Isolamento di Intact EyeBall per ottenere tessuto di superficie oculare integrale per l'esame istologico e l'immunoistochimica
20 ottobre 2019
Questo protocollo descrive un metodo per l'isolamento della bulbo oculare del topo con palpebra, superficie oculare, segmenti anteriori e posteriori in posizione relativamente intatta.
Il nostro laboratorio si concentra sullo sviluppo oculare e sulle malattie. Questo protocollo descrive un metodo per rimuovere il cranio e le ossa orbitali in sequenza dalla testa del topo sezionata. Lasciando palpebre, superficie oculare, lente e retina tutti insieme in un unico pezzo. Il protocollo andrà a beneficio degli oftalmologi interessati alla didattica delle superfici oculari. Sono Dianlel Guo, per raccontare la tecnica con una probabile lotta quando si cerca di evitare il dannoso del bulbo oculare, mentre si sezionano le ossa facciali. Il vantaggio principale di questa materia di dissezione è che l'integrità della lastra epiteliale della superficie oculare è ben conservata e le diverse parti della superficie oculare possono essere esaminate per istologia o immunostaining in un'unica sezione. Assicurati di tagliare tutte le piccole ossa e detriti dai tessuti molli. Motivo, altrimenti causerà segni di cicatrici sulla sezione tissutale. Dopo aver eutanasiato il topo, usa un paio di forbici dritte per tagliare la testa e dividerla in due lungo la linea mediana sagittale a partire dall'osso intrapatrietale rostralmente alla nasale. Posizionare ogni metà della testa divisa in una piastra di Petri pulita e utilizzare forbici affilate per tagliare la mascella e la lingua. Liberare il nervo ottico tagliandolo fuori dal cervello prima della posizione del chiasmo ottico. E rimuovere tutti i tessuti cerebrali, incluso il bulbo olfattivo, che è attaccato alla parete cranica. Ora tutti i tessuti rimanenti avranno tutto il cranio e le ossa orbitali associate al bulbo oculare. Lavare le parti rimanenti con PBS per pulire eventuali detriti di sangue e capelli. Pre-fissare i tessuti posizionandoli in un tubo da 50 millilitri contenente il 4% di paraformaldeide e ruotandoli a temperatura ambiente. Al termine della prefissazione, lavare rapidamente la testa sezionata in PBS tre volte per eliminare ulteriormente i peli rotti e i fissanti. Posizionare il tessuto in una piastra di petri di 10 centimetri e tagliare il cranio in tre parti lungo i piani indicati nella figura uno del protocollo di testo. Il bulbo oculare e la presa sono nascosti nella parte centrale del cranio sotto ossa etmoidi, frontali e mascellari. Utilizzare due paia di forcette dritte numero quattro per staccare l'osso etmoide ed esporre completamente le ossa frontali e mascellari. Quindi, dividere geograficamente la superficie del cranio in quattro aree. Inserire la punta delle forcep curve orizzontalmente in ogni area per rimuovere le ossa mascellari e frontali in sequenza. Dopo questo, le ossa lacrimali e giugali sottostanti saranno esposte. Rimuovere le due ossa e i muscoli e i grassi sottocutanei associati che circondano il bulbo oculare. Tagliare il bulbo oculare con palpebre e pelle attaccate in un piccolo blocco di forma quadrata per ridurre il volume del tessuto e facilitare l'orientamento del tessuto durante l'incorporamento. Riposizionare il bulbo oculare e i tessuti associati in paraformaldeide al 4% e continuare a fissarsi durante la notte alle 4
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Panoramica
Questo protocollo si concentra su un metodo per isolare il bulbo oculare del topo mantenendo intatte la palpebra e la superficie oculare, preservandone l'anatomia per studi anatomici. La tecnica è particolarmente utile per gli oftalmologi interessati all'esame delle superfici oculari senza danneggiare tessuti delicati.
