Migliorare l'accuratezza del flusso Valutazione citometrica del potenziale della membrana mitocondriale nelle cellule staminali ematopoietiche e progenitrici attraverso l'inibizione delle pompe di efflusso
30 luglio 2019
Le pompe di efflusso xenobiotico sono altamente attive nelle cellule staminali esemiche e progenitrici (HSPC) e causano l'estrusione di TMRM, una membrana mitocondriale potenziale disfunzione fluorescente. Qui, presentiamo un protocollo per misurare con precisione il potenziale della membrana mitocondriale negli HSPC da TMRM in presenza di Verapamil, un inibitore della pompa di efflusso.
La funzione mitocondriale è fondamentale per l'autori rinnovamento delle cellule staminali ematopoietiche. L'attività mitocondriale è un riflettore del potenziale della membrana mitocondriale interna, che può essere misurato da TMRM, un colorante cationico fluorescente a cellule permeante. Le pompe efflux xenobiotiche sono altamente attive in HSC e causano l'estrusione TMRM.
Il principale vantaggio di questo protocollo, è la correzione di questo effetto, utilizzando Verapamil, un inibitore delle pompe efflux. Inizia isolando il midollo osseo dai femore del topo. Usa un paio di forcep e forbici affilate per tagliare le due zampe posteriori.
Quindi fai un piccolo snip nella pelle ventrale del topo e allungalo. Estrarre il femore e la tibia, facendo attenzione a non spodestiare le teste del femore, e posizionare le ossa in una piastra a sei po ', riempita con 1,5 millilitri di tampone di colorazione. Rimuovere i muscoli dalle ossa e tagliare le estremità delle ossa, permettendo al midollo osseo di uscire.
Posizionare le ossa pulite in nuovi pozzi, con 1,5 millilitri di tampone di colorazione. Quindi, sciacquare il midollo osseo con una siringa da tre millilitri e un ago calibro 25, fino a quando l'osso diventa bianco. Raccogliere tutte le cellule in un tubo da 1,5 millilitri e centrifugarle per cinque minuti a 180 volte G, quindi scartare il supernatante.
Resostigliere con cura il pellet in 300 microlitri di tampone di lisciviamento ACK ghiacciato e mettere le cellule sul ghiaccio per un minuto. Quindi disattivare immediatamente la lisi aggiungendo un millilitro di tampone di colorazione. Centrifugare le cellule per cinque minuti a 180 volte G.Resuspend il pellet cellulare, che dovrebbe apparire bianco, in un millilitro di tampone di colorazione.
Filtrare le celle utilizzando un tappo filtrante cellulare, con una rete di nylon da 35 micrometri, per ottenere cellule mononucleari. Inizia preparando il cocktail di lignaggio e gli anticorpi coniugati al fluoroforo, secondo le indicazioni manoscritte. Tieni gli anticorpi sul ghiaccio e protetti dalla luce.
Quindi, centrifugare il campione per cinque minuti a 180 volte G e scartare il supernatante. Aggiungere 400 microlitri del cocktail di lignaggio e quattro microlitri di anticorpi biotinilati CD135 al pellet cellulare e vortice la miscela. Quindi incubarlo sul ghiaccio per 30 minuti.
Dopo l'incubazione, lavare il campione aggiungendo tre millilitri di tampone di colorazione, facendolo girare per cinque minuti a 180 volte G e scartando il supernatante. Quindi aggiungere 400 microlitri di soluzione anticorpale e vortice la miscela. Incubarlo sul ghiaccio per altri 30 minuti e ripetere il lavaggio con il tampone di colorazione.
Per preparare la soluzione di colorazione TMRM, aggiungere 2,2 microlitri di soluzione di stock TMRM e 1,1 microlitri di Verapamil, a 1,1 millilitri di terreno di coltura ematopoietico privo di siero, con trombopoietina e fattore di cellule staminali. Riprendono il midollo osseo in un millilitro della soluzione di colorazione TMRM, vortice rapidamente e incubare per un'ora a 37 gradi Celsius. Filtrare il campione utilizzando un tappo filtrante cellulare, con una rete di nylon da 35 micrometri, per evitare di intasare il citometro a flusso.
