td><td>320837</td><td>U-100 Siringa per insulina</td></tr><tr><td>BD Plastipak 1 mL 25 G 5/8 pollici</td><td></td><td>BD 300014</td><td>05 mm x 16 mm</td></tr><tr><td>Siringa BD Plastipak 5 mL</td><td>BD</td><td>308062</td><td>07 mm x 30 mm</td></tr><tr><td>BIOHAZARD AURA B CABINA A FLUSSO LAMINARE VERTICALE</td><td>Bio Air s.c.r.l.</td><td>Biofotometro Aura B3</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>Modello #6131</td><td></td></tr><tr><td>Bottiglia D</td><td>Tecniplast</td><td>D</td><td>Graduato fino a: 400 mL, Volume totale 450 mL, 72 mm x 72 mm x 122 mm</td></tr><tr><td>C150 CO2 Legante per incubatore</td><td></td><td>9040-0078</td><td></td></tr><tr><td>Corpo della gabbia Eurostandard Tipo II</td><td>Tecniplast</td><td>1264C</td><td>267 x 207 x 140 mm3, Superficie 370 cm2</td></tr><tr><td>Piastra Petri per colture cellulari con coperchio</td><td>Thermo Scientific</td><td>150288</td><td>Volume di lavoro: 5 mL</td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>Eppendorf</td><td>Microcentrifuge 5415R</td><td></td></tr><tr><td>Cuvetta semi-micro L. Forma</td><td>Kartell S.p.A.</td><td>01938-00</td><td></td></tr><tr><td>di-Potassio idrogeno fosfato triidrato</td><td>Carlo erba</td><td>471767</td><td></td></tr><tr><td>di-Sodio idrogeno fosfato anidro ACS-per analisi</td><td>Carlo Erba</td><td>480141</td><td>g1000</td></tr><tr><td>Diete Standard Certificate</td><td>Mucedola s.r.l.</td><td>4RF21</td><td>Pellet di cibo per animali</td></tr><tr><td>Dumont Hp Pinzette 5 Acciaio Inox</td><td>F.S.T. by DUMONT</td><td>AGT5034</td><td>0,10 x 0,06 mm2 punta</td></tr><tr><td>Bilancia elettronica</td><td>Gibertini</td><td>EU-C1200</td><td>Max 1200 g, d = 0,01 g, T = -1200 g</td></tr><tr><td>Eppendorf Microcentrifuge tube safe-lock</td><td>Eppendorf</td><td>T3545-1000EA</td><td></td></tr><tr><td>Eritromicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E-6376</td><td>25 g</td></tr><tr><td>Forbici Bonn Extra Fini</td><td>F.S.T.</td><td>14084-08</td><td>Filtro Superiore in Acciaio Inox</td></tr><tr><td>(mini-Isolatore), H-Temp con morsetti di bloccaggio</td><td>Tecniplast</td><td>1264C400SUC</td><td></td></tr><tr><td>GC agar base</td><td>OXOID</td><td>CM0367</td><td></td></tr><tr><td>Gillies Pinza 1 x2 denti</td><td>F.S.T.</td><td>11028-15</td><td>Acciaio</td></tr><tr><td>Inox Glicerin RPE</td><td>Carlo Erba</td><td>453752</td><td>1 L</td></tr><tr><td>Graefe Forcipe</td><td>F.S.T.