Name: Piattaforma di trapianto di midollo osseo per studiare il ruolo delle cellule dendritiche nella malattia di Graft-versus-Host (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-17T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: Scopri una piattaforma di trapianto di midollo osseo per studiare il ruolo delle cellule dendritiche nella malattia di Graft-versus-Host e nell'effetto Graft-versus-Leukemia. Questo metodo flessibile permette di analizzare anche altre popolazioni di cellule immunitarie.

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Questo studio è supportato dalla sovvenzione per la start-up dell'Università della Florida College of Medicine (a HN), dalla sovvenzione start-up Hillman Cancer Center dell'Università di Pittsburgh Medical Center (a HL), dal NIH Grant #1P20CA210300-01 degli Stati Uniti e dal Ministero vietnamita di Health Grant #4694/QD-BYT (a PTH). Ringraziamo il Dr. Xue-zhong Yu presso la Medical University of South Carolina per aver fornito materiali per lo studio.

Le procedure sperimentali sono state approvate dal Institutional Animal Care and Use Committee dell'Università della Florida centrale.
1. Induzione GVHD
NOTA: Il trapianto di cellule ossee allogeniche (BM) (passaggio 1.2) viene eseguito entro 24 ore dopo l'irradiazione. Tutte le procedure descritte di seguito vengono eseguite in un ambiente sterile. Eseguire la procedura in una cappa di coltura tissutale e utilizzare reagenti filtrati.
<ol><li>Giorno 0: Preparare i mouse destinatari.<ol>
<li>Utilizzare topi di tipo selvaggio femminile (WT) su uno sfondo BALB/c (CD45.2, H2kd,) come destinatari.</li>
		<li>Ear-tag e pesare i destinatari prima di TBI. Quindi, mettere fino a 11 topi nella camera di irradiazione e tenerlo nell'irradiatore. Irradiare ad una singola dose di 700 cGy per 10,15 min.</li>
		<li>Restituire gli animali irradiati alle gabbie e ospitarli in strutture prive di agenti patogeni prima del trapianto. NOTA: Il peso corporeo minimo dei destinatari deve essere di circa 20 g. Utilizzare questo peso come riferimento per calcolare la perdita di peso corporeo durante il periodo sperimentale.</li>
	</ol></li>
	<li>Giorno 1: Preparare il midollo osseo impoverito a cellule T (TCD-BM) dai topi donatori.<ol>
<li>Eutanasia CD45.1/Ly5.1 C57BL/6 topi da CO2 asfissia e attendere 2/3 min fino a quando non sono incoscienti. Eseguire lussazione cervicale come eutanasia secondaria, se necessario.</li>
		<li>Mettere ogni mouse su un tavolo da lavoro pulito. Sanificare la pelliccia e la pelle con il 70% di isopropanolo.</li>
		<li>Raccogliere la tibia e il femore da entrambe le gambe con pinze e forbici. Metteteli in RPMI ghiacciati contenenti 1% FCS e 100 U/mL penicillina/streptomicina e 2 mM L-glutamine (1% RPMI) in tubi conici da 50 mL. Pulire accuratamente il femore e le ossa della tibia rimuovendo tutti i tessuti muscolari utilizzando pinze e forbici. Trasferire il femore e la tibia dai tubi conici da 50 mL a un piatto Petri di 92 mm di diametro contenente 1% RPMI.</li>
		<li>Utilizzando le forbici, tagliare le estremità del femore o tibia. Riempire un tubo da 50 mL con un mezzo 1% RPMI 1640 da 25 mL. Utilizzare questo per riempire una siringa da 3 mL attaccata ad un ago da 26 G con 3 mL di 1% RPMI. Inserire questa siringa nell'osso e spingere lo stantuffo per lavare il midollo osseo (BM) dalla cavità nel tubo di raccolta con 1% RPMI (3 mL/osso).</li>
		<li>Ripetere il passaggio 1.2.4 per tutte le ossa rimanenti della tibia e del femore di altri topi donatori. Tenere tutti i tubi di raccolta sul ghiaccio.</li>
		<li>Effettuare la sospensione a singola cella sciando i pezzi del midollo osseo attraverso un colino a cellule a maglie da 75 m. Raccogliere la sospensione a cella singola in un tubo da 50 mL.</li>
		<li>Centrifuga tubi a 800 x g per 5 min a 4 gradi centigradi. Aspirare e scartare il supernatante. Risospendere il pellet nel buffer PBS contenente lo 0,5% di albumina del siero bovino (BSA) a 20 x 106 celle/mL. Salvare un'aliquota di 2 x 106 celle per la colorazione di purezza.</li>
		<li>Aggiungere il tuo 1 anticorpo a 0,05 g/106 cellule14 e incubare per 30 min a 4 gradi centigradi. Lavare una volta con PBS ghiacciato da 25 mL. Risospendere a 20 x 106/mL in 0.5% BSA/10% complemento coniglio giovane/2% DNase (10,000 U/mL in sterile H2O). Incubare per 45 min a 37 gradi centigradi e lavare 2x come prima. NOTA: le cellule T si esauriscono usando un mAb specifico per Thy1, una proteina espressa da tutte le cellule T, ma non da altri leucociti.</li>
		<li>Risospendere le celle in 20 mL di buffer PBS contenente 0,5% BSA. Contare le cellule del midollo osseo in 1% acido acetico utilizzando un emocitometro. Mantenere un'aliquota di 2 x 106 cellule per un controllo di purezza per citometria di flusso dopo la purificazione cellulare. NOTA: Un topo donatore genera normalmente circa 25 x 106 TCD-BM.</li>
		<li>Utilizzare la citometria a flusso per confermare il successo dell'esaurimento delle cellule T. Macchie 1 x 106 cellule, conservate dai passi 1.2.7 (prima dell'esaurimento delle cellule T) e 1,2,9 (TCD-BM dopo l'esaurimento delle cellule T) con i seguenti anticorpi: s-CD3 (17A2), z-CD4 (GK1.5) e .CD8 (53-6,7).</li>
	</ol></li>
	<li>Giorno 1: Preparare le cellule T dai topi del donatore<ol>
<li>Utilizzare i topi di tipob+ selvatico (WT) CD45.2+ b c57BL/6 come donatori per le cellule T.</li>
		<li>Eutanasia C57BL/6 topi per ansiosa carbonica (CO2)asfissia come descritto nel 1.2.1.</li>
		<li>Pulire accuratamente la pelliccia e la pelle del topo con il 70% di etanolo. Accise milza e linfonodi e li separano in una sospensione a cella singola di splenociti utilizzando uno stantuffo di siringa e ceppi di maglia da 40 m. Lavare lo strainer e lo stantuffo di siringa con 1% RPMI (1% FBS contenente supporti RPMI) per raccogliere tutti gli splenociti.</li>
		<li>Centrifugare la sospensione cellulare a 800 x g per 5 min a 4 gradi centigradi. Aggiungere 5 mL di buffer liscitale ACK (1 mM Na2EDTA, 10 mM KHCO3, 144 mM NH4Cl, pH 7.2) dopo aver scartato il supernatante. Incubare la sospensione cellulare per 5 min a temperatura ambiente. NOTA: ACK lysis buffer viene utilizzato per lising globuli rossi.</li>
