Un metodo ad alto throughput in Situ per la stima della ploidia nucleare epatica nei topi

Questo metodo consente all'utente di generare un profilo di contenuto di DNA nucleare epatocita da sezioni di tessuto 2D per lo studio dello sviluppo epatico, della rigenerazione e delle malattie croniche. Questo approccio automatizzato ad alta produttività può essere applicato a tutte le sezioni di tessuto epatico 2D, fornendo una lettura calibrata internamente della ploidia nucleare per tutti i semplici nuclei di epatociti circolari. I cambiamenti nella ploidia nucleare epatocita sono associati all'invecchiamento, alle malattie croniche del fegato e al cancro.

Questa tecnica fornisce un mezzo semplice per profilare la ploidia nucleare in campioni di fegato fissi o crioconservati. I metodi di profilazione della ploidia in situ hanno un notevole potenziale come strumenti di ricerca e clinici per tracciare la progressione della malattia epatica in quanto non richiedono la desegregazione dei tessuti o l'accesso a materiale fresco. Dopo aver raccolto il campione di tessuto epatico murino, incorporare il lobulo epatico in un criomold riempito medio di temperatura di taglio ottimale e posizionare immediatamente lo stampo sul ghiaccio secco per garantire un rapido congelamento.

Per ottenere fette del campione di lobulo epatico congelato, sezionare il campione con uno spessore di sei micrometri, posizionando uno scivolo rivestito di poliammide etichettato su ciascun campione per cinque secondi per lasciare che ogni campione si attacchi allo scivolo. Una volta raccolte tutte le fette, lasciare che i campioni equilibrano per tre o cinque minuti a temperatura ambiente prima dell'immunoetichettatura. Al termine dell'equilibrazione, fissare le sezioni tissutali in una cappa aspirante con un millilitro di paraformaldeide al 4% in PBS per 10 minuti a temperatura ambiente.

Al termine della fissazione, sciacquare le diapositive con tre lavaggi di tre minuti in PBS con delicata agitazione. Dopo l'ultimo lavaggio, asciugare l'area intorno a ogni sezione tissutale e utilizzare una penna idrofobica per disegnare un cerchio intorno a ciascun campione. Per permeabilizzare i campioni, trattare le sezioni con un tensioattiva non ionico allo 0,5% in PBS per 15 minuti a temperatura ambiente.

Al termine dell'incubazione, lavare i campioni per tre minuti in PBS due volte con delicata agitazione, come dimostrato prima di bloccare il legame non specifico con una soluzione filtrata di albumen di siero bovino all'1%, siero di cavallo al 5% e tensioattivo non ionico allo 0,2% in PBS per almeno un'ora a temperatura ambiente. Successivamente, incubare le diapositive con l'anticorpo HHF4-alfa diluito nel tampone di blocco durante la notte a quattro gradi Celsius in una camera di colorazione umida protetta dalla luce. La mattina seguente, lavare le diapositive quattro volte in PBS con delicata agitazione prima dell'incubazione con un anticorpo secondario coniugato a fluorescenza appropriato e Hoechst diluito in albume di siero bovino filtrato dell'1% e tensioattivo non ionico dello 0,2% in PBS per due ore a temperatura ambiente in una camera di colorazione umida protetta dalla luce.

Al termine dell'incubazione, lavare gli scivoli quattro volte come dimostrato, seguiti da due lavaggi di tre minuti in acqua doppia distillata con delicata agitazione. Dopo l'ultimo lavaggio, montare i campioni con due gocce di mezzo di montaggio a fluorescenza su un coverslip e applicare una pressione delicata se necessario per eliminare eventuali bolle. Quindi, controllare le diapositive utilizzando un microscopio a fluorescenza convenzionale per garantire una buona fissazione e immunoetichettatura.

Per l'acquisizione di immagini a fluorescenza, impostare i parametri su una piattaforma di imaging ad alto contenuto per acquisire immagini a fluorescenza utilizzando l'eccitazione appropriata per i fluorofori utilizzati. Quindi scansionare i campioni per acquisire immagini sufficienti per ottenere una copertura completa della sezione tissutale. Al termine della scansione, regolare i parametri di segmentazione nucleare del software per garantire che i nuclei siano separati in modo ottimale e modificare l'intensità della soglia per garantire una gating ottimale degli epatociti positivi HNF4-alfa e delle cellule non parenchimali negative HNF4-alfa.

