Blocco mirato degli anticorpi da parte di un coniugato dual-funzionale di Peptide antigenico e mimetica Fc-III (DCAF)
17 settembre 2019
Lo sviluppo di un coniugato dual-funzionale di peptidi antigenici e mimetici Fc-III (DCAF) è nuovo per l'eliminazione di anticorpi nocivi. Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per la sintesi della molecola DCAF1, che può bloccare selettivamente l'anticorpo 4G2 per eliminare l'effetto di miglioramento dipendente dagli anticorpi durante l'infezione da virus Dengue.
Questo potrebbe servire a rispondere a domande chiave su come sintetizzare le molecole DCAF con la neutralizzazione degli anticorpi mirati. Questa tecnica fornisce il modo più semplice per sintetizzare le molecole DCAF con un'alta produttività. Il mondo decide che le molecole DCAF hanno i potenziali interventi all'anticorpo in si occupa di malattie come la febbre dengue e la miastenia gravis.
Questo metodo può essere applicato ad altre molecole DCAF con epitopi diversi per colpire gli anticorpi affini. A dimostrare la procedura sarà Xue Bai, un tecnico senior del mio laboratorio. Per convertire la resina 2-cloro in resina di 2 cloro derivata dall'idrazina, dalla parte superiore del contenitore di sintesi peptidica, aggiungere cinque millilitri di DMF agli 0,25 millimoli di resina 2-cloro.
Riposizionare il cappuccio, scuotere delicatamente il recipiente per 15 secondi e quindi scolarlo su un supporto di ferro. Ripetere il lavaggio DMF altre due volte. Quindi aggiungere cinque millilitri di DCM al recipiente, rimettere il cappuccio, scuotere delicatamente il recipiente per 15 secondi e quindi scolarlo su un supporto di ferro.
Ripetere il lavaggio DCM altre due volte, quindi ripetere il lavaggio DMF altre tre volte. Successivamente, aggiungere sei millilitri di concentrazione del 50% in volume di DMF su DCM per gonfiare la resina per 30 minuti e quindi scolarla. Ora trasferisci sei millilitri di concentrazione del 5% di volume di idrazina e DMF sul recipiente di reazione.
Posizionarlo sullo shaker a 120 giri/min e 30 gradi celsius per 30 minuti, quindi scolare la soluzione con pompa per vuoto. Per purificare la derivata idrazina di un peptide Fc-III, utilizzare il sistema HPLC per purificare il peptide con un'eluizione di allusione gradiente di 30 minuti ad una portata di un millilitro al minuto. Dopo la purificazione delle proteine secondo il manoscritto, aggiungere in un nuovo tubo due millilitri di un milligrammo per millilitro proteina taggata SUMO, un millilitro di proteasi SUMO, un millilitro di tampone di proteasi SUMO 10X e sei millilitri di acqua doppia distillata per preparare la soluzione di reazione.
Incubare la miscela per 12-16 ore a quattro gradi Celsius. Quindi aliquotare la miscela in otto tubi Eppendorf da 1,5 millilitri e centrifugare la miscela a 15.000 volte G per 10 minuti a quattro gradi celsius. Utilizzare una pipetta per scartare gli aggregati nella parte inferiore, quindi nei supernaganti cancellati da 10 millilitri, aggiungere 0,5 millilitri del liquame di perline NTA al 50% di nichel in PBS da 50 millimolare.
Posizionare il tubo su uno shaker rotante a 200 giri/min e quattro gradi celsius per mescolare delicatamente per 60 minuti. Quindi, caricare la lisade e la miscela di nichel NTA in una colonna con il tappo di uscita inferiore. Rimuovere il cappuccio inferiore e salvare il flusso attraverso un tubo di centrifuga da 15 millilitri.
La proteina HIS TAG SUMO si lega sulla colonna. La parte antigene del linker, che inizia con la CSI per la reazione di legatura chimica nativa, è nel flusso attraverso. Ora pesa 1,8 milligrammi di derivato dell'idrazina di un peptide Fc-III in un tubo Eppendorf a due millilitri e aggiungi 0,8 millilitri di cloruro di guanidinio molare in soluzione di fosfato monosodico molare a pH 3.
Vortice per sciogliere la polvere. Dopo aver centrifugato il tubo a 7.200 volte G per un minuto a temperatura ambiente, trasferire il supernatante in un nuovo tubo. Aggiungere una barra di agitazione nel tubo e mettere il tubo in un bagno di sale ghiacciato su un agitatore magnetico per agitare delicatamente la soluzione per 15 minuti.
Quindi aggiungere 40 microlitri di nitrito di sodio molare 0,5 alla soluzione per ossidare il gruppo dell'idrazina. Agitare delicatamente la soluzione per altri 15 minuti nel bagno di sale ghiacciato. Pesare 11 milligrammi della parte antigene del linker purificato e liofilizzato HPLC e 13,6 milligrammi di MPAA nel tubo di reazione nel bagno di sale ghiacciato.