		<li>Aggiungere 5 mL di 1% RPMI per arrestare la lisi. Centrifuga a 800 x g per 5 min a 4 gradi centigradi. Scartare il super-attardato.</li>
		<li>Preparare il buffer DI smistamento cellulare attivato a freddo ghiaccio (MACS) (0,5% BSA, 2 mM EDTA in PBS, pH 7.2). Degas il buffer prima dell'uso. Risospendere i pellet cellulari in 5 mL di buffer MACS.</li>
		<li>Contare gli splenociti e controllare le cellule vive e morte utilizzando un emocitometro e 1% trypan blu. Salvare un'aliquota di 2 x 106 cellule per valutare il rendimento della purificazione con l'analisi della citometria di flusso.</li>
		<li>Risospendere gli splenociti alla concentrazione di 200 x 106/mL nel buffer MACS. Aggiungete 0,03 l di biotina anti-mouse-Ter-119, 0,03 - L di biotina anti-topi-CD11b, 0,03 l di biotina anti-topi-CD45R e 0,03 l di biotina anti-topo-DX5 per 106 celle. Incubare per 15 min a 4 gradi centigradi. NOTA: Biotin anti-mouse-Ter-119, biotina anti-mouse-CD11b, biotina anti-mouse-CD45R e biotina anti-mouse-DX5 sono stati utilizzati per reagire rispettivamente con eritroidi, granulociti, cellule B e cellule NK. Pertanto, questi sottoinsiemi di celle si esauriscono nel passaggio15.</li>
		<li>Aggiungere 10 mL di buffer MACS ghiacciato alla sospensione cellulare. Centrifuga a 800 x g per 5 min a 4 gradi centigradi. Scartare il super-attardato.</li>
		<li>Risospendere i pellet cellulari nel buffer MACS a una concentrazione di 100 x 106/mL. Aggiungere microsfere antibiotine (0,22 x/106 cellule) alla sospensione splenocite. Mescolare bene e incubare per altri 15 min a 4 gradi centigradi. Lavare la sospensione cellulare una volta con 10 mL di buffer MACS ghiacciato. Centrifuga a 800 x g per 5 min a 4 gradi centigradi e scartare il super-natante.</li>
		<li>Mettere una colonna di separazione magnetica nel campo magnetico. Risciacquare la colonna con 3 mL di buffer MACS. Rilasciare la sospensione della cella nella colonna. Raccogliere il flusso-attraverso costituito da non legati, celle A T arricchite, in un nuovo tubo conico 15 mL. Lavare la colonna MS con 3 mL di buffer MACS ghiacciato. NOTA: assicurarsi che la colonna sia vuota prima di eseguire le operazioni di lavaggio.</li>
		<li>Centrifugare la sospensione cellulare a 800 x g per 5 min a 4 gradi centigradi. Risospendere il pellet cellulare in 5 mL di buffer MACS.</li>
		<li>Contare le celle in 1% trypan blu utilizzando un emocitometro. Salvare un'aliquota di 2 x 106 celle per un controllo di purezza per citometria di flusso. NOTA: La resa media delle cellule T splenose isolate da questo metodo è di 20-25 USD x10 6 celle per mouse.</li>
		<li>Confermare la resa dell'arricchimento delle cellule T per citometria di flusso. Macchie 1 x 106 cellule, conservate dai passi 1.3.7 (prima dell'esaurimento delle cellule T) e 1.3.13 (TCD-BM dopo l'esaurimento delle cellule T), con i seguenti anticorpi: s-CD3 (17A2), CD4 (GK1.5) e .</li>
	</ol></li>
	<li>Giorno 1: iniettare topi irradiati con panino t-cellule e TCD-BM.<ol>
<li>Lavare le cellule TCD-BM e T 2x con PBS (800 x g per 5 min a 4 gradi centigradi). Risospendere le cellule in PBS ghiacciato per l'iniezione. Regolare la concentrazione cellulare a 20 x 106/mL per TCD BM e 4 x 106/mL per le cellule T.</li>
		<li>Riscaldare l'animale utilizzando una lampada di riscaldamento per aumentare la visibilità delle vene della coda bilaterali. Se necessario, posizionare il mouse in un restrainer.</li>
		<li>Pulire la superficie della coda utilizzando il 70% di isopropanolo. Iniettare Il TCD-BM (5 x 106 cellule/mouse) con o senza cellule T (0,75 x 106 celle/topo). Fare attenzione a non introdurre aria nella siringa.</li>
		<li>Togliere l'ago e applicare un tampone antisettico direttamente al sito di iniezione 5x10 s per fermare qualsiasi sanguinamento.</li>
	</ol></li>
	<li>Valuta GVHD nei giorni 2-80.<ol>
<li>Tieni traccia della sopravvivenza degli animali. Monitorare i segni clinici di GVHD adattati dal sistema di punteggio stabilito in precedenza da Cook et al.16 e il peso corporeo dei topi destinatari 2x a settimana. Utilizzare il peso corporeo determinato prima del TBI per calcolare la perdita di peso corporeo.</li>
		<li>Pesare ogni mouse singolarmente. Segnare la perdita di peso come segue: grado 0 - inferiore al 10%; grado 1 : 10% , 20%; superiore al 20%.</li>
		<li>Segnare il segno di postura dei destinatari: grado 0 - nessuna intuizione; grado 0,5 - lieve intuizione ma si raddrizza quando si cammina; grado 1 - animale rimane curvo quando si cammina; grado 1,5 - l'animale non si raddrizza; grado 2.0 - supporto per animali sulle alture posteriori.</li>
		<li>Punteggio il segno di mobilità dei destinatari: grado 0 - molto attivo; grado 0,5 - più lento di topi ingenui; grado 1.0 - si muove solo quando infilzolato; grado 1,5 - si muove leggermente quando infilò; grado 2.0 - non si muove quando infilpato.</li>
		<li>Segnare la pelle dei destinatari: grado 0 - nessuna abrasione, lesioni o ridimensionamento; grado 0,5 - arrossamento in un'area specifica; grado 1 - abrasione in una zona o abrasione lieve in due aree; grado 1.5 - abrasioni gravi in due o più aree; grado 2.0 - abrasioni gravi, screpolature cutanee, sangue essiccato.</li>
		<li>Segnare la pelliccia dei destinatari: grado 0 - nessun segno anormale; grado 0,5 - ridging sul lato della pancia o della nuca, grado 1.0 - ridging attraverso o il lato della pancia e del collo; - pelliccia arruffata e arruffata di grado 1,5; grado 2.0 - pelliccia mal arruffata sulla pancia e sulla schiena.</li>
		<li>Segnare la diarrea dei destinatari: grado 0 - nessuna diarrea; grado 0,5 - feci leggere e morbide; grado 1.0 - mild (sgabello giallo); grado 1,5 - moderato (sgabello giallo con un po 'di sangue); grado 2 - grave (sgabello giallo chiaro e sanguinante, "sgabelli torta essiccata" appaiono nella zona anale).</li>
	</ol></li>
</ol>2. Modello di cotrapianto
<ol><li>Generare cellule dendritiche derivate dal midollo osseo (BM-DC).<ol>
<li>Isolare il midollo osseo dai femori e dai tibi dei topi WT o del fattore B (fB)-/- sullo sfondo B6, come descritto nei passaggi 1.2.3.2.4. Girare le cellule a 800 x g per 5 min.</li>
