Metodo di elettroporazione per in vivo Consegna del DNA plasmide nel Telencephalon del pesce zebra adulto
September 13th, 2019
Presentato qui è un metodo di elettroporazione per la consegna di DNA plasmide e l'etichettatura delle cellule ependymoglial nel telecefalo di pesce zebra adulto. Questo protocollo è un metodo rapido ed efficiente per visualizzare e tracciare singole cellule ependymoglial e apre nuove possibilità di applicare l'elettroporazione a un'ampia gamma di manipolazioni genetiche.
Questo protocollo consente l'etichettatura delle singole cellule ependimogliali nel telencefalo zebrafish per consentire il loro monitoraggio a lungo termine, nonché la manipolazione di percorsi specifici in modo autonomo dalle cellule. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente l'etichettatura a singola cellula in modo rapido ed efficiente, così come l'editing genico e la manipolazione del percorso di segnalazione in modo autonomo alle cellule. Questo metodo consente lo studio delle domande di biologia cellulare di base, ad esempio, sulla delaminazione cellulare, sul mantenimento dell'omeostasi epiteliale e sulla simmetria della divisione cellulare.
Iniziare utilizzando un apparato di trazione dell'ago per preparare capillari di vetro. Utilizzare le punte del microloader per riempire un capillare di vetro preparato con dieci microlitri di soluzione plasmide. Quindi premere il menu cambia capillare"sul dispositivo di iniezione per consentire il caricamento dell'ago nel supporto dell'ago.
Quindi passare dal dispositivo di iniezione dal cambio capillare alla modalità di iniezione. Quindi, usando uno stereomicroscopio con un ingrandimento quattro volte superiore e le forcep Finden, tagliano solo la punta del capillare. Quindi applicare pressione sul pedale del piede per confermare che le soluzioni plasmide escono facilmente dall'ago senza impedimenti.
Quando l'ago è pronto, trasferire un zebrafish dal serbatoio di allevamento a un contenitore di soluzione anestetica. E attendere qualche minuto fino a quando il movimento delle branchie si attenua. Premere il lato dorsale del pesce sedato su una spugna pre-bagnata sotto lo stereomicroscopio, e utilizzare un microknife sezionante in acciaio inossidabile con un tagliente di 40 millimetri e uno spessore di 0,5 millimetri per creare con cura un piccolo foro nel cranio del pesce sul lato posteriore del telencefalo, proprio accanto al bordo del tectum ottico.
Inclinare il pesce se necessario e orientare la punta del capillare di vetro verso il cranio nell'angolo corretto per facilitare la penetrazione della punta capillare attraverso il foro. Quindi, inserire con molta attenzione la punta del capillare nel foro attraverso lo strato cellulare ependimale dorsale, fino a raggiungere il ventricolo telencefalico, e applicare pressione sul pedale per circa 10 secondi per fornire circa 1 microlitro della soluzione plasmide. Il successo della consegna può essere confermato osservando la diffusione del liquido verde in tutto il ventricolo.
Coprire il telencefalo di pesce con una piccola quantità di gel ad ultrasuoni. Per l'elettroporazione dell'animale plasmide iniettato, rimuovere la spugna dall'insieme di iniezione e immergere il lato interno degli elettrotipi nel gel ad ultrasuoni. Posizionare la testa del pesce tra gli elettrodi, con l'elettrodo positivo sul lato ventrale della testa e l'elettrodo negativo sul lato dorsale.
Quindi, pur tenendo ancora il corpo del pesce nella spugna, premere gli elettrodi delicatamente e precisamente contro il telencefalo e somministrare la corrente con il pedale del piede, tenendo gli elettrodi in posizione fino al termine di tutti e cinque gli impulsi. Se l'elettroporazione ha successo, le singole cellule ependimogliali etichettate con plasmide possono essere osservate tra le cellule ependimogliali etichettate non plasmide. A seconda dell'efficienza del processo di elettroporazione, può essere etichettato un numero maggiore o inferiore di cellule ependimogliali.
Tuttavia, il protocollo dimostrato produce un numero maggiore di celle etichettate rispetto ai protocolli pubblicati in precedenza. Si noti che la più alta densità di cellule etichettate tende ad emergere principalmente sul lato ventricolare interno di entrambi gli emisferi a causa del modo in cui il liquido plasmide iniettato distribuisce tra gli emisferi. In questo video, un emisfero del telencefalo zebrafish è presentato in 3D, dove le cellule ependimogliali con processi radio, sono in magenta quando osservate di lato.
Attraverso la co-elettroporazione con un altro plasmide che etichetta i nuclei, si può osservare la divisione cellulare delle cellule ependimogliali. L'elettroporazione non riuscita si traduce in un numero molto basso o in nessuna cella ependimogliale etichettata. Le cellule ependimali dorsali, tuttavia, hanno maggiori probabilità di essere etichettate.
