Name: In Silico Modeling Method for Computational Aquatic Toxicology of Endocrine Disruptors: A Software-Based Approach Using QSAR Toolbox (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 s
Description: Scopri la modellazione in silico per la valutazione della tossicità acuta dei disgregatori endocrini nei pesci utilizzando l'OECD QSAR Toolbox. Questo metodo computazionale migliora l'affidabilità delle valutazioni ecotossicologiche.

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Questa ricerca è stata sostenuta dalla sovvenzione del National Research Council of Science & Technology (NST) dal governo sudcoreano (MSIP) (N.. CAP-17-01-KIST Europe) e il progetto 11911.

1. Attrezzature
<ol><li>Software: utilizzare OECD QSAR Toolbox 4.0 o versioni più recenti (download gratuito da <https://qsartoolbox.org/download/?) e software di analisi dei dati.</li>
	<li>Computer: per l'OCSE QSAR Toolbox, utilizzare: (i) tipo di sistema: 64 bit, Windows 7 o più recente; (ii) processore: I5 a 2,4 GHz, o un processore più veloce o CPU AMD equivalente; (iii) memoria installata (RAM): 6 GB; (iv) disco rigido (HDD): 20 GB di spazio libero su disco rigido (OECD QSAR Toolbox 4.3 Release Notes: <https://qsartoolbox.org/file/2019/02/Toolbox-4.3-Release-Notes-1.pdf>).</li>
</ol>2. Procedura
<ol><li>Casella degli strumenti QSAR dell'OCSE NOTA: Il Toolbox QSAR opera in sei moduli di flusso consecutivi a partire da Input e seguito da Profiling, Data, Category Definition, Data Gap Filling, quindi Report, situato nella parte superiore l'interfaccia del programma.<ol>
<li>Esplora le suddette sei fasi attraverso sei icone della barra degli strumenti facendo clic con il pulsante sinistro del mouse. In primo luogo, esaminare le fasi di Input, Data Gap Filling e Report che sono necessarie per eseguire il flusso di lavoro automatizzato "Endpoint ecotossicologico" e per documentarne i risultati.</li>
		<li>Dai un'occhiata alle fasi facoltative Profiling e dati. La fase di profilazione fornisce una prima visione del potenziale di tossicità (eco) della sostanza bersaglio e delle caratteristiche del destino ambientale. La fase di dati opzionale consente la ricerca di dati sperimentali disponibili relativi alla sostanza di destinazione.</li>
	</ol></li>
	<li>contributo<ol>
<li>All'avvio della casella degli strumenti QSAR, l'utente inizia dalla fase della casella degli strumenti di input per impostazione predefinita. QSAR Toolbox crea automaticamente un file di lavoro denominato "Document 1", che viene visualizzato nel pannello delle opzioni dello stage a sinistra dell'interfaccia del programma. Rinominare il file, se lo si desidera, facendo clic con il pulsante destro del mouse sul file di lavoro.</li>
		<li>Fare clic sul pulsante CAS nella barra degli strumenti Azioni, immettere il numero di servizio astratto chimico (CAS) della sostanza di destinazione nel campo di testo disponibile e fare clic su Cerca. Lo strumento cercherà quindi la sostanza di destinazione in base al numero CAS.</li>
		<li>Se necessario, scegliere altre opzioni di ricerca disponibili nella barra degli strumenti delle azioni, ad esempio la ricerca in base al nome della sostanza o al codice SMILES (Line entry System) di input molecolare semplificato. SMILES può essere inserito come 2D non stereochimico o stereochimico 3D contenente forme. Fare clic rispettivamente su Nome o Struttura. Utilizzare lo strumento Struttura per disegnare la sostanza di destinazione.</li>
		<li>Lo strumento di ricerca visualizza i risultati della ricerca tramite i record del database in una finestra popup. Scegliere il record che riporta una relazione CAS-SMILES "alta" (campoRelazione CS) se vengono recuperati più record per la sostanza di destinazione selezionando la casella a sinistra del record. Fare clic su OK. NOTA: Il procedimento da questo punto è possibile solo se il record recuperato contiene un codice SMILES, poiché il codice SMILES (2D non stereochimico contenente la forma) è la base per il calcolo.</li>
		<li>Modalità batch: per eseguire l'insilico saggio per più sostanze di destinazione, scrivere un semplice elenco di sostanze in un editor di testo in cui ogni numero CAS è elencato in una singola riga (Figura supplementare S3). Salvare il file di testo con un nome e un'estensione .txt appropriati nel computer.</li>
		<li>Modalità batch: fare clic su Dati. Quindi, vai a Database nel pannello delle opzioni dello stage a sinistra dell'interfaccia del programma. Assicurarsi che i database elencati in Informazioni ecotologiche siano selezionati.
</li>
		<li>Modalità batch: fare clic su Input. Selezionare Query dalla barra degli strumenti Azioni. Accettare le impostazioni impostate nel passaggio 2.2.6 facendo clic su Sì nella finestra di dialogo.</li>
		<li>Modalità batch: scegliere la scheda CAS. Caricare l'elenco di sostanze salvato come file di testo tramite Carica elenco dal computer.</li>
		<li>Modalità batch: sono disponibili due pulsanti Aggiungi; fai clic sul pulsante Aggiungi nella parte inferiore del menu a comparsa, quindi fai clic su Esegui. QSAR Toolbox visualizzerà un messaggio sul numero di sostanze recuperate per la ricerca. NOTA: alcune sostanze dell'elenco caricato potrebbero non essere trovate dallo strumento di ricerca o che diverse voci siano disponibili per un numero CAS. Non è possibile eliminare le sostanze dall'insieme di sostanze recuperate.</li>
	</ol></li>
	<li>Profilatura NOTA: la sezione seguente è facoltativa. Se questa operazione non è necessaria, passare alla sezione 2.5.<ol>
<li>Fare clic sul pulsante della fase della casella degli strumenti Profiling. Passare ai metodi di profilatura nel pannello delle opzioni della fase a sinistra dell'interfaccia del programma.</li>
		<li>Fare clic su Deseleziona tutto. Controllare tutti i profiler elencati in Predefinito e quelli relativi alla tossicità acquatica elencati in Specifico dell'endpoint, ad esempio "Classificazione della tossicità acquatica acuta di Verhaar (modificato)".</li>
		<li>Terminare la selezione. Quindi fare clic sul pulsante Applica nella barra degli strumenti Azioni. NOTA: QSAR Toolbox fornisce consigli su un insieme di profiler. Questi sono evidenziati in verde (adatto) e arancione (plausibile) quando si sceglie Opzioni > Colora per: > Endpoint selezionato nella matrice di dati nell'angolo superiore sinistro dei metodi di profilatura. Fare clic con il pulsante sinistro del mouse sul campo della matrice di dati accanto al punto finale di interesse. Gli endpoint disponibili sono elencati nell'albero degli endpoint accanto al pannello delle opzioni dello stage. Il tipo di sostanza del profiler indicherà se la sostanza di destinazione è una "sostanza chimica discreta". Le informazioni vengono visualizzate nell'albero degli endpoint espanso "Profilo", "Predefinito" e "Tipo di sostanza". Solo se la sostanza bersaglio è una sostanza chimica discreta può funzionare correttamente il flusso di lavoro automatizzato. "Classificazione di tossicità acquatica acuta da Verhaar (modificato)" fornisce una prima stima del meccanismo di tossicità acquatica acuta della sostanza bersaglio19,20. Le informazioni vengono visualizzate nell'albero degli endpoint espanso "Profile", "Endpoint Specific" e "Acute acuto con classificazione della tossicità acquatica di Verhaar (modificato)". Sono disponibili cinque classi: (classe 1) sostanze chimiche inedito (tossicità al basale); (classe 2) sostanze chimiche meno inedite; (classe 3) sostanze chimiche reattive; (classe 4) in particolare sostanze chimiche ad azione; (classe 5) per le sostanze chimiche non possibile classificare.</li>