		<li>Risospendere il pellet in 5 mL di aCK lysing buffer per lis igloma dei globuli rossi. Incubare la sospensione cellulare per 5 min sul ghiaccio. Aggiungere 10 mL di 1% RPMI alla sospensione cellulare per fermare il lisi e la centrifuga a 800 x g per 5 min a 4 gradi centigradi. Scartare il super-attardato.</li>
		<li>Risospendere i pellet cellulari in 10 mL di mezzi di coltura (RPMI 1460 contenenti 10% FBS, 100 U/mL di penicillina/streptomicina, 2 mM l-glutamina e 50 m-mercaptoethanol) e regolare il volume per soddisfare la concentrazione finale di 2 x 106 cellule/mL.</li>
		<li>Aggiungere 20 fattori di stimolazione della colonia di granulociti-mlsi (GM-CSF) di 20 ng/mL alla sospensione cellulare. Coltura le cellule del midollo osseo in piatti di Petri 100 x 15 mm a 37 gradi centigradi nel 5% di CO2 per 6 giorni.</li>
		<li>Sostituire la metà dei mezzi di coltura in corso (circa 5 mL) con supporti freschi contenenti 40 ng/mL GM-CSF il giorno 3.</li>
		<li>Preriscaldare i mezzi di coltura in un bagno d'acqua a 37 gradi centigradi. Raccogliere circa 5 mL dei media dai piatti di coltura del midollo osseo. Centrifuga a 800 x g per 5 min a 4 gradi centigradi. Scartare il super-attardato. Risospendere il pellet cellulare in supporti di coltura 5 mL contenenti 40 ng/mL GM-CSF.</li>
		<li>Aggiungete ai media 25 lipopolisaccaride (LPS) ai media il giorno 6 della coltura per far maturare i BM-DC.6</li>
		<li>Raccogli i BM-DC maturi: utilizza i sollevatori di celle per raschiare delicatamente i controller di dominio dai piatti Petri. Raccogliere tutte le sospensioni cellulari in tubi conici da 50 mL. Centrifuga a 800 x g, per 5 min a 4 gradi centigradi. Scartare il super-attardato. Lavare i pellet cellulari 3x con 50 mL di PBS ghiacciato. Risparmia circa 2 x 106 BM-DC per l'analisi del fenotipo immunologico per citometria di flusso.</li>
	</ol></li>
	<li>Eseguire il cotrapianto di cellule dendritiche di BMT (DC-cotransplanting BMT). NOTA: Utilizzare i topi FVB (H2kq)come donatori per le cellule T e le cellule BM. Irradiare b6 Ly5.1 topi ricunati a una dose di 1.100 cGy (2 dosi, 3 h intervallo). Vedere i dettagli nel passaggio 1.1.See details in step 1.1.<ol>
<li>Isolare la BM dai femorale e dai tibi dei topi donatori FVB. Vedere i dettagli nei passaggi 1.2.3-1.2.10. NOTA: in questo modello, utilizzare il midollo osseo isolato totale anziché TCD-BM.</li>
		<li>Purificare le cellule T dalle milza e dai linfonodi dei topi donatori FVB. Vedere i dettagli nei passaggi 1.3.1-1.3.13.</li>
		<li>Iniettare BM (5 x 106/mouse), cellule T (0,5 x 106/mouse) con BM-DC (2 x 106/mouse) il giorno 0 del corso sperimentale.</li>
		<li>Il giorno 3 dopo il trapianto, esaminare la ricostituzione del donatore DC per citometria di flusso.<ol>
<li>Raccogliere il sangue dagli occhi dei destinatari.</li>
			<li>Anestesizzare i topi CD45.1/Ly5.1 B6 del 3% per inalazione di isoflurane. Controllare la profondità dell'anestesia per la mancanza di risposta a un pizzico di punta.</li>
			<li>Posizionare un tubo sterile di pipetta di vetro nel canto mediale dell'occhio diretto caudalmente ad un angolo di 30-45 gradi dal piano del naso. Applicare la pressione mentre si ruota delicatamente il tubo.</li>
			<li>Far cadere il sangue in un tubo di microcentrifuga da 1,5 ml contenente 1,5 mL. Trasferire 50 - L di sangue in tubi di flusso di vetro da 5 mL.</li>
			<li>Aggiungere 2 mL di buffer di lising ACK. Incubare a 37 gradi centigradi a bagnomaria per 45 min. Centrifuga a 800 x g per 5 min a 4 gradi centigradi. Scartare il super-attardato.</li>
			<li>Risospendere i pellet cellulari con 200 gradi l di buffer FACS contenenti anticorpi di colorazione del flusso appropriati (live/death yellow, zo-H-2Kb, s-CD45.1, s-CD45.2, s-CD11c e . Incubare per 15 min a 4 gradi centigradi al buio. Lavare 2x con buffer FACS da 1 mL. Risospendere i pellet cellulari in 200 - L di TAC buffer ed eseguire l'analisi per citometria di flusso.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>3. Modelli GVHD/GVL di BMT
<ol><li>Eseguire l'induzione GVHD/GVL.<ol>
<li>Cultura la luciferasi ha trasposto il linfoma a cellule A20 B nei media di coltura RPMI.</li>
		<li>Irradiare BALB/c sfondo WT o Ly5.1 recipiente a 700 cGy (dose singola). Vedere i dettagli nel passaggio 1.1.See details in step 1.1.</li>
		<li>Isolare il TCD-BM dai femore e dai tibie di B6. Ly5.1 Topi donatori. Vedere i dettagli nei passaggi 1.2.1-1.2.10.</li>
		<li>Purificare le cellule T da milza e linfonodi dei topi donatori C57BL/6. Vedere i dettagli nei passaggi 1.3.1-1.3.15.</li>
		<li>Lavare il linfoma A20 2x con 25 mL di PBS. Risospendere i pellet cellulari in 10 mL di PBS ghiacciato. Prendere un'aliquota delle sospensioni cellulari (10 ) e contare le celle utilizzando 1% trypan blu e un emocitometro. Regolare la concentrazione cellulare a 20.000 cellule/mL.</li>
		<li>Iniettare il TCD-BM (5 x 106/mouse) con o senza cellule T (0,75 x 106/mouse) e il linfoma A20 (5.000 cellule/mouse).</li>
		<li>Follow-up sulla sopravvivenza del destinatario, segni clinici GVHD, e perdita di peso corporeo durante il corso sperimentale. Vedere i dettagli nel passaggio 1.5.See details in step 1.5.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Eseguire l'imaging bioluminescente.<ol>
<li>Monitorare la crescita del tumore nel ricevente trapiantato iniettando i topi riceventi con 4 mg di D-lucidferina. Incubare per 5 min per garantire la luciferina reagisce con luciferasi.</li>
		<li>Anestesizzare il topo utilizzando 3% isoflurane nella camera di un imager bioluminescenza e immagine i destinatari per 5 min nel campo D e il tempo di esposizione di 1 min.</li>
		<li>Analizzare i dati utilizzando il software di analisi delle immagini. Modificare la scala delle immagini pseudo-colore per ottenere i migliori risultati. NOTA: tutte le immagini devono essere alla stessa scala tra gli esperimenti.</li>
		<li>Utilizzare il software di analisi delle immagini per determinare le regioni di interesse e quantificare la densità del segnale calcolando il flusso (fotoni/i) emessi da ciascuna regione di interesse.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse.