</td><td>11052-10</td><td>Larghezza della punta seghettata: 0,8 mm</td></tr><tr><td>Coperchio interno</td><td>Tecniplast</td><td>1264C116</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di destrano di ferro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8517-25ML</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina</td><td>Intervet</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cabina di sicurezza microbiologica BH-EN e BHG Classe II</td><td>Faster</td><td>BH-EN 2004</td><td></td></tr><tr><td>Provette per microcentrifuga 1,5 mL&nbsp;</td><td>MARCA</td><td>PP780751</td><td>tappo a vite PP,</td></tr><tr><td>grad Pinze per la manipolazione del mouse</td><td>F.S.T.</td><td>11035-20</td><td>Gomma seghettata; Superficie di presa: 15 mm x 20 mm</td></tr><tr><td>Mucotit-F2000</td><td>MERZ</td><td>61846</td><td>2000 mL</td></tr><tr><td>Guanti in lattice naturale</td><td>Medica</td><td>M101</td><td></td></tr><tr><td>New Brunswick Classic C24 Incubatore Agitatore</td><td>PBI international</td><td>C-24 Classic Benchtop Incubator Shaker</td><td></td></tr><tr><td>Petri PS Piatti</td><td>VWR</td><td>391-0453</td><td>90 x 14,2 mm2</td></tr><tr><td>Pipetman Classic P20</td><td>Gilson</td><td>F123600</td><td>2-20 &mu; L</td></tr><tr><td>Pipetman Classic P200</td><td>Gilson</td><td>F123601</td><td>20-200 &mu; LL</td></tr><tr><td>Pipetman Classim P1000</td><td>Gilson</td><td>F123602</td><td>200-1.000 &mu; L</td></tr><tr><td>Polyvitox</td><td>OXOID</td><td>SR0090A</td><td></td></tr><tr><td>cloruro di potassio</td><td>J.T. Baker Chemicals B.V.</td><td>0208</td><td>250 g</td></tr><tr><td>Diidrogeno Fosfato di Potassio</td><td>J.T. Baker Chemicals B.V.</td><td>0240</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>PS Pinze monouso</td><td>VWR</td><td>232-0191</td><td></td></tr><tr><td>Divisore rimovibile</td><td>Tecniplast</td><td>1264C812</td><td></td></tr><tr><td>Provette in polipropilene a fondo tondo</td><td>Falcon</td><td>352063</td><td>5 mL</td></tr> di <tr><td>cloruro di sodio</td><td>MOLEKULA</td><td>41272436</td><td></td></tr><tr><td>fermo SS e FilterSheet in poliestere</td><td>Tecniplast</td><td>1264C</td><td></td></tr><tr><td>Pinza modello standard</td><td>F.S.T.</td><td>11000-12</td><td>Forbici per</td></tr><tr><td>tenotomia Stevens</td> in acciaio inox <td>F.S.T.</td><td>14066-11</td><td>Forbice chirurgica in acciaio inox</td></tr><tr><td>- ToughCut</td><td>F.S.T.</td><td>14130-17</td><td>Guanti monouso in</td></tr><tr><td>nitrile Stainless Touch N Tuff</td><td>Ansell</td><td>92-500</td><td></td></tr><tr><td>Congelatore a bassissima temperatura (ULT)</td><td>Haier</td><td>DW-86L288</td><td>Volume = 288 L</td></tr><tr><td>Forbici Wagner</td><td>F.S.T.</td><td>14070-12</td><td>Sottovaso</td></tr> <tr><td></td><td></td><td></td>in<td>xilazina</td></tr> in acciaio inossidabile</tbody></table>