Per la quantificazione nucleare, impostare l'area nucleare in micrometri quadrati in base alla colorazione di Hoechst, alla principale intensità nucleare di Hoechst, al fattore di allungamento nucleare, all'indice di rotondità nucleare media, allo stato HNF4-alfa e alle coordinate nucleari X, Y basate sul centro di gravità. Per eseguire un'analisi dello ploidio nucleare epatocita, prima scaricare e installare il programma di analisi della quantificazione della ploidia. In MATLAB passare alla scheda App della striscia degli strumenti e fare clic su Installa app.

Aprire il programma Ploidy Application ML App Install. Verrà visualizzato un messaggio per confermare l'installazione corretta. In ogni file di analisi dei dati, includere un foglio considerato Cell Measures, contenente tutti i dati necessari per l'analisi delle ploidie indicate nelle colonne come indicato.

Per ogni condizione sperimentale, fornire un set di dati di controllo che verrà utilizzato per calcolare il controllo interno per la calibrazione della ploidia nucleare da due a quattro N. Per le repliche biologiche, archiviare ogni foglio di calcolo nella propria cartella, denominando i prefissi delle cartelle in modo incrementale. Avviare quindi l'applicazione Ploidy.

Verrà visualizzata l'interfaccia utente grafica dell'applicazione Ploidy. Fare clic sul pulsante Percorso per controllare i dati per passare alla cartella in cui risiedono i dati del controllo replicati. Questo percorso dati verrà quindi visualizzato nell'interfaccia.

In Prefisso cartella digitare il nome da assegnare ai file di output. Fare clic sul pulsante Percorso ad altri dati e passare alla cartella in cui risiedono le repliche dei dati comparativi. Questo percorso dati verrà quindi visualizzato nell'interfaccia.

Quindi fare clic su Esegui. Al termine dell'analisi, la barra di stato leggerà Analisi completata. Dopo l'immunoetichettatura, è importante controllare tutte le diapositive mediante microscopia a fluorescenza convenzionale per confermare che è stata ottenuta una fissazione e una colorazione di buona qualità.

Sbavature o sfocatura del colorante Hoechst possono indicare una fissazione inadeguata o una degradazione del campione prima della fissazione. La segregazione nucleare e i parametri di soglia HNF4-alfa devono essere attentamente ottimizzati prima dell'analisi automatica dell'immagine per riflettere ampiamente il modello visivo dell'immunostaining osservato dalla microscopia a fluorescenza. A seguito dell'analisi delle immagini, i dati dovrebbero riflettere il numero crescente di cellule non parenchimali e la piccola, ma significativa, riduzione del numero di nuclei positivi HNF4-alfa all'interno del fegato con lesioni da DDC.

Nei fegati di controllo sani, circa il 63% dei nuclei positivi HNF4-alfa presenta una semplice morfometria circolare. Il confronto della relativa ploidia nucleare tra gruppi trattati con controllo e DDC dovrebbe riflettere una perdita significativa di nuclei epatociti 2C e 4C con lesioni, insieme a un numero maggiore di cellule superiori a 8C. Le informazioni posizionali relative per ogni sottogruppo di ploidia possono essere interrogate recuperando la posizione 2D di particolari sottoinsiemi di epatociti all'interno del software di analisi delle immagini ad alto contenuto.

L'immunoetichettatura con anticorpi aggiuntivi, come Ki-67, può essere eseguita per valutare la replicazione cellulare e i dati della morfometria nucleare epatocita possono essere ulteriormente interrogati per completare l'analisi della ploidia. Il profilo di ploidia a livello tissutale generato da questo metodo descrive il contenuto minimo di DNA per tutti i nuclei epatociti circolari, ma non discrimina tra cellule mononucleari ed epatociti binucleari. Il metodo può potenzialmente essere adattato per tenere conto di parametri come il perimetro cellulare, per facilitare l'identificazione delle cellule binucleari e fornire un'ulteriore lettura della ploidia cellulare.