L'uso di cellule staminali per soddisfare un particolare individuo è un approccio efficace per trattare i tumori avanzati e resistenti18. I prodotti farmaceutici a piccola molecola, tuttavia, sono rimasti a lungo al centro della terapia oncologica personalizzata. D'altra parte, nella terapia cellulare una moltitudine di interazioni tra donatore e ospite può influenzare in modo decisivo gli esiti del trattamento, come lo sviluppo di GVHD dopo BMT1.
<p class="jove_content...

Il trapianto di cellule staminali ematopoietiche allogeneiche (BMT) è una terapia efficace per il trattamento di neoplasie ematologiche1,2 attraverso l'effetto GVL (innesto-contro-leucemia)3. Tuttavia, i linfociti del donatore montano sempre attacchi immunologici indesiderati contro i tessuti ricitati, un processo chiamato malattia innesto-contro-ospite (GVHD)4.
I modelli Murine di GVHD sono uno strumento efficace per studiare la biologia del GVHD e la risposta GVL5. I topi sono un modello animale di ricerca conveniente. Sono piccoli ed efficacemente dosati con molecole e biologici nelle prime fasi dello sviluppo6. I topi sono animali di ricerca ideali per gli studi di manipolazione genetica perché sono geneticamente ben definiti, il che è ideale per studiare percorsi e meccanismi biologici6. Diversi modelli di GVHD non corrispondenti del complesso di istocompatibilità maggiore del mouse (MHC) di GVHD sono stati ben definiti, ad esempio C57BL/6 (H2b) a BALB/c (H2d) e FVB (H2q) : C57BL/6 (H2b)5,7. Questi sono modelli particolarmente preziosi per determinare il ruolo dei singoli tipi di cellule, geni e fattori che influenzano il GVHD. Il trapianto da donatori genitori C57/BL/6 (H2b)a destinatari con mutazioni in MHC I (B6.C-H2bm1) e/o MHC II (B6.C-H2bm12) ha rivelato che un disallineamento sia nella classe MHC I che nella classe II è un requisito importante per lo sviluppo di GVHD acuto. Ciò suggerisce che sia le celluleCD4 e CD8 sono necessarie per lo sviluppo della malattia7,8. GVHD è anche coinvolto in una cascata infiammatoria conosciuta come la 'tempesta di citochine pro-infiammatorie'9. Il metodo di condizionamento più comune nei modelli murini è l'irradiazione totale del corpo (TBI) da raggi X o 137C. Questo porta all'ablazione del midollo osseo del ricevente, permettendo così l'innesto delle cellule staminali del donatore e impedendo il rigetto dell'innesto. Questo viene fatto limitando la proliferazione delle cellule T del ricevente in risposta alle cellule donatrici. Inoltre, le disparità genetiche svolgono un ruolo importante nell'induzione delle malattie, che dipende anche da una mancata corrispondenza di MHC minori10. Pertanto, la dose di irradiazione mieloablativa varia in diversi ceppi di topo (ad es., BALB/c-C57BL/6).
L'attivazione di cellule T donatori da cellule di presentazione dell'antigene host (APC) è essenziale per lo sviluppo di GVHD. Tra gli APC, le cellule dendritiche (DC) sono le più potenti. Sono ereditariamente in grado di indurre GVHD a causa del loro superiore assorbimento di antigeni, espressione di molecole co-stimolanti a cellule T e produzione di citochine pro-infiammatorie che polarizzano le cellule T in sottoinsiemi patogeni. I controller di dominio destinatari sono fondamentali per facilitare l'innesco delle cellule T e l'induzione del GVHD dopo il trapianto11,12. Di conseguenza, DC sono diventati obiettivi interessanti nel trattamento di GVHD12.
La TBI è necessaria per migliorare l'innesto delle cellule del donatore. A causa dell'effetto TBI, i controller di dominio destinatari vengono attivati e sopravvivono per un breve periodo dopo il trapianto12. Nonostante i grandi progressi nell'uso della bioluminescenza o della fluorescenza, stabilire un modello efficace per studiare il ruolo dei controller di dominio destinatari nel GVHD è ancora impegnativo.
Poiché le cellule T donatrici sono la forza motrice per l'attività GVL, strategie di trattamento che utilizzano farmaci immunosoppressivi come gli steroidi per sopprimere l'allreattività delle cellule T spesso causano ricaduta tumorale o infezione13. Pertanto, il targeting dei controller di dominio dei destinatari può fornire un approccio alternativo per trattare il GVHD preservando l'effetto GVL ed evitando l'infezione.
In breve, lo studio attuale fornisce una piattaforma per capire come i diversi tipi di segnalazione nei controller di dominio dei destinatari regolano lo sviluppo di GVHD e l'effetto GVL dopo BMT.