Mescolare per cinque minuti e quindi regolare il valore del pH a 6,8 a 7,0 a temperatura ambiente temperata con sei idrossido di sodio molare. Il passo più critico per la legatura chimica nativa è quello di regolare attentamente il valore del pH per avviare la reazione di legatura. Dopo 12 ore nel bagno di sale ghiacciato, aggiungere 0,4 millilitri di soluzione neutra TCEP molare al sistema di reazione e mescolare per 20 minuti per terminare la reazione.
Dopo la centrifugazione e la purificazione HPLC, ottenere il picco coniugato III per la desolforazione. Sciogliere in 50 microlitri di cloruro di guanidinio molare in soluzione di fosfato monosodico molare 0,2. Aggiungere quindi 50 microlitri di un TCEP molare, 10 microlitri di tert-butiltiolo e cinque microlitri di VAO molare 0,1 per quattro soluzioni.
Regolare il pH finale della soluzione a 6,9 e mantenere la soluzione a 37 gradi Celsius su uno shaker per circa cinque ore. Centrifugare e purificare di nuovo. Sciogliere il peptide preparato in 200 microlitri di acetato d'argento millimolare, quindi mescolare la miscela di reazione a temperatura ambiente per quattro ore.
Per convertire i tiolati d'argento sul peptide in tioli liberi, aggiungere tre microlitri di un DTT molare in sei cloruro di guanidinio molare e 0,2 fosfato monosodico molare a pH 7. Aziona lo spettrometro di massa in modalità di scansione completa e imposta l'intervallo m/z da 300 a 2.000 e la risoluzione a 60.000. Aprire i dati degli spettri di massa e trovare i picchi del prodotto in ogni fase per confermare che la reazione chimica viene eseguita con successo.
Per eseguire il test ELISA dell'interazione tra anticorpo DCAF1 e 4G2, rivestire ogni pozzo di una piastra di microtitolo da 96 porri con un picomolo di anticorpo anti-GST in 100 microlitri di tampone di rivestimento. Sigillare la piastra con nastri di tenuta e incubarla a 4 gradi Celsius durante la notte su uno shaker. Al mattino bloccare ogni bene con 200 microlitri di 1%BSA e PBS.
Sigillare il piatto e incubarlo in camera temperata per un'ora su uno shaker. Quindi utilizzare PBS con 0,05%Tween 20 per lavare ogni bene quattro volte. In questo protocollo è stato utilizzato il metodo di legatura chimica nativa per la semisintesi della molecola DCAF1.
Lo spettro di massa mostra che la molecola finale di DCAF1 ha un peso molecolare deconvoluzionale di 11.053. Durante il test ELISA, il peptide antigene Fc-III e DCAF1 inibiscono in modo competitivo il legame anticorpale 4G2. Sia il peptide antigene che il DCAF1 bloccarono significativamente il legame 4G2, mentre il peptite Fc-III non influenzò l'interazione dell'anticorpo antigene.
Dopo questo sviluppo, questa tecnica ha spianato la strada a un intervento di malattie dannose associate agli anticorpi. Molte delle regioni utilizzate per la sintesi peptidica e la legatura chimica nativa sono altamente tossiche. Assicurati di fare questi esperimenti nella tua cappa chimica.
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Panoramica
Questo articolo presenta un protocollo dettagliato per la sintesi di un coniugato bifunzionale di peptide antigenico e mimetici di Fc-III (DCAF1) finalizzato all'eliminazione di anticorpi dannosi. Il metodo si concentra sul blocco selettivo dell'anticorpo 4G2 per mitigare l'effetto di potenziamento dipendente dagli anticorpi durante l'infezione da virus Dengue.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Immunologia
- Chimica biologica
Sfondo
- Le molecole DCAF sono progettate per neutralizzare anticorpi specifici.
- Hanno potenziali applicazioni nel trattamento di malattie come la febbre Dengue e la miastenia grave.
- Il metodo di sintesi mira a un'elevata produttività e semplicità.
- È possibile indirizzare anticorpi cognati con epitopi diversi.
Scopo dello studio
- Sviluppare un protocollo per la sintesi di molecole DCAF.
- Dimostrare l'efficacia del DCAF nel neutralizzare anticorpi dannosi.
- Fornire una base per future ricerche sugli interventi sugli anticorpi.
Metodi Utilizzati
- Conversione della resina 2-cloro in resina 2-cloro derivata dall'idrazina.
- Utilizzo del DMF nel processo di sintesi.
- Dimostrazione passo dopo passo del protocollo di sintesi.
- Applicazione del metodo a diverse molecole DCAF.
Risultati principali
- Il metodo di sintesi è semplice e fornisce un'elevata produttività.
- DCAF1 blocca efficacemente l'anticorpo 4G2.
- La tecnica può essere adattata per altri anticorpi.
- Potenziale per applicazioni più ampie nell'immunoterapia.
Conclusioni
- Le molecole DCAF rappresentano un approccio innovativo alla neutralizzazione degli anticorpi.