Quindi aggiungere un microlitro di DAPI e procedere con la citometria del flusso. Eseguire il campione di midollo osseo e acquisire almeno un milione di eventi. Quindi mostra le cellule mononucleari del midollo osseo vivo in un grafico per il blu pacifico, per identificare le frazioni lin-negative e lin-positive CD135.
Tracciate la frazione lin-negativa per APC/Cy7 rispetto a PE/Cy7 per identificare il progenitore multipotente o la frazione MPP. Quindi tracciare la frazione MPP per APC rispetto a PerCP/Cy5.5, per identificare la cellula staminale ematopoietica o la frazione HSC. Visualizzate la frazione HSC per FITC, o CD34, per dividerla in frazioni HSC e CD34 positive HSC e CD34 positive di CD34.
Infine acquisire l'intensità TMRM in ogni popolazione. Per assicurarsi che la colorazione TMRM abbia funzionato correttamente, aggiungere un microlitro di FCCP al campione, per una concentrazione finale di un millimolare, e incubarlo a 37 gradi Celsius per cinque minuti. Quindi acquisire un milione di eventi.
Dopo l'aggiunta di FCCP, l'intensità TMRM dovrebbe essere drasticamente aumentata. Questo protocollo è stato utilizzato con successo per quantificare il potenziale della membrana mitocondriale in varie popolazioni cellulari, con colorante TMRM. È stato dimostrato che la presenza di PBS e FBS nel mezzo di coltura influisce sull'intensità del segnale TMRM.
Quindi è importante eseguire la colorazione TMRM in un mezzo di espansione privo di siero. Le cellule staminali ematopoietiche esprimono alti livelli di attività delle pompe efflux xenobiotiche che estrudono il colorante TMRM. Quindi i profili TMRM variano anche in presenza di Verapamil o Cyclosporin H, che bloccano le pompe.
Per verificare l'accuratezza della colorazione TMRM, FCCP può essere quello di depolarizzare i mitocondri e ridurre l'intensità TMRM. Questo protocollo può essere facilmente adattato per lo studio dell'HSC con un diverso colorante potenziale a membrana mitocondriale, tra cui TMRE o JC-1. Così come altri coloranti mitocondriali come MitoTracker o MitoSOX.
Le criticità ereditate dalla diversa attività delle pompe efflux tra la popolazione di midollo osseo sono state evidenziate solo di recente. Questo protocollo mira quindi a ridurre la discrepanza tra i risultati precedenti.
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Panoramica
Questo studio analizza il potenziale della membrana mitocondriale in cellule staminali e progenitrici ematopoietiche (HSPC) utilizzando TMRM, un colorante fluorescente, e l'impatto delle pompe di efflusso xenobiotiche. Viene presentato un protocollo che prevede l'uso di verapamil per misurare con precisione i livelli di TMRM inibendo tali pompe, consentendo una valutazione affidabile della funzione mitocondriale.
Componenti Chiave dello Studio
Ambito di Ricerca
- Dinamica mitocondriale nelle cellule staminali
- Meccanismi di efflusso cellulare
- Misurazione del potenziale di membrana
Sfondo
- Importanza della funzione mitocondriale nel rinnovamento delle cellule staminali
- Sfide poste dalle pompe di efflusso nelle misurazioni con coloranti
- Utilizzo del TMRM come indicatore del potenziale mitocondriale
Metodi Utilizzati
- Isolamento del midollo osseo da topi
- Citometria a flusso per l'analisi delle popolazioni cellulari
- Inibizione delle pompe di efflusso mediante Verapamil
Risultati principali
- Quantificazione riuscita del potenziale della membrana mitocondriale nelle cellule staminali ematopoietiche (HSPCs)
- Effetti dimostrati del Verapamil sul trattenimento di TMRM
- Adattabilità del protocollo a coloranti mitocondriali alternativi
Conclusioni
- Lo studio fornisce un metodo affidabile per valutare l'attività mitocondriale nelle cellule staminali.
