Name: Profilazione complesso ad alta risoluzione di Cryoslicing BN-MS Analysis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-15T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: Scopri la profilazione del complessoma ad alta risoluzione con la tecnica csBN-MS per l'analisi dei complessi proteici nativi. Questo metodo consente lo studio dettagliato delle proteine di membrana in vari campioni biologici.

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Questo studio è stato sostenuto dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation) – Project-ID 403222702 – SFB 1381 e nell'ambito della strategia di eccellenza tedesca CIBSS - EXC-2189 - Project ID 390939984. Ringraziamo Katja sappe per l'assistenza tecnica.

1. Preparativo BN-PAGE
<ol><li>Preparazione del gel<ol>
<li>Utilizzare un sistema di elettroforesi verticale a gel di formato medio-grande (>10 cm distanza di separazione gel; 14 cm x 11 cm, 1,5 mm distanziatore) con un raffreddamento efficace impostato su 10 .</li>
		<li>Lanciare gel a gradiente poro lineare o iperbolico (1,5-3,0 mm) utilizzando un miscelatore a due camere guidato da una pompa (vedere Tabella dei materiali e reagenti). Nell'esempio presentato (gel a gradiente lineare 1%-13%):<ol>
<li>Preparare una soluzione da 13 mL per la camera anteriore (miscelazione) costituita da: 13% acrilammide (dal 30% di soluzione stock, 37.5:1.0 acrilammide:bisacrilamide), 0.75 M acido aminocaproproico, 50 mM Bis-Tris (pH - 7,0), e 10% gislyol.</li>
			<li>Preparare una soluzione da 10 mL per la camera del serbatoio costituita da: 1% acrilammide (dalla soluzione di magazzino 30%, 37.5.1.0 acrilammide:bisacrilamide), 0,75 M di acido aminocaproproico, 50 mM Bis-Tris (pH - 7,0) e 0,2% CL-47 detergenti.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Avviare lo staffe e aggiungere 30 microlitri di APS (ammonio peroxodisulfate, 10% soluzione stock) e 2,5 L di TEMED (N,N',N'-tetramethyl ethylediamine) e 2,5 microlitri di TEMED alla soluzione nella camera anteriore. Avviare la pompa e aprire la valvola anteriore (il flusso deve essere regolato per completare la colata in 10 min). Dopo 1 min aggiungere 90 l di APS e 5 L di TEMED alla soluzione nella camera del serbatoio e aprire la connessione della camera.</li>
		<li>Lasciare che il gel sia polimerizzato lentamente ma accuratamente per almeno 24 h a temperatura ambiente (RT) per generare un gradiente omogeneo delle dimensioni dei pori. Se mantenuto umido, il gel polimerizzato può essere conservato in posizione verticale a 4 gradi centigradi per un massimo di 1 settimana. NOTA: Intenzionalmente, la parte superiore del gel avrà una consistenza morbida / sottile. Questo sarà successivamente rimosso, ma permette l'ingresso agevole di proteine nel gel, con un rischio minimo di precipitazioni proteiche che altrimenti potrebbero portare a manufatti di migrazione (cioè striature o precipitazioni proteiche).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparazione e caricamento dei campioni<ol>
<li>Preparare gli slot di carico inserendo distanziali appropriati (ad esempio, tubi di silicio) tra le lastre di vetro per separare 0,5-2,0 mg di proteine. Le fessure devono essere fatte ad almeno 3 cm di larghezza (o meglio, 5-6 cm di larghezza).</li>
		<li>Solubilizzare 2,5 mg di membrana (preparazione arricchita endosomico rene di topo) in 2 mL di tampone di solubilità contenente 1% (w/v) detergente non denaturante (ComplexioLyte CL-47) per 30 min sul ghiaccio. Ultracentrifugate (sedimentazione cut-off 200 S o meno; 130.000 x g/11 min viene utilizzato qui).</li>