<table><tbody><tr><td>0,5 M EDTA pH 8,0 100ML</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2482100</td><td>tampone MACS</td></tr><tr><td>10X PBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP3994</td><td>tampone MACS</td></tr><tr><td>A20 linfoma a cellule B</td><td>Università della Florida centrale</td><td>Esperimento GVL</td><td>interno</td></tr><tr><td>ACC1 fl/fl</td><td>Jackson Lab</td><td>30954</td><td>Esperimento GVL</td></tr><tr><td>ACC1 fl/fl CD4cre</td><td>Università della Florida centrale</td><td></td><td>Esperimento GVL</td></tr><tr><td>Microsfere anti-biotina</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-485</td><td>Arricchimento di cellule T</td></tr><tr><td>Anti-umano/topo CD45R (B220)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-0452-85</td><td>Arricchimento di cellule T</td></tr><tr><td>Anti-topo B220 FITC</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10452-85</td><td>Analisi di citometria a flusso</td></tr><tr><td>Anti-topo CD11c- AF700</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>117319</td><td>Analisi della citometria a flusso</td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD25 PE</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12-0251-82</td><td>Colorazione a flusso</td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD4 Biotina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-0041-86</td><td>Arricchimento di cellule T</td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD4 eFluor&reg; 450 (Pacific Blue&reg; di ricambio)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>48-0042-82</td><td>Colorazione a flusso</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD45.1 PE</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12-0900-83</td><td>Analisi di citometria a flusso</td></tr><tr><td>Anti-topo CD8a APC</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17-0081-83</td><td>Analisi di citometria a flusso</td></tr><tr><td>Anti-topo H-2Kb PerCP-Fluor 710</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>46-5958-82</td><td>Analisi di citometria a flusso</td></tr><tr><td>Anti-topo MHC Classe II anticorpo APC</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17-5320-82</td><td>Analisi di citometria a flusso</td></tr><tr><td>Anti-Mouse TER-119 Biotina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-5921-85</td><td>Arricchimento di cellule T</td></tr><tr><td>Anti-Thy1.2</td><td>Bio Excel</td><td>BE0066</td><td>BM generazione</td></tr><tr><td>B6 fB-/- topi</td><td>Università della Florida centrale</td><td>Destinatari</td><td></td></tr><tr><td>interni B6. Ly5.1 (CD45.1+)</td><td>topi Charles River</td><td>564</td><td>Donatori</td></tr><tr><td>BALB/c topi</td><td>Charles River</td><td>028</td><td>Riceventi di trapianto</td></tr><tr><td>C57BL/6 topi</td><td>Charles River</td><td>027</td><td>Donatori/riceventi</td></tr><tr><td>CD11b</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-0112-85</td><td>Arricchimento di cellule T</td></tr><tr><td>CD25-biotina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-0251-82</td><td>Arricchimento delle cellule T</td></tr><tr><td>CD45R</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-0452-82</td><td>Arricchimento di cellule T</td></tr><tr><td>CD49b Anticorpo monoclonale (DX5)-biotina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-5971-82</td><td>Arricchimento di cellule</td></tr><tr><td>T Filtro cellulare 40 uM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22363547</td><td>Preparazione cellulare</td></tr><tr><td>Filtro cellulare 70</td><td>uM Thermo Fisher Scientific</td><td>22363548</td><td>Preparazione cellulare</td></tr><tr><td>D-luciferina</td><td>Goldbio</td><td>LUCK-1G</td><td>Imaging di animali vivi</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>Atlanta Bilogicals R& Sistema D</td><td>D17051</td><td>Provette</td></tr> per <tr><td>citometria a flusso</td> per colture cellulari <td>Fisher Scientific</td><td>352008</td><td>Analisi per citometria a flusso</td></tr><tr><td>FVB/NCrl</td><td>Charles River</td><td>207</td><td>Donatori</td></tr><tr><td>Lipopolisaccaride (LPS)</td><td>Millipore Sigma</td><td>L4391-1MG</td><td>Colonna LS matura DC</td></tr><tr><td></td><td>Mitenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td>Preparazione cellulare</td></tr><tr><td>MidiMACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-302</td><td>Arricchimento di cellule T</td></tr><tr><td>Incubatore New Brunswick Galaxy 170R</td><td>Eppendorf</td><td>Galaxy 170 R</td><td>Coltura cellulare</td></tr><tr><td>Penicilina+streptomicinaPenicillina/Streptomicina (10.000 unità di penicillina / 10.000 mg/ml di streptococco)</td><td>GIBCO</td><td>15140</td><td>Media</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Thermo Fisher Scienctific</td><td>11875-093</td><td>Media</td></tr><tr><td>TER119</td><td>Thermo Fisher Scientifico</td><td>13-5921-82</td><td>Arricchimento delle cellule T</td></tr><tr><td>Xenogeno IVIS-200</td><td>Perkin Elmer</td><td>Xenogeno IVIS-200</td><td>Imaging di animali vivi</td></tr><tr><td>X-RAD 320 Irradiatore biologico Raggi</td><td>X di precisione X-RAD</td><td>320</td><td>Irradiazione corporea totale</td></tr></tbody></table>