- I risultati migliorano la comprensione della biologia delle cellule staminali e degli effetti di agenti farmacologici sulla funzione mitocondriale.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La valutazione accurata del potenziale della membrana mitocondriale nelle cellule staminali ematopoietiche e nelle cellule progenitrici è essenziale per comprendere l'automantenimento delle cellule staminali e la regolazione metabolica. L'attività delle pompe di efflusso in queste cellule può alterare le misurazioni con coloranti fluorescenti, portando a dati distorti che influenzano la validazione degli obiettivi terapeutici e l'affidabilità dei modelli preclinici. Questo protocollo affronta una limitazione tecnica fondamentale nei saggi basati sulla citometria a flusso, migliorando la coerenza dei dati per applicazioni successive di scoperta e traslazionali.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione dell'Obiettivo
- Valore scientifico: Consente l'analisi della funzione mitocondriale come bersaglio terapeutico nelle cellule staminali ematopoietiche, riducendo gli artefatti di misurazione dovuti all'efflusso del colorante.
- Valore operativo: Permette un confronto coerente tra popolazioni di cellule staminali e progenitrici in diversi modelli sperimentali, correggendo la variabilità dei trasportatori xenobiotici.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Prepara sistemi ematopoietici validati per lo screening di composti, assicurando che le letture del potenziale mitocondriale riflettano lo stato biologico reale anziché l'attività di efflusso.
- Valore operativo: Migliora la riproducibilità e la standardizzazione del saggio mediante l'uso di inibitori delle pompe di efflusso come il Verapamil nei protocolli di colorazione.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Facilita la riduzione del rischio meccanicistico fornendo dati affidabili sull'attività mitocondriale correlati ai percorsi di auto-rinnovamento delle cellule staminali.
- Valore operativo: Consente la continuità dalla scoperta alla validazione preclinica standardizzando un parametro funzionale chiave attraverso diversi sistemi modello.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso della scoperta sostenendo la verifica delle ipotesi in biologia delle cellule staminali e permettendo un profilo funzionale affidabile prima degli sforzi di identificazione del capostazione.
- Biologia della Scoperta: Supporta la validazione dei bersagli mitocondriali e la chiarificazione dei percorsi nei sistemi ematopoietici riducendo al minimo i segnali falsamente bassi dovuti all'espulsione del colorante.
- Screening: Fornisce misurazioni quantitative e riproducibili del potenziale mitocondriale quando l'efflusso è inibito, migliorando il rilevamento degli effetti dei composti.
- Analisi: Genera letture basate sulla citometria a flusso (intensità di TMRM) che consentono il confronto tra stati metabolici di diverse frazioni cellulari e condizioni di trattamento.
- Ricerca Translazionale: Si collega ai lavori preclinici fornendo una metrica trasferibile dello stato di salute delle cellule staminali che si correla con esiti funzionali.
- Riutilizzo Aziendale: Stabilisce un flusso di lavoro di citometria a flusso riutilizzabile per la valutazione della salute mitocondriale nei modelli di cellule staminali in diversi progetti.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva negli studi sui meccanismi delle cellule staminali eliminando una fonte importante di variabilità del saggio.
- Valore operativo: Migliora la standardizzazione e la riproducibilità dei saggi mitocondriali nei contesti di ricerca ematopoietica.
- Valore strategico: Favorisce decisioni più accurate di avvio/cessazione nella validazione degli obiettivi riducendo i falsi negativi associati all'efflusso del colorante.
- Impatto sul portafoglio: Consente una priorizzazione adeguata al rischio degli obiettivi delle cellule staminali basata su dati funzionali più accurati.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nell'uso della citometria a flusso, nell'isolamento delle cellule staminali e nella manipolazione di coloranti fluorescenti.
- Dipende dalla disponibilità di Verapamil o di inibitori alternativi delle pompe di efflusso e di tamponi di colorazione compatibili.
- Necessita di una standardizzazione tra i gruppi di lavoro per garantire un tempo e una concentrazione costanti dell'inibitore.
- È necessario considerare gli eventuali effetti collaterali del Verapamil sulla viabilità cellulare o sul metabolismo nelle colture a lungo termine.
- Limitato ad applicazioni in cui il potenziale di membrana mitocondriale rappresenta un parametro funzionale rilevante e l'attività di efflusso è nota per interferire.