indurre meningococcal meningitis serogroup c in topi tramite consegna intracisternale

Inducing Meningococcal Meningitis Serogroup C in Mice via Intracisternal Delivery

Neisseria meningitidis (meningococcus) è un microrganismo a portata stretta di ospite, riconosciuto a livello globale come la principale causa di meningite batterica. Il meningococco è un colonizzatore transitorio di nasofaringe nona l'uomo di circa il 10% del soggetto sano. In circostanze particolari, acquisisce una capacità invasiva di penetrare la barriera mucosale e invade il flusso sanguigno causando setticemia. Nell'ultimo caso, la sepsi fulminante potrebbe sorgere anche senza il conseguente sviluppo della meningite. Al contrario, i batteri potrebbero non moltiplicarsi male nel flusso sanguigno, attraversare la barriera ematoencefalica, raggiungere il sistema nervoso centrale, portando alla meningite fulminante. I modelli murini della meningite batterica rappresentano uno strumento utile per studiare le interazioni ospite-patogeno e per analizzare i meccanismi patogeni responsabili di questa malattia letale. Anche se, diversi sistemi di modelli sperimentali sono stati valutati nel corso degli ultimi decenni, nessuno di questi è stato in grado di riprodurre gli eventi patologici caratteristici della malattia meningococcica. In questo protocollo sperimentale, descriviamo una procedura dettagliata per l'induzione della meningite meningococco in un modello murino basato sull'inoculazione intracisternale dei batteri. I segni peculiari della meningite umana sono stati registrati nell'ospite murino attraverso la valutazione dei parametri clinici (ad esempio, temperatura, peso corporeo), la valutazione del tasso di sopravvivenza, l'analisi microbiologica e l'esame istologico della lesione cerebrale. Quando si utilizza l'inoculto intracisternale (i.cist.), le meningococci consegna completa direttamente in cisterna magna, portando ad una replica meningococcica molto efficiente nel tessuto cerebrale. Un aumento di 1.000 volte di conteggio praticabile di batteri è osservato in circa 18 h. Inoltre, le meningococchi si trovano anche nella milza e nel fegato dei topi infetti, suggerendo che il fegato può rappresentare un organo bersaglio per la replicazione meningococcica.