piattaforma di trapianto di midollo osseo per studiare il ruolo delle cellule dendritiche nella malattia di graft-versus-host

Bone Marrow Transplantation Platform to Investigate the Role of Dendritic Cells in Graft-versus-Host Disease

Il trapianto di midollo osseo allogenico (BMT) è una terapia efficace per le neoplasie ematologiche dovute all'effetto innesto-contro leucemia (GVL) per sradicare i tumori. Tuttavia, la sua applicazione è limitata dallo sviluppo della malattia innesto-contro-ospite (GVHD), una complicazione importante di BMT. Il GVHD viene evocato quando le cellule T negli innesti del donatore riconosconoalloantigeno espresso dalle cellule riceventi e montano attacchi immunologici indesiderati contro i tessuti sani riceventi. Così, le terapie tradizionali sono progettate per sopprimere l'allocazione delle cellule T del donatore. Tuttavia, questi approcci compromettono sostanzialmente l'effetto GVL in modo che la sopravvivenza del destinatario non sia migliorata. Comprendere gli effetti degli approcci terapeutici su BMT, GVL e GVHD, è quindi essenziale. A causa delle capacità di presentazione dell'antigene e di citochina per stimolare le cellule T del donatore, le cellule dendritiche dei donatori (DC) svolgono un ruolo significativo nell'induzione del GVHD. Pertanto, l'indirizzamento dei controller di dominio destinatario diventa un potenziale approccio per il controllo di GVHD. Questo lavoro fornisce una descrizione di una nuova piattaforma BMT per studiare come i DC host regolano le risposte GVH e GVL dopo il trapianto. È inoltre stato presentato un modello BMT efficace per studiare la biologia del GVHD e della GVL dopo il trapianto.

Il principale modello B6 (H2k b)-BALB/C (H2kd) corrispondeva strettamente allo sviluppo del GVHD dopo il trapianto (Figura 2).b Tutti e sei i segni clinici GVHD stabiliti in precedenza da Cooke et al.16 si sono verificati nei destinatari trapiantati con cellule T WT-B6, ma non nei destinatari trapiantati con BM da solo (passaggio 1.5), che rappresentavano il gruppo GVHD-negativo. Ci sono due fasi nello sviluppo GV...

La malattia da innesto contro ospite è una complicazione importante dopo il trapianto di midollo osseo allogenico. Le cellule dendritiche svolgono un ruolo critico nella patogenesi della malattia da trapianto contro ospite. L'articolo attuale descrive una nuova piattaforma di trapianto di midollo osseo per studiare il ruolo delle cellule dendritiche nello sviluppo della malattia da trapianto contro ospite e l'effetto innesto contro leucemia.

Piattaforma di trapianto di midollo osseo per studiare il ruolo delle cellule dendritiche nella malattia di Graft-versus-Host

Allogeneic bone marrow transplantation (BMT) is an effective therapy for hematological malignancies due to the graft-versus-leukemia (GVL) effect to ...