		<li>Concentrare il solubilisato su un breve 50%/20% (w/v, 0,3 ml ciascuno) sfumatura passo di sucrosi per ultracentrifugazione per 1 h a 400.000 x g. La resa proteica finale dovrebbe essere di almeno 1 mg.</li>
		<li>Aggiungere lo 0,05% (w/v) Coomassie G-250 al solulubile e caricare il campione sul gel. Limitare il carico proteico a una sezione trasversale della corsia di gel 10-15g/mm/mm per ottenere un'alta risoluzione ed evitare manufatti risultanti da precipitazioni proteiche.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Condizioni di funzionamento BN-PAGE<ol>
<li>Per l'esecuzione di buffer, preparare un buffer catodo standard composto da 50 m tricine, 15 mM Bis-Tris e 0.01% Coomassie G-250. Preparare un buffer anodo standard costituito da 50 mM Bis-Tris (pH - 7,0).</li>
		<li>Eseguire un BN-PAGE costruttivo a 10 gradi durante la notte utilizzando un protocollo di tensione in tre fasi13 composto da: una fase di 30 min a 100 V, quindi una rampa lenta (3 h) a tensione massima (lunghezza gel 40-50 V/cm) che viene infine mantenuta per almeno 6 h per l'endpoint che si concentra sulle proteine. NOTA: Si consiglia di mettere in pausa l'elettroforesi quando il fronte migratorio ha raggiunto il centro del gel e scambiare il buffer catodo con buffer fresco senza Coomassie G250. Questo aiuta a evitare artefatti di precipitazioni nel gel risultante dal collasso locale della struttura dei pori della matrice.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Campionamento e digestione di gel
<ol><li>Escissione di corsie gel<ol>
<li>Dopo la corsa, scansionare i gel per scopi di documentazione mantenendoli tra le lastre di vetro.</li>
		<li>Smontare le piastre e accigliare le sezioni di corsia di interesse.</li>
		<li>Prendere una striscia campione della corsia per l'analisi da 2D BN/SDS-PAGE e colorazione proteica o gonfiore occidentale (come mostrato nella Figura 1B) per determinare le regioni di interesse, la risoluzione efficace delle dimensioni complesse e l'abbondanza proteica.</li>
		<li>Fissare due volte le corsie gel selezionate per almeno 30 min con 30% (v/v) di etanolo e 15% (v/v) acido acetico.</li>
		<li>Trasferire il campione al mezzo di incorporamento e lasciarlo in ammollo ed equilibrato per almeno 2 h a 4 gradi centigradi, mantenendo la lastra di gel al rallentatore su uno shaker orbitale. NOTA: La separazione del gel deve essere attentamente ispezionata per la qualità complessiva della separazione e gli artefatti di migrazione. Le bande gel che rappresentano proteine dominanti devono essere prive di distorsione e omogenee in intensità. Gli artefatti locali sul gel devono essere asandati o esclusi dall'analisi.</li>
	</ol></li>
	<li>Incorporamento e taglio criomicrotoma NOTA: Questa è una versione migliorata della procedura di incorporamento descritta e foto documentata in precedenza che consente l'incorporamento e il taglio di corsie gel più ampie fino a 8 cm11.<ol>
<li>In primo luogo, tagliare le corsie gel fisse in sezioni (qui, 3 cm) esattamente parallelamente al modello anteriore/banda di migrazione delle proteine. Per una maneggevolezza più semplice, posizionare ogni sezione su un supporto pellicola di plastica con dimensioni uguali.</li>
		<li>Trasferire le corsie in un tubo aperto con tappi (chiuso sul fondo, centralmente perforato sulla parte superiore, entrambi perfettamente allineati con le estremità superiore e inferiore della sezione gel).</li>
		<li>Immergere brevemente il cilindro in azoto liquido per avviare rapidamente la solidificazione. Il mezzo di incorporamento trasparente si solidifica in pochi secondi e diventa di colore bianco.</li>