		<li>Fare clic con il pulsante destro del mouse su Parametro nell'albero degli endpoint per eseguire modelli QSAR 2D e 3D integrati disponibili nella casella degli strumenti QSAR, se lo si desidera. Fare clic su Calcola/estrai tutti i parametri per tutte le sostanze chimiche nel menu a comparsa.</li>
		<li>I modelli QSAR 2D e 3D compilati in Parameter forniscono valori numerici. Utilizzare "Metodi di profilatura" per informazioni qualitative (vedere il passaggio 2.3.1).</li>
	</ol></li>
	<li>dati NOTA: questa sezione è facoltativa. Se non è necessario, passare alla sezione 2.5.<ol>
<li>Fare clic sul pulsante della fase della casella degli strumenti Dati.Click on the toolbox stage button Data. Quindi, fare clic su Raccogli dalla barra degli strumenti Azioni.</li>
		<li>Selezionare Tutti gli endpoint per raccogliere tutti i dati sperimentali, quindi Scegliere per raccogliere dati sperimentali specifici dell'endpoint. Ad esempio, se la tossicità acquatica è l'obiettivo dell'utente, fare clic su Scegli > Informazioni ecotossicologiche > Tossicità acquatica > OK. NOTA: la scelta di raccogliere dati sperimentali per tutti gli endpoint può portare a tempi di elaborazione prolungati. L'utente può adattare la gerarchia dell'albero dell'endpoint allo scopo specifico. Questo cambia il modo in cui vengono visualizzati i dati.</li>
		<li>Se lo si desidera, fare clic con il pulsante destro del mouse sul punto finale di interesse nell'area dell'albero dell'endpoint. Scegliere Imposta gerarchia albero nel menu a comparsa. Organizzare l'albero degli endpoint nel modo preferito utilizzando i termini e le frecce disponibili e fare clic su OK.
</li>
		<li>Se lo si desidera, esportare i dati raccolti come file Excel. Fare clic con il pulsante destro del mouse sul punto finale di interesse e scegliere Esporta matrice di dati nel menu a comparsa.</li>
		<li>Viene visualizzata una procedura guidata "Esportazione matrice" che consente di aggiungere altri endpoint all'elenco di esportazione. Terminare la selezione, fare clic su Esporta e salvare il file nel computer. NOTA: l'esportazione di dati da tutti i database non è possibile. Ad esempio, non è possibile salvare i dati recuperati dal database "ECHA CHEM".</li>
	</ol></li>
	<li>Riempimento gap di dati<ol>
<li>Fare clic sul pulsante della fase della casella degli strumenti Riempimento gap di dati. Quindi, fare clic su Automatizzato nella barra degli strumenti Azioni.</li>
		<li>Selezionare Endpoint ecotossico > Pesce, LC50 (concentrazione letale, 50%) a 96 h per i promelas Pimephales (mortalità). Fare clic su OK. Apparirà un "Controller del flusso di lavoro" e l'elaborazione richiederà diversi minuti, soprattutto in modalità batch. NOTA: QSAR Toolbox applica automaticamente un insieme definito di profiler durante la ricerca di sostanze adatte con dati sperimentali disponibili per la previsione. I dati sperimentali [ad es. concentrazioni di effetti 96 h LC50 (P. promelas) o 96 h EC50 (P. promelas, mortalità)] vengono utilizzati per generare la previsione per la sostanza bersaglio mediante approssimazione lineare o più vicina metodo adiacente. Si noti che i metodi di approssimazione lineare e il vicino più vicino sono indicati rispettivamente come analisi delle tendenze (etichettate come "T") e read-across (etichettato come "R").</li>
		<li>L'utente riceverà un messaggio se la stima viene eseguita correttamente. Fare clic su OK e chiudere il controller del flusso di lavoro che indica "Flusso di lavoro completato" facendo clic su x nell'angolo superiore destro.</li>
		<li>Modalità batch: all'avvio del flusso di lavoro automatizzato, all'utente verrà chiesto di specificare l'intervallo di sostanze su cui eseguire il flusso di lavoro. Accettare l'intera gamma di sostanze selezionate per impostazione predefinita nella finestra di dialogo facendo clic su OK.
</li>
		<li>Modalità batch: l'utente non riceverà un messaggio che indica se una stima è stata eseguita correttamente o meno. Chiudere il controller del flusso di lavoro che indica "Flusso di lavoro completato" alla fine dell'elaborazione batch facendo clic su x nell'angolo superiore destro.</li>
	</ol></li>
	<li>resoconto<ol>
<li>Se una stima è stata eseguita correttamente, fare clic sul pulsante della fase della casella degli strumenti Report.If a prediction was successfully executed, click on the toolbox stage button Report. NOTA: non è possibile generare report in modalità batch.</li>
		<li>Scorrere verso il basso e trovare il valore di stima nel campo della matrice che si trova in una riga evidenziata in giallo accanto all'endpoint "96-h". Il valore stimato è etichettato con "T" o "R". Attivare questo campo specifico della matrice di dati facendo clic con il pulsante sinistro del mouse su di esso.</li>
		<li>Fare clic su Previsione nella barra degli strumenti Azioni. Personalizzare il contenuto e l'aspetto del report nella procedura guidata popup. Sono disponibili tre tipi di report: (i) stima, categoria (ii) e (iii) matrice di dati.</li>
		<li>La procedura guidata consente all'utente di inserire il nome dell'autore e i dettagli di contatto. Scrivi un breve riassunto, fornisci una spiegazione dettagliata dell'interpretazione meccanicistica o giustifica l'adeguatezza della previsione.</li>
		<li>Includere informazioni aggiuntive relative alla stima eseguita, se lo si desidera. L'entità delle informazioni aggiuntive dipende dall'utente.</li>
		<li>Eseguire la procedura guidata facendo clic su Avanti. Infine, fare clic su Crea report e salvare i report di stima e categoria come file PDF e la matrice di dati come foglio di calcolo di Excel nel computer.</li>
		<li>Ulteriori dettagli sulle funzionalità di QSAR Toolbox e sui flussi di lavoro automatizzati sono disponibili nel manuale dell'applicazione per l'OCSE QSAR Toolbox v.4 (Guida F1 sulla tastiera). I dettagli sugli algoritmi e le motivazioni alla base del flusso di lavoro automatizzato sono descritti da Dimitrov et al.8 e Yordanova et al.9.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Applicazione
<ol><li>Se si utilizza la concentrazione dell'effetto prevista (cioè 96-h LC50 di P. promelas) nella valutazione del rischio ambientale, utilizzare il limite inferiore dell'intervallo di confidenza del 95%. Individuare i dati nella prima pagina del report di stima salvato (PDF) in "Riepilogo previsione", "Valore previsto: <media> (da <limite_inferiore> a <limite_superiore>)." NOTA: Le note qui fornite si basano sui risultati del confronto tra i dati previsti e sperimentali per una serie di sostanze bersaglio riportate in questo studio. La selezione dell'estremità inferiore della gamma di confidenza del 95% aumenterà la probabilità che la concentrazione dell'effetto previsto non sottovaluti la reale tossicità della sostanza (vedi i risultati rappresentativi). La concentrazione effettiva prevista del limite inferiore dell'intervallo di confidenza del 95% presenterà pertanto una base più sicura per la valutazione del rischio.</li>
</ol>