Questo nuovo protocollo di trapianto di midollo osseo può essere utilizzato per indagare come le cellule dendritiche ospiti regolano le risposte di graft-versus-host e graft-versus-leukemia dopo il trapianto. Le rigenerazioni cellulari ex vivo consentono di adattare questo protocollo per testare il ruolo di altre popolazioni di cellule immunitarie come macrofagi e neutrofili semplicemente modificando la condizione di coltura. A dimostrare la procedura con me saranno il direttore di laboratorio Krystal Hossack e il laureato Sanjeev Gurshaney.Per la preparazione del midollo osseo C57BL/6 impoverito con cellule T del donatore, raccogliere il femore e la tibia secondo protocolli standard da topi donatori eutanasiati e trasferire le ossa in una piastra di Petri di 92 millimetri di diametro contenente mezzo 1%RPMI. Utilizzando le forbici, rimuovere le estremità da ogni osso e riempire una siringa da tre millilitri dotata di un ago calibro 26 con mezzo fresco 1%RPMI. Inserire l'ago in un'estremità di un osso e deprimere lo stantuffo per sciacquare il midollo osseo dalla cavità e in un filtro cellulare di raccolta.Una volta raccolto tutto il midollo osseo, filtrare i pezzi di midollo osseo attraverso un filtro a rete da 75 micrometri e trasferire la sospensione a cella singola in un nuovo tubo da 50 millilitri. Sedimentare le cellule mediante centrifugazione e resostigliere il pellet a una concentrazione di 20 volte 10 a sei cellule per millilitro in PBS integrata con lo 0,5% di BSA. Successivamente, aggiungere 0,05 microgrammi di anticorpo THI1 per uno per 10 alle sei cellule per un'incubazione di 30 minuti a quattro gradi Celsius.Al termine dell'incubazione, lavare le cellule due volte con 10 millilitri di PBS ghiacciato e rimescolare il pellet a una concentrazione di due volte 10 fino alle sette cellule per millilitro nello 0,5% di BSA integrato con il 10% di complemento di coniglio giovane e il 2%DNAse in acqua sterile per un'incubazione di 45 minuti a 37 gradi Celsius. Al termine dell'incubazione, lavare le cellule due volte con 15 millilitri di PBS fresco per lavaggio e rimorsi il pellet in 20 millilitri di PBS contenenti 0,5%BSA. Mettere in comune i linfonodi e la milza in un colino poro di 40 micrometri e utilizzare uno stantuffo per siringhe per macerare i tessuti attraverso i filtri per rilasciare le cellule.Lavare il colino e lo stantuffo con mezzo RPMI integrato con 1%FBS per raccogliere tutte le cellule e sedimentare le cellule mediante centrifugazione. Aggiungere cinque millilitri di tampone di lysis ACK al pellet cellulare. Dopo cinque minuti a temperatura ambiente, interrompere la reazione con cinque millilitri di mezzo integrati con 1%FBS e pelletare i globuli bianchi mediante centrifugazione.Resostigliere il pellet in cinque millilitri di tampone MACS per contare e diluire le cellule a una concentrazione di due volte 10 alle otto cellule per millilitro nel tampone MACS fresco. Aggiungere l'appropriata concentrazione di anticorpi anti-eriotiroide, anti-granulocita, anti-B-cell e anti-NK-cell depletion per uno per 10 alle sei cellule per un'incubazione di 15 minuti a quattro gradi Celsius. Al termine dell'incubazione, lavare le cellule con 10 millilitri di tampone MACS ghiacciato e rimorsi il pellet a una volta per 10 alle otto cellule per concentrazione di millilitro nel tampone MACS fresco.Successivamente, aggiungere 0,22 microlitri di MicroBead anti-biotina per uno per 10 alle sei cellule con miscelazione per un'incubazione di 15 minuti a quattro gradi Celsius. Al termine dell'incubazione, lavare le celle con 10 millilitri di tampone MACS ghiacciato e raccogliere le cellule T arricchite non vincolate mediante separazione magnetica delle perline utilizzando il separatore MACSxpress secondo i protocolli standard di isolamento delle perline. Al termine della separazione, sedimentare le cellule T per centrifugazione e rimosogliere il pellet in cinque millilitri di tampone MACS fresco per il conteggio.Per generare cellule dendritiche derivate dal midollo osseo, isolare il midollo osseo dai femore di tipo selvatico o topi knockout di fattore B come dimostrato e lisciviare i globuli rossi in cinque millilitri di tampone di lisi ACK, fermando la reazione con 10 millilitri di RPMI integrati con 1%FBS dopo cinque minuti. Dopo aver raccolto le cellule intere del sangue per centrifugazione, risosorne il pellet in 10 millilitri di coltura medio a due volte 10 alla sesta temperatura per concentrazione di millilitro e aggiungere 20 nanogrammi per millilitro di GM-CSF alle cellule prima di seminare 10 millilitri di cellule su singoli piatti di Petri da 100 per 15 millimetri a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per sei giorni. Il sesto giorno, attivare le colture cellulari dendritiche derivate dal midollo osseo con 25 microgrammi per millilitro di LPS per piastra.Almeno l'85% delle cellule del midollo osseo coltivate si differenziano in cellule dendritiche. La purezza delle cellule T dopo l'arricchimento magnetico delle perline è del 90%Il modello C57BL/6 BALB/c non corrispondente all'MHC maggiore corrisponde strettamente allo sviluppo di GVHD dopo il trapianto. Il picco di gravità si verifica circa 11 giorni dopo il trasferimento cellulare seguito da una riduzione dei punteggi clinici e dal recupero del peso corporeo fino al giorno 16.I destinatari soccombevano uniformemente al GVHD da 30 a 40 giorni dopo il traspianto. È interessante notare che il trapianto con cellule dendritiche knockout di fattore B migliora la sopravvivenza del ricevente e i punteggi clinici GVHD. Il linfoma a cellule B A20 trasdotto in luciferasi consente il monitoraggio della crescita tumorale negli animali vivi.In questo esperimento rappresentativo, tutti i destinatari selvatici balb/c che hanno ricevuto solo midollo osseo più A20 sono morti per una ricaduta tumorale. I riceventi di tipo selvatico BALB/c trapiantati con cellule T del donatore di origine ACC1 derivate dal midollo osseo sono morti di GVHD. Inoltre, gli animali che hanno ricevuto midollo osseo donatore e cellule T impoverite di ACC1 sono morti sia di GVHD che di ricaduta tumorale.Per generare abbastanza cellule del midollo osseo, le ossa di tibia e femore raccolte devono essere completamente libere dal tessuto muscolare prima della correzione del midollo osseo. La purificazione negativa delle cellule del midollo osseo con biotinilasi anti-CD3 e Anti-Biotina MicroBeads può anche essere eseguita per esaurire il linfocita dal midollo osseo.