		<li>Riempire la cavità con il mezzo di incorporamento, immergerla brevemente in azoto liquido e congelare il cilindro a -20 gradi centigradi per diverse ore. NOTA: Raffreddare rapidamente il cilindro immergendolo in azoto liquido aiuta a evitare lo spostamento della lastra di gel all'interno del tubo. La distorsione deve essere evitata per garantire un'elevata risoluzione nella seguente analisi degli Stati membri.</li>
		<li>Dopo lo smontaggio, rimuovere la pellicola di plastica e trasferire il blocco con la sezione gel incorporato in un cilindro metallico raffreddato, di diametro più grande, posto su un supporto piatto (cioè piatto piatto) e sigillato con supporto di incorporamento all'esterno del cilindro. Riempire il cilindro con il supporto di incorporamento e congelare accuratamente.</li>
		<li>Ripetere questa procedura con l'altro lato del cilindro per ottenere un blocco solido con superfici a planari.</li>
		<li>Rimuovere il blocco dal cilindro, incollarlo con un supporto di incorporamento su un supporto metallico preraffreddato e inserire il supporto nella macchina crioslicing (criotome). La superficie del blocco deve essere accuratamente allineata rispetto al piano di sezionamento. Lasciare eclacazione alla temperatura ottimale per il processo di taglio (qui, -15 gradi centigradi). NOTA: Utilizzare un ciclo di taglio manuale che progredisce lentamente di dimensioni di 0,1 mm fino a colpire la superficie della sezione gel incorporata per garantire il corretto posizionamento.</li>
		<li>Raccogliere le fette di gel una dopo l'altra, con uno spessore finale desiderato di 0,25 mm di dimensione del passo, e trasferirle singolarmente in tubi di reazione con proprietà di legame a bassa proteina. NOTA: In questo set-up, le fette di gel uniformi possono essere facilmente ottenute sottili come 0,1 mm e spesse come 0,5 mm.</li>
	</ol></li>
	<li>Digestione tryptica<ol>
<li>Eseguire la digestione triptica in gel dopo un ampio lavaggio delle fette di gel (si raccomandano almeno tre ulteriori cicli di lavaggio per rimuovere i componenti polimerici del mezzo di incorporamento) seguendo una procedura standard11.</li>
		<li>Peptidi eluiti a spirami e si dissolvono in acido trifluoroacetico dello 0,5% (v/v) scuotendo a 37 gradi centigradi (10 min) seguiti dalla sonicazione del bagno (5 min) e dalla breve centrifugazione.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Spettrometria di massa
<ol><li>nanoHPLC e SM<ol>
<li>Caricare campioni digestione su una precolonna C18 (dimensione delle particelle - 5 m; diametro - 300 m) con 0,05% (v/v) acido trifluoroacetico utilizzando un nano-HPLC (privo di dividendi) accoppiato a uno spettrometro di massa con alta risoluzione.</li>
		<li>Peptidi catturati in eluturo con un gradiente acquoso-organico (eluente A): 5 min 3% B, 120 min dal 3% B al 30% B, 20 min dal 30% B al 99% B, 5 min 99% B, 5 min dal 99% B al 3% B, 15 min 3% B (velocità di flusso - 300 nL/min). NOTA: le fette di gel csBN-MS in genere si traducono in campioni con abbondanza di peptidi da bassa a intermedia e un grado limitato di complessità. L'analisi nanoLC-MS/MS dovrebbe quindi essere eseguita con un set-up che fornisca una ragionevole sensibilità e velocità di sequenziamento, alta risoluzione di massa (>100,000) e un intervallo dinamico massimo (efficacemente 3-4 ordini di grandezza). Tuttavia, non richiede quote di colonna lunghe o gradienti di eluizione estesi oltre 3 h.</li>