Sopravvivenza di topi infettati da N. meningitidis tipo selvaggio e ceppi mutanti isogenici. I ceppi di meningitidis Neisseria utilizzati in questi risultati rappresentativi sono il ceppo di riferimento C sierogruppo C 93/4286 (ET-37) e il suo mutante isogenico 93/4286,xx ottenuto mediante inattivazione adinsertionale del gene cssA, codifica per l'UDP-N-acetylglucosamina 2-epimerasi, che mappa nel locus di sintesi della capsula25. Per valutar...

Qui, descriviamo un metodo per indurre la meningite meningococcica attraverso una via intracisternale di infezione nei topi adulti. Vi presentiamo un protocollo passo dopo passo dell'infezione da meningococco dalla preparazione dell'inoculum all'infezione intracisternale; quindi registrare la sopravvivenza animale e valutare i carichi batterici nei tessuti murini.

Indurre Meningococcal Meningitis Serogroup C in Topi tramite consegna intracisternale

Neisseria meningitidis (meningococcus) is a narrow-host-range microorganism, globally recognized as the leading cause of bacterial meningitis. ...

Neisseria meningitidis è una delle cause più comuni di sepsi e meningitidi tra la popolazione umana di tutto il mondo, e il batterio è limitato all'ospite umano. In questo protocollo sperimentale, descriveremo la procedura su misura per l'induzione della meningitidis meningococcica in un modello di topo basato sull'inoculazione intracisternale dei batteri. Questo modello murino riproduceva i caratteristici eventi patologici della meningite meningococcica come una grave malattia umana.Quindi, rappresenta uno strumento utile per valutare l'interazione ospite-patogeno e per analizzare il meccanismo patogenetico responsabile di questa malattia letale. Il modello di infezione potrebbe essere utile non solo per valutare una strategia terapeutica innovativa per prevenire la replicazione batterica direttamente nel CSF, ma anche per analizzare l'efficacia di una possibile immunoterapia passiva contro gli agenti patogeni umani. La tecnica richiede la fase di allenamento per garantire il successo non solo dell'inoculo intracisternale, ma più in generale dell'induzione della malattia.A dimostrare le procedure saranno Roberta Colicchio e Chiara Pagliuca come ricercatrici, ed Elena Scaglione come dottoranda, tutte del mio laboratorio. Per iniziare, scegli una singola colonia da una fresca coltura di Neisseria meningitidis sulla piastra di agar gonococcico integrata con integratore di polibitox all'1% e inoculata in brodo GC da 10 millilitri. Tutte le procedure che prevedono l'uso di meningococchi devono essere fatte sotto un armadio a cubo di sicurezza bio a flusso laminare.Far crescere i batteri a 37 gradi Celsius in un incubatore di scuotimenti orbitali a 220 RPM e continuare a controllare la densità ottica della coltura in diversi punti di tempo con uno spettrofotometro. Far crescere la cultura fino a raggiungere OD600 di 0,7 corrispondente alla fase esponenziale iniziale. Una volta ottenuta questa densità ottica, fare scorte congelate aggiungendo il 10% di glicerolo e erogando un millilitro della coltura nelle fiale criogeniche.Conservare le fiale a 80 gradi Celsius fino all'uso. Prima dell'infezione, scongelare i batteri congelati a temperatura ambiente, quindi trasferirli in un tubo di centrifuga in centrifuga per 15 minuti a 1500xG Rimuovere il supernatante e sospendere di nuovo a un millilitro di brodo GC fresco contenente cinque milligrammi per chilogrammo di dextran di ferro. Prima di iniziare l'esperimento, pesare gli animali e valutare la loro temperatura corporea.Scuff l'animale dal collo verso il basso e disinfettare l'addome con un 70% di etanolo. Circa 2 ore prima dell'infezione, utilizzando un ago calibro 25, iniettare dextran di ferro per via intraperitoneale nel quadrante in basso a destra dell'addome. Dopo aver anestetizzato l'animale, controllare la profondità dell'anestesia confermando l'assenza di risposta al dolore dopo aver pizzicato l'allieta.Dopo aver posizionato il mouse sull'armadio di flusso laminare, posizionarlo in decubito sternale e allungare accuratamente gli arti e la colonna cervicale per mantenere la colonna vertebrale in posizione dritta. Per mantenere una sospensione batterica costante, mescolarla delicatamente prima di caricarla in una siringa con un ago calibro 30 di otto millimetri. Disinfettare la testa con un 70% di etanolo.Posizionare l'animale in recumbency laterale, estrarre le orecchie di mezzo e flettere moderatamente il collo. Assicurarsi che la linea mediana del collo e la testa siano in posizione perfettamente parallela al piano del tavolo. Quindi toccare le ali dell'atlante, assicurandosi che si sovrappongano e sentire l'indentazione naturale sulla linea mediana in cui è più probabile che l'ago entri nel foro occipitale.Riempire una siringa con un ago calibro 8 millimetri e 30 con la dose batterica sublettale stabilita di meningococchi o dextran di