Componenti Chiave dello Studio
Area di Ricerca
- Sviluppo oculare
- Malattie oculari
- Organizzazione tissutale e immunomarcatura
Sfondo
- Importanza del mantenimento dell'integrità della superficie oculare
- Sfide nella dissezione degli occhi di topo senza danni
- Applicazioni per l'educazione oftalmologica
Metodi Utilizzati
- Rimozione sequenziale delle ossa craniche e orbitali
- Modello murino
- Utilizzo di paraformaldeide per la fissazione dei tessuti
Risultati principali
- Il protocollo preserva il foglietto epiteliale della superficie oculare per ulteriori esami
- Permette l'analisi istologica o mediante immunomarcatura
- Illustra tecniche efficaci per la dissezione oculare
Conclusioni
- Lo studio illustra un metodo affidabile per isolare l'occhio del topo con le strutture ad esso collegate
- Di notevole importanza per studi relativi alla salute oculare e alle malattie oculari
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Il mantenimento dell'integrità del foglietto epiteliale della superficie oculare consente la valutazione parallela della congiuntiva palpebrale, della congiuntiva bulbare e dell'epitelio corneale nei modelli di malattia. Questo approccio supporta la riduzione dei rischi meccanicistici permettendo la valutazione simultanea di modifiche patogenetiche in tessuti interconnessi. Migliora la fiducia predittiva negli studi preclinici che richiedono un'architettura tissutale integra per l'analisi istologica e l'immunomarcatura.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche preservando le relazioni spaziali all'interno del foglietto epiteliale della superficie oculare.
- Valore operativo: Facilita la riduzione del rischio biologico mediante la preparazione di tessuti integri per l'esame istologico parallelo dei cambiamenti correlati alla malattia.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Prepara sistemi biologici validati con architettura della superficie oculare preservata per analisi istologiche e immunocitochimiche successive.
- Valore operativo: Favorisce la standardizzazione dei saggi minimizzando la distorsione del tessuto durante la dissezione, migliorando la riproducibilità tra le sezioni.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Mantiene l'integrità del sistema rilevante per la patologia, consentendo l'allineamento traslazionale di biomarcatori attraverso le regioni connesse della superficie oculare.
- Valore operativo: Garantisce la continuità dalla fase di scoperta alla validazione preclinica, preservando la morfologia del tessuto per un taglio e un'analisi costanti.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nei flussi di lavoro della biologia della scoperta consentendo la preparazione di tessuti integri per analisi istologiche e di immunomarcatura che supportano la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi metabolici.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi preservando l'integrità del foglietto epiteliale per l'esame parallelo delle regioni congiuntivale e corneale.
- Screening: Migliora la prontezza del saggio attraverso un isolamento riproducibile del tessuto che riduce la variabilità nel sezionamento istologico.
- Analisi: Consente misurazioni quantitative di variabili dipendenti mediante immunostaining e istologia su sezioni di tessuto integre.
- Ricerca traslazionale: Collega la scoperta alla continuità preclinica mantenendo l'architettura della superficie oculare per una valutazione patologica costante.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una capacità riutilizzabile di preparazione della superficie oculare in diversi modelli di malattia e campagne di screening.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Affidabilità predittiva grazie al mantenimento dell'architettura tissutale, che consente l'analisi contemporanea di più compartimenti della superficie oculare.
- Valore operativo: Standardizzazione e riproducibilità mediante un protocollo di dissezione costante, che riduce al minimo i danni tissutali e gli artefatti di sezionamento.
- Valore strategico: Miglioramento delle decisioni di avanzamento o interruzione dello studio, riducendo l'ambiguità meccanicistica nei modelli di malattie oculari grazie alla valutazione di tessuti integri.
- Impatto sul portafoglio: Prioritizzazione corretta rispetto al rischio, resa possibile da dati istologici e di immunomarcatura affidabili ottenuti da preparazioni integre della superficie oculare.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nelle tecniche di dissezione microchirurgica per evitare danni ai tessuti durante la rimozione dell'osso.
- Si basa sull'uso di forbici affilate e pinzette fini per una separazione precisa delle ossa craniche e orbitali dai tessuti molli.
- Necessita di protocolli standardizzati di fissazione mediante paraformaldeide per mantenere l'integrità del tessuto durante il taglio in sezioni.
- Richiede considerazioni adattative quando applicato a diversi sistemi modello o stadi di sviluppo.
- Limite pratico: l'efficacia della procedura dipende dalla completa rimozione dei detriti ossei per prevenire artefatti durante il sezionamento.