- Il metodo può essere utilizzato per diverse interazioni terapeutiche.
- Studi futuri potrebbero ampliare le applicazioni della tecnologia DCAF.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Metodo
La neutralizzazione mirata mediante anticorpi affronta una sfida fondamentale nel trattamento delle malattie associate ad anticorpi, in cui le risposte policlonali limitano la specificità terapeutica. L'approccio DCAF consente un'esaurimento preciso di anticorpi patogeni come il 4G2, riducendo il potenziamento dipendente dagli anticorpi nei modelli di virus Dengue e ripristinando la funzione recettoriale in contesti autoimmuni. Questo approccio supporta la validazione precoce del bersaglio fornendo uno strumento meccanicistico per ridurre i rischi associati a ipotesi terapeutiche che coinvolgono patologie mediate da anticorpi.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Consente l'analisi dei meccanismi dipendenti dagli anticorpi nei modelli di malattia.
- Valore operativo: Fornisce uno strumento molecolare definito per isolare il contributo di autoanticorpi specifici.
- Valore strategico: Supporta le decisioni di avanzamento o interruzione del progetto, validando gli anticorpi bersaglio prima dell'ottimizzazione dei capostipiti, che risulta costosa.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera dati quantificabili di legame mediante ELISA per valutare la potenza inibitoria.
- Valore operativo: Offre un formato riproducibile per misurare il blocco anticorpale in contesti ad alta capacità.
- Valore strategico: Facilita la standardizzazione dei saggi per confrontare i candidati principali mirati a immunoglobuline patogene.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Dimostra il recupero funzionale in modelli pertinenti alla malattia (riduzione dell'ADE da DENV, ripristino dell'attività dei recettori AChR).
- Valore operativo: Utilizza la legatura chimica nativa per produrre coniugati stabili adatti alla caratterizzazione farmacocinetica.
- Valore strategico: Permette la valutazione dell'interazione con il bersaglio e degli effetti fenotipici a valle in vivo.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo di sintesi DCAF si inserisce nei flussi di lavoro delle prime fasi della scoperta, in cui la validazione del target dell'anticorpo precede l'identificazione del capostazione, offrendo un percorso per ridurre meccanicamente i rischi associati ai candidati isolando gli effetti specifici dell'anticorpo.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi consentendo la rimozione selettiva di popolazioni definite di anticorpi per chiarire i meccanismi patogenetici.
- Screening: Fornisce letture quantitative basate su ELISA per valutare l'inibizione degli anticorpi, supportando la riproducibilità del saggio tra diversi gruppi di lavoro.
- Analisi: Produce risultati misurabili (inibizione del legame, conferma del peso molecolare tramite spettrometria di massa) che permettono il confronto tra diversi design dei coniugati.
- Ricerca traslazionale: Collega i dati di legame in vitro a risultati funzionali in modelli preclinici, favorendo un avanzamento proporzionato al rischio.
- Riutilizzo aziendale: La piattaforma di coniugazione basata su NCL è adattabile a diverse sequenze antigeniche, consentendone il riutilizzo in diversi programmi di targeting degli anticorpi.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Riduce l'ambiguità meccanicistica isolando il ruolo di singoli anticorpi all'interno di risposte policlonali complesse.
- Valore operativo: Utilizza una chimica NCL standardizzata con validazione mediante HPLC e spettrometria di massa per una produzione costante dei coniugati.
- Valore strategico: Migliora la fiducia nella selezione dei bersagli, riducendo i fallimenti in fasi avanzate dovuti a effetti mediati da anticorpi non previsti.
- Impatto sul portafoglio: Consente la priorizzazione di terapie basate su bersagli anticorpali validati, migliorando l'efficienza del capitale nei portafogli di scoperta.
Considerazioni relative all'implementazione
- È richiesta esperienza nella sintesi di peptidi, nella legatura chimica nativa e nella purificazione tramite HPLC.
- La strumentazione comprende agitatori, centrifughe, spettrometri di massa e lettori per ELISA dotati di controllo della temperatura.
- La standardizzazione delle condizioni dei tamponi, delle regolazioni del pH e dei tempi di reazione è fondamentale per l'efficienza e la riproducibilità della legatura.
- L'adattamento ad altre molecole DCAF richiede una nuova validazione della solubilità del peptide antigenico e dell'efficienza di accoppiamento.
- La manipolazione di reagenti tossici (cloruro di guanidinio, acetato di argento) richiede l'uso della cappa aspirante e l'applicazione di protocolli di smaltimento dei rifiuti.
Domande frequenti sulla biofarmaceutica
Chapters in this video
0:05
Title
0:57
Chemical Synthesis of the Hydrazine Derivative of a Fc-III Peptide
2:31
Cleavage of the SUMO Tag
4:09
Assembling of DCAF1 by Native Chemical Ligation
7:06
Mass Spectrometry and ELISA Assay
8:19
Results: Native Chemical Ligation and ELISA Assay
9:03
Conclusion