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<li>Mombelli, E., Devillers, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+OECD+%28Q%29SAR+Application+Toolbox+and+Toxtree+for+predicting+and+profiling+the+carcinogenic+potential+of+chemicals%5BTitle%5D)+AND+%22SAR+QSAR+Environmental+Research%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the OECD (Q)SAR Application Toolbox and Toxtree for predicting and profiling the carcinogenic potential of chemicals.</a> SAR QSAR Environmental Research. 21, 731-752 (2010).</li>
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<li>Li, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+unknown+by-products+in+drinking+water+using+comprehensive+two-dimensional+gas+chromatography-quadrupole+mass+spectrometry+and+in+silico+toxicity+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Chemosphere%22%5BJournal%5D)">Identifying unknown by-products in drinking water using comprehensive two-dimensional gas chromatography-quadrupole mass spectrometry and in silico toxicity assessment.</a> Chemosphere. 163, 535-543 (2016).</li>
<li>Devillers, J., Mombelli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+OECD+QSAR+Application+Toolbox+and+Toxtree+for+estimating+the+mutagenicity+of+chemicals.+Part+1.+Aromatic+amines%5BTitle%5D)+AND+%22SAR+QSAR+Environmental+Research%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the OECD QSAR Application Toolbox and Toxtree for estimating the mutagenicity of chemicals. Part 1. Aromatic amines.</a> SAR QSAR Environmental Research. 21, 753-769 (2010).</li>
<li>Devillers, J., Mombelli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+OECD+QSAR+Application+Toolbox+and+Toxtree+for+estimating+the+mutagenicity+of+chemicals.+Part+2.+%CE%B1-%CE%B2+unsaturated+aliphatic+aldehydes%5BTitle%5D)+AND+%22SAR+QSAR+Environmental+Research%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the OECD QSAR Application Toolbox and Toxtree for estimating the mutagenicity of chemicals. Part 2. α-β unsaturated aliphatic aldehydes.</a> SAR QSAR Environmental Research. 21, 771-783 (2010).</li>
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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