ferro integrata GC Broth come controllo in un volume totale di 10 microlitri. Utilizzare l'ago per identificare il punto di iniezione e quindi iniettare il contenuto della siringa alla cisterna magna dei topi attraverso un foro di bava occipitale. Scartare la siringa e l'ago in modo sicuro dopo l'iniezione.Posizionare l'animale nella gabbia sotto un armadio a flusso laminare. Attendere il risveglio e il pieno recupero del movimento e procedere per la sopravvivenza animale sugli animali infetti, come descritto nel protocollo. Dopo aver anestetizzato il topo, disinfettare il torace con un 70% di etanolo.Utilizzando un ago calibro 25 prelevare da 600 a 700 microlitri di sangue per puntura cardiaca della cavità toracica. Raccogliere il sangue in un tubo contenente il 3,8% di citrato di sodio e conservare a 80 gradi Celsius per la successiva valida valutazione del conteggio delle cellule batteriche. Posare il topo eutanasiato in posizione supina.Usando forbici e forcep tagliare la pelliccia lungo il piano sagittale del corpo. Con i perni, fissare la pelle con la pelliccia sui lati del corpo. Utilizzare forbici affilate per tagliare la membrana peritoneale.Quindi, con forbici e forcep usa e getta, asportare gli organi, come milza e fegato, e metterli in una piastra di Petri steril separata con un millilitro di brodo GC integrato con 10% glicerolo. Utilizzando uno stantuffo di una siringa da cinque millimetri, omogeneizzare meccanicamente gli organi a temperatura ambiente per circa due o tre minuti fino a formare una sospensione a cella singola e trasferirla in una fiala criogenica. Posizionare immediatamente il tubo sul ghiaccio secco.Preparare piatti di agar GC con antibiotici e asciugarli prima dell'uso a 37 gradi Celsius per due o tre ore. Preparare 10 diluizioni seriali complete dei campioni in BRODO GC da ogni tessuto omogeneizzato. Placcarli su piastre di agar GC e incubare durante la notte a 37 gradi Celsius con 5% di anidride carbonica.Con il 70% di etanolo, disinfettare la testa di un topo eutanasiato. Utilizzando piccole forbici chirurgiche e una forcep in acciaio a punta fine, ritagliare la pelliccia e la pelle della testa rimossa, quindi procedere verso la parte superiore del cranio per vedere chiaramente le suture e guidare l'apertura del cranio. Per aprire il cranio, inserire la punta di piccole forbici attraverso il forame magnum.Tagliare verso il centro del cranio e attraverso la linea mediana dell'osso parietale sul lato opposto del cranio e tagliare delicatamente lungo l'arto laterale della sutura lambdoide. Usando forcelle a punta fine, partendo dall'angolo parietale posteriore, sollevare il cranio e tirarlo diagonalmente verso l'alto per scoprire il cervello, assicurandosi che il tessuto cerebrale non sia attaccato ad alcun osso della testa quando il cranio viene sollevato. Usa le forcelle usa e getta per rimuovere qualsiasi tessuto connettivo tra il cranio e il cervello e non permettere al tessuto cerebrale di asciugarsi.Utilizzare forcep usa e getta per posizionare immediatamente il cervello in una piastra di Petri con un millilitro di brodo GC integrato con 10%glicerolo. Utilizzare lo stantuffo di una siringa da cinque millilitri per omogeneizzare meccanicamente il cervello a temperatura ambiente per circa due o tre minuti fino a formare una sospensione a singolo cellula. Trasferire la sospensione in un tubo sterile da 2 millilitri e conservare a 80 gradi Celsius per la successiva valutazione del conteggio delle cellule batteriche praticabile.È stata valutata la sopravvivenza dei topi infetti da ceppi di Neisseria meningitidis difettosi di tipo selvaggio o cssA. La dose letale mediana per il ceppo di tipo selvatico corrispondeva alla sfida meningococcica di 10 alla 4a CFU. Mentre il tasso di mortalità dal 10 al 5° CFU era pari all'83,4% e al 100% con 10 alla 5a dose di CFU.Per ottenere la dose letale mediana per il ceppo mutante difettoso cssA, era necessaria una dose di 10 all'8 ° CFU e quantità 1000 volte superiore al ceppo di tipo selvatico. Dopo l'iniezione, c'è stato un rapido aumento dei batteri di tipo selvatico nel tessuto cerebrale raggiungendo il picco a circa 24 ore dopo l'infezione. Nel cervello dei topi infettati dal ceppo mutante, i conteggi vitali sono diminuiti progressivamente nel tempo.Inoltre, il 33,3% dei topi infetti mutanti ha mostrato una clearance batterica dal sito di infezione, a differenza degli animali infetti di tipo selvatico. 48 ore dopo l'infezione, il mutante difettoso cssA è stato completamente eliminato nella milza e nel fegato, mentre gli animali infetti dal ceppo di tipo selvatico hanno mostrato un'infezione persistente. Il metodo sperimentale descritto potrebbe essere utile per analizzare i danni cerebrali associati a questa malattia letale, attraverso la sua valutazione patologica, come l'immunoistochimica, l'immunofluorescenza e l'analisi del sanguinamento cerebrale.