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Immunologia e Infezioni

Questo documento descrive una semplice tecnica per indurre alloantigen specifiche anergia nelle cellule mononucleari del sangue periferico. La tecnica può essere applicata clinicamente per generare non alloreactive cellule del donatore. L'infusione di queste cellule potrebbero migliorare la ricostituzione immunitario e ridurre la tossicità dopo trapianto allogenico di cellule staminali ematopoietiche.

L&#39;induzione di anergia Alloantigen specifici nelle cellule mononucleari del sangue periferico di stimolazione Alloantigen con co-stimolatorie blocco del segnale

Murine trapianto di midollo osseo è una tecnica ampiamente utilizzata per studiare i meccanismi immunologici che regolano graft-versus-host disease negli esseri umani. La capacità di monitorare il traffico delle cellule T...

Induzione di Graft-versus-host disease e<em&gt; In Vivo</em&gt; T monitoraggio cellulare Utilizzando un MHC-abbinato modello murino

Il trapianto di midollo osseo fornisce un modo per modificare il genotipo delle cellule del midollo osseo derivate. Se il gene di interesse viene espresso in cellule di midollo osseo sia derivati ​​e non le cellule del midollo osseo derivate, trapianto di midollo osseo può modificare le cellule del midollo osseo derivate da un genotipo diverso senza cambiare la non-genotipo delle cellule del midollo osseo derivate.

Differenziare i ruoli funzionali di espressione genica di cellule immunitarie e non immunitarie in Colite mouse da trapianto di midollo osseo

Questo video descrive un protocollo per la generazione di cellule dendritiche - cellule chiave che presentano l'antigene che attivano le cellule T - dal midollo osseo di un topo adulto.

Generazione di cellule dendritiche derivate dal midollo osseo: un metodo per generare cellule dendritiche dal midollo osseo di topo

Questo video dimostra l'induzione della malattia intestinale del trapianto contro l'ospite, GvHD, in un topo ricevente irradiato letalmente utilizzando cellule staminali ematopoietiche allogeniche e linfociti T alloreattivi splenici che inducono GvHD. Questo protocollo aiuta a stabilire un modello di GvHD intestinale acuta grave per comprendere il meccanismo della malattia e sviluppare opzioni terapeutiche innovative.

Induzione della malattia del trapianto contro l'ospite in modelli murini tramite trapianto allogenico di midollo osseo e cellule spleniche

Qui, presentiamo un protocollo per indurre la tolleranza nel trapianto e valutare in vitro e in vivo la capacità soppressiva delle sottopopolazioni cellulari distinti dal destinatario e lo stato immunitario del destinatario verso il donatore o antigeni esogeni.

In Vitro e In Vivo valutazione della attività soppressiva T, B e cellule mieloidi e risposte umorali dai destinatari del trapianto

Qui, presentiamo un protocollo che descrive il trapianto di cellule staminali emopoietiche allogeniche e consente valutazioni ripetitivi mini-endoscopica del colon distale in situ per la presenza, caratteristiche e la severità di infiammazione colica all'interno dal vivo topi affetti da malattia intestinale graft - versus - host.

Induzione di intestinale Graft - versus - host Disease e sua valutazione endoscopica Mini in topi dal vivo

Qui, presentiamo un protocollo per indurre e segnare la malattia in un modello di malattia xenogeneica innesto contro ospite (xenoGVHD). xenoGVHD fornisce un modello in vivo per studiare l'immunosoppressione delle cellule T umane. Inoltre, descriviamo come rilevare le cellule T umane nei tessuti con la PCR digitale come strumento per quantificare l'immunosoppressione.

Induzione e punteggio della malattia di Graft-Versus-Host in un modello di Murine Xenogeneico e quantificazione delle cellule T umane nei tessuti del topo utilizzando pcR digitale

Descriviamo una cellula mononucleare del sangue periferico umano (PBMC), basato sul modello murino xenotrapianto umanizzato per la ricerca sull'immuno-oncologia traslazionale. Questo protocollo potrebbe servire come linea guida generale per stabilire e caratterizzare modelli simili per la valutazione della terapia I-O.

Un ormone e mezzo umano (PBMC) Un modello di Xenotrapianto umanizzato per la ricerca sull'immuno-oncologia traslazionale (I-O)

Descriviamo tre metodi di trapianto di midollo osseo (BMT): BMT con irradiazione totale del corpo, BMT con irradiazione schermata e metodo BMT senza precondi condizionamento (BMT adottivo) per lo studio dell'ematopoiesi clonale nei modelli di topo.

Procedure di trapianto di midollo osseo nei topi per studiare l'ematopoiesi clonale

Qui, presentiamo un metodo economico ed efficiente per isolare e generare cellule dendritiche derivate dal midollo osseo ad alta purezza dai topi dopo 7 giorni di coltura con 10 ng / mL GM-CSF / IL-4.

Protocollo economico ed efficiente per l'isolamento e la coltura di cellule dendritiche derivate dal midollo osseo da topi

Scopri una piattaforma di trapianto di midollo osseo per studiare il ruolo delle cellule dendritiche nella malattia di Graft-versus-Host e nell'effetto Graft-versus-Leukemia. Questo metodo flessibile permette di analizzare anche altre popolazioni di cellule immunitarie.

Piattaforma di trapianto di midollo osseo per studiare il ruolo delle cellule dendritiche nella malattia di Graft-versus-Host

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