La versatilità della casella degli strumenti QSAR dell'OCSE come software analitico per l'ecotossicologia è mostrata qui con particolare interesse per gli effetti negativi delle sostanze chimiche interferenti endocrine sui vertebrati acquatici. Inoltre, è stato dimostrato un protocollo semplice e standard per prevedere la tossicità acuta (96-h LC50) di 74 ED rappresentativi (Tabella 1) per le specie ittiche. Ciò è stato ottenuto applicando la creazione di categorie, il riempimento delle lacune nei dati e i moduli di profilatura ER incorporati nella casella degli strumenti QSAR (Figura 1, Figura 2).
La correlazione lineare tra il log10LC50 e il log10KOW con una pendenza negativa (come mostrato nella Figura supplementare S1)è stata a lungo conosciuta come una relazione quantitativa standard nelle analisi QSAR25, dove maggiore tossicità, più idrofobica è una determinata sostanza chimica. Come si può vedere da un semplice calcolo, la relazione matematica generale che include l'equazione S1 e l'equazione S2 (Informazionisupplementari ) è un'espressione convertita dalla seguente funzione di potenza26:
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/60054/60054equ01.jpg">
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/60054/60054equ02.jpg">
Dal grafico di (Equazione 2), caratterizzando un intervallo intermedio di KOW26 può essere possibile regolando i parametri a e b, dove una certa variazione di idrofobicità (o idrofilia) non cambia in modo significativo il della tossicità acuta.
Analisi comparative tra le previsioni computazionali e le osservazioni sperimentali sull'LC50, come mostrato nella Figura 3 e nella Figura 4, sono state in genere riportate negli studi del QSAR per vari tossici acquatici, tra cui surfactants tecnici nonionici27, triangolari fungicidi28e metaboliti pesticidi21. Questo tipo di convalida retrospettiva fornisce informazioni su quanto un determinato strumento QSAR può raggiungere in termini di prestazioni comparative ai risultati sperimentali. In questo studio di tossicità acuta nei pesci, il QSAR Toolbox è stato dimostrato di fornire previsioni protettive per oltre il 90% delle ED testate in tutti i pesci e in una singola specie, Pimephales promelas.
È necessario identificare ulteriormente le tre sostanze chimiche anomale nella Figura 3 e nella Figura4, che hanno mostrato in media l'LC50 previsto e al minimo, rispettivamente. In primo luogo, il 3',5,7-triidy-4',6-dimehoxyisoflavone è un tipo di flavonoide (più specificamente, un isoflavone), che è considerato generalmente sicuro e utilizzato in prodotti farmaceutici a base di erbe; tuttavia, ha ancora problemi legati agli estrogeni29 e può causare tossicità acuta probabilmente attraverso il fosfororylazione ossidativa disaccoppiamento30. Successivamente, il 1,4-benzenediolo, chiamato idroquinone, è un composto fenolico che può innescare una risposta immunitaria non specifica e citotossica nel pesce31. Infine, il 4-esilfenolo è stato conosciuto per esibire sufficiente attività estrogenica positiva per essere classificato come un ED32. È stato ben studiato che la ragione principale della tossicità acuta dell'idroquinone è il ciclo di riduzione-ossidazione (redox). L'idroquinone viene ossidato al benzoquinone e ridotto a semi-quinone o idroquinone ripetutamente, con cofattori impoveriti e generando specie reattive di ossigeno33. Le altre due sostanze chimiche possono richiedere indagini più approfondite per rivelare i loro meccanismi di azione nell'ecotossicità acuta utilizzando approcci di attracco molecolare come quello utilizzato da Panche et al.34, che non possono essere coperti dalla casella degli strumenti QSAR.
EDs interferire con il sistema endocrino principalmente attraverso interazioni fisico con recettori steroidei come recettori estrogeni e androgeni, che sono di notevole interesse negli studi di modellazione QSAR35. Considerando questo, il QSAR Toolbox è robusto in termini di facile e rapida classificazione delle affinità di legame ER per una serie di sostanze chimiche basate solo sui descrittori 2D delle strutture molecolari. Quando questo sistema di profiler ER è stato applicato alla nostra lista di ED, non è stata trovata una chiara correlazione tra affinità di legame ER e idrofobicità (Figura supplementare S2). Questo risultato può essere spiegato dal fatto che la formazione di un complesso steroide-recettore non è una conseguenza diretta di un contributo di legame idrofobico, ma dovrebbe essere accompagnata da un cambiamento conformazionale nella struttura del recettore del sito attivo36. Il legame del recettore può essere dovuto anche al legame dell'idrogeno e all'impilamento z-
Inoltre, la posizione di ogni gruppo chimico sulla molecola può influenzare il legame del recettore, anche se l'idrofobicità e il numero di accettatori-donatori di legame di idrogeno rimangono gli stessi. In secondo luogo, il profiler ER ha prodotto tendenze contrarie tra i livelli medi l'LC50 previsti e quelli sperimentali con un'affinità di legame ER crescente (Figura 5). Questo può essere dovuto al fatto che la letalità dei genitori in un test di tossicità acuta non è dovuta al legame CON, ma piuttosto alla narcosi nella maggior parte dei casi, o al ciclo di ridox nel caso dell'idroquinone. Ad esempio, è necessaria un'analisi più approfondita, inclusa la tossicità cronica, affinché un insieme più ampio di ED definisca limitazioni predittive della versione corrente di QSAR Toolbox.
Questa ricerca preliminare può anche avere implicazioni per la salute pubblica perché gli steroidi (androgeni, estrogeni, progestini, e corticoidi) e loro recettori presentano strutture macromolecolari simili o addirittura identiche tra vertebrati5. Questi tipi di sistemi di segnalazione endocrina analoghi possono funzionare utilizzandoun meccanismo comune negli eventi chiave di ED5 . Tuttavia, sono necessarie metodologie aggiuntive e complementari per illuminare questo aspetto vasto e complesso [ad esempio, eseguendo la modellazione computazionale dell'assorbimento, della distribuzione, del metabolismo e dell'escrezione (ADME) e/o dei risultati negativi (AOP)]38. Inoltre, poiché la maggior parte delle preoccupazioni scientifiche e pubbliche sollevate circa gli effetti negativi degli ED sono legate alle loro tossicità croniche, migliorando i database e gli algoritmi nel QSAR Toolbox e producendo un'ecotossiciologia affidabile a lungo termine previsioni per ed sono entrambe necessarie.
Questo documento dimostra l'applicazione di QSAR Toolbox per confrontare i valori di LC50 ecotossicologico per i pesci con i valori di log10Kow di EDs. è stato rivelato da studi precedenti (ad esempio, Kim et al.39) che il log10Kow non è un buon predittore diretto di LC50acquatico . Nonostante questa limitazione, questo protocollo fornisce una revisione generale o "vignetta" per descrivere come utilizzare il dashboard per un determinato scopo, poiché si tratta di un'applicazione valida per utilizzare la casella degli strumenti QSAR per analizzare le correlazioni tra LC50 (o binding ER affinità) e il log10Kow, o come strumento per uno screening rapido dell'ecotossicità acuta. Tuttavia, va notato che (1) illuminare il legame tra il legame del recettore estrogeno e la tossicità cronica, piuttosto che la tossicità acuta (letalità), è più rilevante in modo che possano essere trovate correlazioni più chiare e (2) il recettore degli androgeni, insieme con quello degli estrogeni, svolge anche un ruolo fondamentale nella tossicità riproduttiva. Pertanto, è necessario per la versione futura di QSAR Toolbox per migliorare le funzioni di stima alla luce di questi due punti.