Il loro soma è più grande in cuboide e non possiedono processi radio-allungati come evidente da una vista laterale dello strato cellulare ependimogliale. le cellule etichettate tdTomato-mem sono molto probabilmente cellule ependimali, che si trovano sopra lo strato di ependimoglia. Al contrario, l'introduzione di un tdTomato-mem che esprime plasmide alle singole cellule ependmiogliali si traduce in espressione tdTomato-mem oltre all'etichettatura iniziale delle cellule.
Le cose più importanti da ricordare sono tagliare solo la punta del capillare e penetrare nello strato ependimale durante l'iniezione in modo che il liquido si diffonda in tutto il ventricolo. Questa tecnica consente il monitoraggio a lungo termine di singole cellule ependimogliali attraverso l'imaging in vivo, e quindi stabilendo il loro ruolo nella rigenerazione cerebrale e il loro vasto legame genetico in vivo.
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Panoramica
Questo protocollo consente l'etichettatura efficiente di singole cellule ependimogliali nel telencefalo dello zebrafish, facilitando il monitoraggio e la manipolazione a lungo termine di specifici percorsi cellulari. Il metodo migliora la capacità di investigare questioni fondamentali nella biologia cellulare.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienza
- Biologia Cellulare
- Manipolazione Genetica
Sfondo
- Le cellule ependimogliali svolgono un ruolo cruciale nel sistema nervoso centrale.
- Comprenderne la biologia può fornire informazioni sulla neurogenesi e l'omeostasi tissutale.
- L'elettroporazione è una tecnica che può facilitare la consegna genica in tipi cellulari specifici.
- Questo studio si concentra sull'applicazione dell'elettroporazione nello zebrafish per l'etichettatura cellulare.
Obiettivo dello Studio
- Sviluppare un metodo per l'etichettatura di singole cellule ependimogliali.
- Consentire il monitoraggio a lungo termine di queste cellule.
- Manipolare i percorsi di segnalazione in modo cell-autonomous.
Metodi Utilizzati
- Preparazione di capillari di vetro utilizzando un apparecchio per trazione degli aghi.
- Riempimento dei capillari con soluzione plasmidica utilizzando microloader tips.
- Elettroporazione per consegnare il DNA plasmidico nelle cellule bersaglio.
- Monitoraggio delle cellule etichettate nel tempo.
Risultati Principali
- Etichettatura con successo di singole cellule ependimogliali.
- Dimostrazione della capacità di monitoraggio a lungo termine.
- Capacità di manipolare efficacemente specifici percorsi cellulari.
- Informazioni acquisite sulla delaminacióne cellulare e sulla simmetria di divisione.
Conclusioni
- Il metodo di elettroporazione è efficiente per l'etichettatura di singole cellule.
- Questa tecnica apre nuove strade per la manipolazione genetica nello zebrafish.
- Fornisce uno strumento prezioso per studiare la biologia delle cellule ependimogliali.
Domande Frequenti
Executive Industry Relevance
Single-cell electroporation in adult zebrafish telencephalon enables precise genetic manipulation and long-term tracking of neural stem-like cells in vivo. This capability supports mechanistic de-risking and target validation for neurogenesis and regeneration pathways, informing early discovery and translational neuroscience portfolios. The method enhances predictive confidence in cell-autonomous gene function studies relevant to CNS repair and disease modeling.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of gene function in individual neural stem-like cells in a native brain environment.
- Supports mechanistic de-risking by allowing pathway manipulation and observation of cell-autonomous effects.
- Facilitates functional target validation for neurogenesis and regenerative processes.
Screening & Assay Development
- Prepares validated in vivo systems for downstream genetic or pharmacological screening.
- Delivers reproducible, quantitative single-cell labeling for assay standardization.
- Enables scalable evaluation of gene editing or recombination outcomes in neural cell populations.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models for CNS regeneration and neurogenesis studies.
- Provides continuity from discovery-stage genetic manipulation to preclinical validation of neural repair mechanisms.
- Supports risk-adjusted advancement of CNS targets by enabling in vivo functional assessment.
Pipeline & Workflow Integration
This electroporation protocol integrates at the interface of early discovery and preclinical research, bridging target validation with in vivo functional genomics in neural systems.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on gene function and pathway involvement in neural stem-like cells.
- Screening: Provides reproducible single-cell labeling and quantitative readouts for genetic manipulation assays.
- Analytics: Enables measurement of cell division, delamination, and pathway-specific outcomes in vivo.
- Translational Research: Connects genetic manipulation in zebrafish to preclinical models of CNS regeneration.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for in vivo gene delivery and functional studies in neural tissues.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in neural target validation and reduces mechanistic ambiguity in CNS research.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable in vivo gene delivery for neural cell studies.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions for CNS targets and enhances capital efficiency in early-stage neuroscience portfolios.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of neurogenesis and regeneration targets for advancement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish handling, microinjection, and in vivo imaging.
- Needs specialized instrumentation including needle-pulling apparatus, injection device, and electroporation setup.
- Demands cross-team standardization for reproducibility and data comparability.
- Adaptation may be needed for other model systems or cell types.
- Efficiency and cell-type specificity depend on precise technique and anatomical targeting.