inducing-meningococcal-meningitis-serogroup-c-mice-via-intracisternal

Research

Ricerca

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Fonte: Zamboni, M., et al., Induzione della modifica delle cellule leptomeningee tramite iniezione intracisternale. J. Vis. Exp. (2020)Questo video mostra la procedura di somministrazione di un farmaco induttore nella cisterna magna di un topo anestetizzato. L'iniezione induce selettivamente l'espressione di marcatori fluorescenti nelle cellule della superficie cerebrale accessibili tramite il liquido cerebrospinale, confermata dall'imaging a fluorescenza.

Somministrazione mirata di farmaci in un modello murino tramite iniezione di Cisterna Magna

In questo video, dimostriamo la somministrazione intracisternale di Neisseria meningitidis in un modello murino per generare l'infezione da meningite.

Somministrazione intracisternale di meningococchi in modelli murini per indurre la meningite meningococcica

Questo video dimostra l'immunizzazione BCG intranasale nei topi, attivando risposte immunitarie sia innate che adattative, portando allo sviluppo di cellule T di memoria residenti nei polmoni e cellule B effettrici, migliorando così la protezione contro le infezioni da Mycobacterium.

Immunizzazione intranasale con BCG in un modello murino

Questo video dimostra il processo di iniezione intracerebroventricolare per studiare la distribuzione del citomegalovirus murino (MCMV) nel cervello del topo neonatale. L'MCMV, progettato per esprimere una proteina fluorescente verde potenziata (EGFP) per la visibilità, viene iniettato nel ventricolo laterale del cervello di un cucciolo di topo. Il virus iniettato circola attraverso il liquido cerebrospinale, infettando le cellule della regione periventricolare, compresa la zona marginale, il...

Un'iniezione intracerebroventricolare per analizzare la distribuzione del citomegalovirus murino nel cervello di un topo neonatale

Questo video dimostra la generazione di un modello murino con un'infezione del SNC. A un cucciolo da latte viene iniettato il virus sia per via intracranica che intraperitoneale. Il virus si diffonde, infettando il SNC causando la morte delle cellule neuronali e l'infiammazione. Il cucciolo viene valutato per i sintomi dell'infezione man mano che la malattia progredisce.

Generazione di un modello murino con un'infezione del sistema nervoso centrale

Fonte: Li, D., et al. Iniezione intratecale diretta di virus adeno-associati ricombinanti in topi adulti. J. Vis. Exp. (2019)Questo video mostra la procedura per l'iniezione intratecale di virus adeno-associati (AAV) nel liquido cerebrospinale (CSF) di un topo sveglio, coprendo la preparazione della siringa, l'allineamento spinale e l'inserimento preciso dell'ago. Questo metodo convalida la somministrazione genica mirata, supportando il suo potenziale per le terapie del SNC.

Somministrazione intratecale di virus in un modello murino per il trattamento delle malattie del sistema nervoso centrale

Neisseria meningitidis è un agente patogeno specifico umano che infetta i vasi sanguigni. In questo protocollo microvasi umani vengono introdotti in un topo da innesto di pelle umana su topi immunocompromessi. I batteri aderiscono ampiamente ai vasi umani, con conseguente danno vascolare e lo sviluppo del rash purpurica tipicamente osservato in casi umani.

Umanizzato mouse modello per studiare le infezioni batteriche Targeting il microcircolo

Descriviamo in dettaglio la metodologia seguita per confrontare l'efficacia protettiva e la risposta immunitaria polmonare indotta dall'immunizzazione intranasale e sottocutanea con BCG nel modello murino. I nostri risultati mostrano i benefici della vaccinazione polmonare e suggeriscono un ruolo della risposta mediata da IL17 nella protezione indotta dal vaccino.

L&#39;efficacia e la protezione polmonare risposta immunitaria seguito sottocutanea e intranasale BCG Amministrazione nei topi

Questo rapporto descrive un approccio semplice per indurre con successo la neurite autoimmune sperimentale (EAN) utilizzando la proteina della mielina zero (P0)180-199 del peptide in combinazione con adiuvante completo di Freund e tossina della pertosse. Vi presentiamo un paradigma sofisticato in grado di valutare con precisione l'entità dei deficit funzionali e neuropatologia che si verificano in questo EAN.

Un approccio semplice per indurre la neurite Autoimmune Sperimentale in topi C57BL/6 per le valutazioni funzionali e Neuropathological

Qui presentiamo un elegante protocollo per la valutazione in vivo di vaccino efficacia e host le risposte immunitarie. Questo protocollo può essere adattato per i modelli di vaccino che studiano virale, batterica o parassitari patogeni.

Valutazione delle risposte ospite-patogeno e l'efficacia del vaccino nei topi

Descriviamo un'iniezione intracisternache che impiega un ago piegato sulla punta che può essere stabilizzato al cranio, eliminando così il rischio di danni al parenchyma sottostante. L'approccio può essere utilizzato per la mappatura genetica del destino e manipolazioni delle cellule leptomeningeee e per il monitoraggio del movimento del fluido cerebrospinale.

Induzione di cellule leptomeningeali Modifica tramite iniezione intracisternale

Scopri come indurre la meningite meningococcica di sierogruppo C in topi tramite inoculazione intracisternale di Neisseria meningitidis. Questo modello murino riproduce gli eventi patologici della malattia umana per studiare le interazioni ospite-patogeno.

Indurre Meningococcal Meningitis Serogroup C in Topi tramite consegna intracisternale

Esplora altri video