I nuovi sviluppi nell'informatica e nella tecnologia computazionale hanno potenziato le scienze biologiche con metodologie quantitative che offrono alta precisione e affidabilità1. In particolare, gli algoritmi utilizzati nella tassonomia molecolare e nella classificazione delle proprietà hanno portato a modelli di relazione quantitativa struttura-attività (QSAR)2. Questi modelli correlano automaticamente le strutture chimiche e le attività biologiche di un dato database chimico e implementano uno screening rapido in silico di una vasta gamma di substrati chimici in base alle loro azioni medicinali o tossicologiche3. Gli strumenti QSAR possono produrre profili di tossicità predittiva in funzione di vettori di caratteristiche di descrittori molecolari (cioè parametri fisici) di sostanze chimiche di interesse per creare numericamente endpoint categorici4. In genere, ogni endpoint quantitativo viene visualizzato come un grafico a dispersione 2D rispetto alle modifiche nei valori del descrittore. Viene quindi generato un modello QSAR utilizzando analisi di regressione lineare (multiple). Una volta che un set di dati è stato sfruttato appieno per costruire un modello QSAR (denominato set di training), il modello viene convalidato statisticamente stimando gli endpoint di un gruppo di sostanze chimiche non incluse nel set di training (denominato set di test). Il modello può quindi essere utilizzato per prevedere le attività biologiche dei composti non testati3.
Tra le molte sostanze chimiche nocive, interferenti endocrini (ED) sono stati evidenziati come un gruppo di tossici che possono interferire in numerosi metabolismo ormonale nei mammiferi, anfibi, e pesce5,6. ED sono noti per indurre una varietà di effetti avversi, come tumori e malformazioni, bloccando o alterando le normali vie ormonali o attivando segnali di sintesi/degradazione ormonale anormale. Di conseguenza, queste sostanze chimiche che imitano gli ormoni possono perturare i sistemi endocrini in modo tale da ostacolare lo sviluppo biologico e la riproduzione delle popolazioni animali selvatiche. In particolare, gli effetti ecotossicologici delle ED sono stati ampiamente studiati nei vertebrati acquatici, che hanno strutture del recettore ormonale quasi identiche a quelle dei mammiferi, compresi gli esseri umani. Poiché tutte le azioni ormonali si verificano a basse dosi in vivo, prevedere le potenziali tossicità dei candidati ED utilizzando rapidi screening in silico è fondamentale per la salute pubblica e ambientale.
Sono stati condotti modelli QSAR basati sulla tossicologia degli Ed, utilizzando descrittori 2D e 3D (noti rispettivamente come QSAR 2D e 3D), che rivelano le affinità leganti ligando ED di estrogeni, androgeni e recettori del progesterone7. Nonostante i vantaggi ad alta precisione di QSAR 3D, in cui vengono considerate le interazioni conformazionali ed elettrostatiche, 2D QSAR mantiene la propria robustezza in algoritmi matematici diretti, calcoli rapidi e carichi computazionali estremamente bassi. Inoltre, i modelli 2D-QSAR sono flessibili per l'uso in un'ampia gamma di applicazioni, ottenendo al contempo prestazioni di stima relativamente accurate.
L'OCSE QSAR Toolbox è attualmente uno degli strumenti software per computer più utilizzati, fornendo modelli QSAR liberamente disponibili e pre-costruiti8,9. Il profiler utilizza database descrittori 2D. Dal rilascio della prima versione nel 2008, il software è stato applicato nei settori delle industrie chimiche e biologiche, della salute pubblica e della sicurezza ambientale per un'analisi completa o parziale dei potenziali rischi dei composti naturali e sintetici, con interessi particolari in carcinogenesi10,11,12, mutagenicità13,14,15, e tossicità dello sviluppo16. È stata inoltre dimostrata l'applicazione alla tossicologia acquatica, con particolare attenzione alla bioaccumulazione e alla biotrasformazione17.
Il QSAR Toolbox si è dimostrato utile nel prevedere la tossicità a breve termine di una vasta gamma di sostanze chimiche17, così come le affinità di legame del recettore estrogeno (ER) di EDs18. Tuttavia, l'ecotossicità acuta delle ED nei vertebrati acquatici non è stata analizzata utilizzando QSAR Toolbox. In questo studio, viene presentato un protocollo tipico e facile per eseguire la modellazione QSAR sugli effetti avversi acuti delle ED con particolare attenzione alle specie ittiche. Lo studio mostra che il QSAR Toolbox è un software altamente accessibile per calcolare e prevedere la letalità/mortalità dei vertebrati acquatici per alcuni ED rappresentativi. La figura 1 mostra lo schema generale per il funzionamento generale del QSAR Toolbox. Il flusso di lavoro illustrato nella Figura 2 fornisce istruzioni semplici su come utilizzare il saggio in silico per prevedere l'ecotossicità acuta di sostanze bersaglio come le sostanze chimiche interferenti endocrine.

