Valutazione della maturità dell'uovo umano e la sua applicazione clinica

Nella pratica clinica, è consuetudine presumere che ogni ovocita che mostra un corpo polare sia pronto per la fecondazione. L'imaging di vita della maturazione degli ovocite umani rivela che un corpo polare diventa visibile ben prima che il mandrino bipolare metafase II sia assemblato, creando il rischio di un'iniezione intempevole di spermatozoi. La microscopia a luce polarizzata consente una visualizzazione non invasiva del mandrino meiotico negli ovociti umani e può essere tranquillamente utilizzata nell'IFV per valutare la maturità dell'uovo prima dell'iniezione intracitoplasmatica dello sperma.

L'ottimizzazione dei tempi dell'ICSI è particolarmente importante in prognosi riservata dei cicli di fecondazione in vitro, con un basso numero di ovociti disponibili per la fecondazione. Questa procedura clinica è una tecnica di aggiunta al trattamento standard di fecondazione in vitro e deve essere preformata da personale esperto, nel rispetto delle buone pratiche di laboratorio. Da 35 a 36 ore dopo l'iniezione di gonadotropina corionica umana, raccogliere i complessi cumulo-ovocici recuperati nel mezzo di manipolazione indipendente dall'anidride carbonica.

Equilibrare gli ovociti per 10-15 minuti in un incubatore indipendente dall'anidride carbonica a 37 gradi Celsius. Esporre gli ovociti a una soluzione ad alta ialuronidasi, diluita nel mezzo di movimentazione. Dopo 30 secondi, utilizzare una pipetta da 200 microliter per rimuovere meccanicamente le cellule cumulo-corona.

Valutare il numero e lo stato di sviluppo degli ovociti denudati in base alla presenza o all'assenza del nucleo e del primo corpo polare. Mettere lo stadio vescicolare germinale e gli ovociti stadio metafase I e metafase II in singole goccioline di mezzo di coltura indipendente dall'anidride carbonica, ricoperte di olio minerale. Quindi, posizionare gli ovociti a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica e 6% di ossigeno con umidità per 3-4 ore.

Per preparare le piastre di coltivazione per la coltura embrionale, aggiungere il volume appropriato di terreno di coltura pre-equilibrato ai singoli pozzi di un piatto di coltura di dimensioni adeguate. Coprire le goccioline con olio minerale equilibrato, etichettare la piastra con un identificatore univoco e posizionarla in un noncubatore dipendente dall'anidride carbonica per almeno 20 minuti. Per preparare il piatto ICSI, aggiungere 5 goccioline di microlitro di mezzo di manipolazione preri riscaldato per ogni ovocita polare che mostra il corpo e una goccia in più per il lavaggio degli aghi a un piatto di plastica pulito.

Aggiungere un'ulteriore goccia di soluzione PVP per l'immobilizzazione dello sperma prima dell'iniezione intracitoplasmatica di spermatozoi e sovrapporre le goccioline con olio minerale pre-riscaldato. Assicurati di etichettare il piatto. Quindi, posizionare il piatto di iniezione dello sperma in un incubatore indipendente dall'anidride carbonica per almeno 20 minuti.

Mentre la piastra è equilibrante, aggiungere 5 goccioline di microliter di mezzo di manipolazione pre-riscaldato per ogni oocita polare che mostra il corpo a un piatto di coltura con fondo di vetro. Sovrapporre tutte le goccioline con olio minerale preri warmed. Assicurati di etichettare il piatto.

Quindi, posizionare la piastra in un incubatore indipendente dall'anidride carbonica per almeno 20 minuti. Mentre le piastre sono equilibranti, accendere lo stadio riscaldato sul microscopio invertito e inserire l'azienda sterile e l'ago per l'iniezione di sperma nei supporti di micro-iniezione. Mettere a fuoco gli aghi e selezionare l'obiettivo appropriato, facendo attenzione che il condensatore si trova nella posizione del campo luminoso.

Inserire il filtro di interferenza verde e impostare il dispositivo di scorrimento dell'analisi del cristallo liquido sulla posizione di lavoro. Impostare l'otturatore su circa il 50% e regolare il polarizzatore circolare per ridurre il rumore di fondo. Per configurare il computer per l'esame della microscopia a luce polarizzata, avviare il software di imaging e selezionare Video, Video Source e polarAIDE nel menu Video.

Quindi, passa al video in diretta andando alla pagina Video e seleziona l'icona per attivare l'analisi del mandrino e della zona. Per determinare la maturità di ogni ovociti, trasferire tutti gli ovociti in singole goccioline sul piatto preparato con fondo di vetro e posizionare il piatto scoperto sotto il microscopio invertito preparato. Mettere a fuoco il primo ovocita e osservare l'immagine di birifrangenza degli ovocite rilevata, poiché viene elaborata al computer e visualizzata in tempo reale sullo schermo del computer.

Utilizzare gli aghi di detenzione e iniezione di sperma per ruotare l'ovocita in modo che il corpo polare sia in posizione a ore 12 e concentrarsi sul corpo polare. Se la birifrangenza del mandrino non è chiaramente visibile a prima vista in prossimità di PB, toccare leggermente la zona pellucida e ruotare delicatamente l'ovocita attorno a ciascun asse per garantire l'allineamento della luce polarizzata con le fibre del mandrino array. Dopo aver identificato tutti gli ovociti positivi al mandrino, trasferire gli ovociti in singole goccioline all'interno del piatto ICSI preparato e sottomettere gli ovociti all'iniezione intracitoplasmatica di spermatozoi secondo protocolli standard.

Se gli ovociti non presentano alcun segnale del mandrino metafase II rilevabile, posizionare il para microscopio a luce polarizzata nell'incubatore indipendente dall'anidride carbonica per 2-3 ore. Prima di riformizzare l'esame della microscopia a luce polarizzata come dimostrato, dopo l'iniezione, trasferire gli ovociti alle piastre di coltivazione dell'embrione preparate per la loro coltura fino al raggiungere lo stadio di blastocista. Fare attenzione a garantire che tutta la micromanipolazione dell'ovocita umana sia effettuata in un ambiente di controllo, a 37 gradi, in un pH medio di coltura ottimale.

L'imaging del mandrino consente la discriminazione degli ovociti completamente maturi arrestati nella fase metafase II, da quelli sottoposti a un'importante transizione maturazionale. Negli ovociti ritardati dallo sviluppo che estrudeno i corpi polari in vitro, l'assenza del segnale del mandrino metafase II potrebbe non riflettere necessariamente un disturbo cellulare, ma potrebbe indicare la progressione dell'ovocita dalla metafase I allo stadio metafase II. La presenza del mandrino meiotico è un marcatore positivo della competenza allo sviluppo delle uova.

Il rinvio dell'ICSI fornisce agli ovociti ritardati allo sviluppo tempi supplementari per completare il processo di maturazione e assemblare il mandrino metafase II prima della loro iniezione. Utilizzando questo approccio, anche gli ovociti immaturi che vengono regolarmente scartati possono essere utilizzati clinicamente e dare origine a gravidanze di successo.