<table><tbody><tr><td>Adobe Acrobat Reader DC</td><td>Adobe Systems Software Ireland Limited</td><td>NA</td><td>Necessario per visualizzare il report di previsione e categoria</td></tr><tr>Sistema<td>informatico</td><td>: Microsoft Corporation</td><td>NA</td><td>Proprietà di sistema consigliate: (i) tipo di sistema: 64 bit, Microsoft Windows 7 o più recente, (ii) processore: I5 a 2,4 GHz o processore più veloce o CPU AMD equivalente, (iii) memoria installata (RAM): 6 GB di RAM, (iv) Unità disco rigido (HDD): 20 GB di spazio libero su disco rigido</td></tr><tr><td>Microsoft Editor</td><td>Microsoft Corporation</td><td>NA</td><td>Necessario per caricare un elenco di sostanze di numeri CAS (modalità batch) nell'OECD QSAR Toolbox come file .txt (file di testo)</td></tr><tr><td>Microsoft Excel 2016</td><td>Microsoft Corporation</td><td>NA</td><td>Necessario per esportare i dati dall'OECD QSAR Toolbox come file .cvs, .xls o .xlsx</td></tr><tr><td>OECD QSAR Toolbox versione 4.0 o successiva</td><td>Organizzazione per la cooperazione e lo sviluppo economico </td><td>NA</td><td>Necessario per eseguire OECD QSAR Toolbox Automated Workflows; download gratuito: https://qsartoolbox.org/download/</td></tr> <tr><td>OriginPro 9</td><td>OriginLab Corporation</td><td>NA</td><td>Programma opzionale per l'analisi dei dati; strumenti simili possibili</td></tr></tbody></table>

in silico modeling method for computational aquatic toxicology of endocrine disruptors: a software-based approach using qsar toolbox

In Silico Modeling Method for Computational Aquatic Toxicology of Endocrine Disruptors: A Software-Based Approach Using QSAR Toolbox

Le analisi computazionali dei processi tossicologici consentono lo screening ad alto velocità di lavorazione delle sostanze chimiche e la previsione dei loro endpoint nei sistemi biologici. In particolare, i modelli quantitativi di relazione struttura-attività (QSAR) sono stati sempre più applicati per valutare gli effetti ambientali di una pletora di materiali tossici. Negli ultimi anni, alcuni altri tipi evidenziati di tossici sono interferenti endocrini (ED, che sono sostanze chimiche che possono interferire con qualsiasi metabolismo ormonale). Poiché gli ED possono influenzare in modo significativo lo sviluppo e la riproduzione degli animali, è necessario prevedere rapidamente gli effetti negativi dell'uso di ED nelle tecniche in silico. Questo studio presenta un metodo in silico per generare dati di previsione sugli effetti delle ED rappresentative nei vertebrati acquatici, in particolare nelle specie di pesci. Il protocollo descrive un esempio utilizzando il flusso di lavoro automatizzato del software QSAR Toolbox sviluppato dall'Organizzazione per la cooperazione e lo sviluppo economico (OCSE) per consentire previsioni di ecotossicità acuta delle ED. Di conseguenza, vengono determinati i seguenti: (1) calcolo delle correlazioni numeriche tra la concentrazione per il 50% della letalità (LC50) e il coefficiente di partizione octanol-acqua (Kow), (2) prestazioni di uscita in cui l'LC50 i valori determinati negli esperimenti vengono confrontati con quelli generati dai calcoli e (3) la dipendenza dell'affinità di legame del recettore degli estrogeni sulla relazione tra Kow e LC50.

La modellazione Quantitative structure-activity relationship (QSAR) è un metodo rappresentativo assistito dalla bioinformatica nello screening tossicologico. Questo protocollo dimostra come valutare computazionalmente i rischi di interferenti endocrini (ED) in ambienti acquatici. Utilizzando l'OCSE QSAR Toolbox, il protocollo implementa un test in silico per analizzare la tossicità delle ED nei pesci.

Computational analyses of toxicological processes enables high-throughput screening of chemical substances and prediction of their endpoints in biological ...

Il nostro protocollo utilizza un programma software altamente accessibile e aperto per consentire un rapido calcolo degli effetti avversi a breve termine delle sostanze chimiche che alterano il sistema endocrino. Questa cassetta degli attrezzi QSAR dell'OCSE è utile per prevedere la tossicità delle sostanze chimiche e fornisce un metodo efficace per valutare l'ecotossicità acuta degli interferenti endocrini in modo user-friendly. All'avvio della Casella degli strumenti QSAR, l'utente inizia dalla fase della Casella degli strumenti di input per impostazione predefinita e la Casella degli strumenti crea automaticamente un file di lavoro denominato Documento 1.Dopo aver fatto clic su Numero di servizio astratto chimico, immettere il numero di servizio astratto chimico della sostanza di destinazione nel campo di testo disponibile e fare clic su Cerca. Tramite il pulsante Struttura, la sostanza può anche essere cercata dal codice del sistema semplificato di immissione della linea di ingresso molecolare. Per eseguire il saggio in silico per più sostanze bersaglio, scrivere un semplice elenco di sostanze in un editor di testo in cui ogni numero di servizio chimico astratto è elencato in una singola riga e salvare il file di testo con un nome appropriato.Fare quindi clic su Dati e verificare che i database elencati in Informazioni ecotossicologiche siano selezionati. Fare clic su Input, selezionare Query e fare clic su Sì nella finestra di dialogo per accettare le impostazioni selezionate. Nella scheda Servizio astratto chimico selezionare Carica elenco per caricare l'elenco di sostanze salvato come file di testo.Fare clic su Aggiungi nella parte inferiore del menu a comparsa e quindi su Esegui. La Casella degli strumenti QSAR mostrerà un messaggio che indica il numero di sostanze recuperate per la ricerca. Per la profilatura, fate clic sul pulsante della fase Casella degli strumenti profilatura e passate ai metodi di profilatura nel pannello delle opzioni del palco.Fate clic su Deseleziona tutto (Unselect All) nella finestra Metodi profilatura (Profiling Methods) e confermate che tutti i profilai elencati in Predefiniti e i profiloi correlati alla tossicità acquatica in Specifica endpoint sono selezionati, quindi fate clic su Applica (Apply), fate clic con il pulsante destro del mouse su Parametri (Parameters) per eseguire i modelli QSAR 2D e 3D integrati come desiderato. Per la raccolta dei dati, fare clic sul pulsante della fase Casella degli strumenti dati e fare clic su Raccogli sulla barra degli strumenti azioni. Selezionare Tutti gli endpoint per raccogliere tutti i dati sperimentali oppure Scegliere di raccogliere i dati sperimentali specifici dell'endpoint.Fare clic con il pulsante destro del mouse sull'endpoint di interesse e organizzare l'albero degli endpoint nel modo preferito utilizzando i termini e le frecce disponibili prima di fare clic su Ok. Quindi fare clic con il pulsante destro del mouse sull'endpoint di interesse e scegliere Esporta matrice di dati per esportare i dati raccolti in un foglio di calcolo. Verrà visualizzata un'esportazione guidata matrice che abilita l'aggiunta di altri endpoint all'elenco di esportazione.Completare la selezione e fare clic su Esporta per salvare il file. Per il riempimento del gap di dati, fare clic sul pulsante della fase Casella degli strumenti di riempimento del gap di dati e fare clic su Automatizzato. Selezionare Informazioni ecotossicologiche e pesce, concentrazione letale al 50% a 96 ore e fare clic su Ok.Verrà visualizzata la finestra del controller del flusso di lavoro. Se si esegue la modalità Batch, specificare l'intervallo di sostanze su cui eseguire il flusso di lavoro. Se la stima è stata eseguita correttamente, fare clic sul pulsante della fase casella degli strumenti report, fare clic con il pulsante sinistro del mouse sul valore di stima risultante, scegliere Previsione e personalizzare il contenuto e l'aspetto del report nella procedura guidata popup.Dopo aver fatto clic su Avanti, fare clic su Crea report e salvare i report di previsione e categoria come file PDF e la matrice di dati come file di foglio di calcolo. In questa analisi quantitativa delle tossicità acute previste di alcuni interferenti endocrini, quando sono stati tracciati i punti dati previsti rispetto ai punti dati sperimentali come scala log log è stata trovata una correlazione positiva tra entrambi i parametri per tutti i pesci analizzati e per le nostre specie rappresentative. Per consentire una valutazione della sicurezza della massima affidabilità, è stata eseguita un'ulteriore analisi computazionale tracciando il limite inferiore previsto dell'intervallo di confidenza del 95% della concentrazione letale al 50% rispetto ai valori derivati sperimentalmente.In questa valutazione con un'elevata soglia di sicurezza, il 92% del totale dei composti interferenti endocrini testati è risultato rientrare nell'intervallo protettivo rispetto ai valori derivati sperimentalmente. Qui i livelli medi della concentrazione letale prevista a valori del 50% per i leganti del recettore degli estrogeni erano superiori a quelli dei non leganti. Al contrario, per la concentrazione letale sperimentale a valori del 50%, tre livelli dei leganti non e deboli erano superiori a quelli dei leganti del recettore degli estrogeni più forti.Questa procedura può essere applicata solo a sostanze chimiche con un identificatore univoco, che in questo caso è il codice SMILES. C'è un altro flusso di lavoro automatizzato integrato nella Casella degli strumenti QSAR dell'OCSE che può essere applicato in modo simile ed è per la sensibilizzazione della pelle.

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Questo protocollo dimostrerà l'estrazione e l'analisi di acidi grassi bioattivi liberi ed esterificati dalle cellule. Gli acidi grassi sono accuratamente quantificati utilizzando la diluizione degli isotopi stabili, la cromatografia liquida chirale, la cattura di elettroni, la ionizzazione chimica atmosferica, il monitoraggio delle reazioni multiple, la spettrometria di massa (SID-LC-ECAPCI-MRM/MS).

Estrazione dei lipidi cellulari per analisi mirate Stabile diluizione isotopica cromatografia liquida-spettrometria di massa

Scopri la modellazione in silico per la valutazione della tossicità acuta dei disgregatori endocrini nei pesci utilizzando l'OECD QSAR Toolbox. Questo metodo computazionale migliora l'affidabilità delle valutazioni ecotossicologiche.

In Silico Modeling Method for Computational Aquatic Toxicology of Endocrine Disruptors: A Software-Based Approach Using QSAR Toolbox (Video) | JoVE Journal

In Silico Modeling Method for Computational Aquatic Toxicology of Endocrine Disruptors: A Software-Based Approach Using QSAR Toolbox

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