		<li>Peptidi eluiti separati in un emettitore (i.d. 75 m; punta 8 m) imballati manualmente circa 20 cm con materiale C18 (dimensione delle particelle - 3 m). Elettrospray i campioni a 2,3 kV (modalità iosone positivo) nel capillare di trasferimento riscaldato (250 gradi centigradi) dello spettrometro di massa.</li>
		<li>Eseguire analisi con le seguenti impostazioni dello strumento11: tempo massimo di iniezione MS/MS - 400 ms; durata dell'esclusione: 60 s; soglia minima del segnale: 5.000 conteggi, primi 10 precursori frammentati; larghezza di isolamento: 1,0 m/z). NOTA: per facilitare la calibrazione della massa, il tempo di conservazione e l'assegnazione dei segnali dei peptidi in un gran numero di set di dati o misurazioni, si consiglia di eseguire le rispettive serie di misurazioni MS senza interruzioni o variazioni nei parametri e nell'hardware ( cioè sulla stessa colonna C18/emitter).</li>
	</ol></li>
	<li>Identificazione delle proteine (dati SM valutati come descritto in precedenza11)<ol>
<li>Estrarre le liste di picco dagli spettri di ioni di frammento utilizzando lo strumento "msconvert.exe" (parte di ProteoWizard).</li>
		<li>Spostare tutti i valori precursori di m/z per ogni set di dati in base all'offset m/z mediano di tutti i peptidi assegnati alle proteine in una ricerca preliminare nel database con tolleranza di massa peptide di 50 ppm.</li>
		<li>Cerca nelle liste di picco corrette con un motore di ricerca adatto (qui, Mascot 2.6.2) su tutte le voci del mouse del database UniProtKB/Swiss-Prot (release 2018_11).</li>
		<li>Selezionare "Acetil (Protein N-term)", "Carbamidomethyl (C)", "Gln piro-Glu (N-termine Q), Glu piro-Glu (N-termine E)", "Ossidazione (M)" e "Propionamide (C)" come modifiche variabili.</li>
		<li>Impostare la tolleranza di massa del peptide e della frammentazione rispettivamente su 5 ppm e 0,8 Da e consentire una cleavage a prova persa. Impostare il valore previsto cut-off per l'identificazione del peptide a 0,5 o meno. Utilizzare una ricerca nel database esca per determinare il tasso di individuazione dei falsi positivi (FDR). Impostare l'FDR su 1% o applicare criteri di qualità aggiuntivi per garantire un'identificazione affidabile. NOTA: L'esperimento presentato ha identificato più di 3.500 proteine, con un Peptide FDR medio di 4,4 x 0,77% (n campioni di 101 fette), o 3.000 proteine quando il peptide FDR è stato impostato sull'1%. È importante sottolineare che sono stati utilizzati criteri più rigorosi per la selezione delle proteine profilate (2.568). Includeva tutte le proteine identificate con almeno due peptidi, almeno uno dei quali è specifico per le proteine, in almeno uno dei 101 campioni di fetta.</li>
	</ol></li>
	<li>Quantificazione delle proteine<ol>
<li>Utilizzare l'intensità del segnale peptide (volumi di picco [PV]) per la quantificazione delle proteine ottenute dalle scansioni complete FT e corrette per i tempi di ritenzione e gli spostamenti di massa utilizzando un software appropriato (qui, MaxQuant v1.6.3).</li>
		<li>Allineare i set di dati MS uno alla volta per fare riferimento (media totale) ai tempi di eluizione dei peptidi utilizzando la regressione LOESS. Assegnare i PV ai peptidi direttamente (identificazione basata su MS/MS) o indirettamente (cioè, in base al loro tempo di corrispondenza m/z e al tempo di eluizione entro tolleranze molto strette). NOTA: Questo protocollo utilizza software interno per l'assegnazione dei peptidi "inseriti". I parametri set generano tolleranze di corrispondenza effettive m/z e tempo di elusione rispettivamente di 2 ppm e 1 min (vedere La Figura 2A,B).</li>
		<li>Corretto per le variazioni sistematiche run-to-run nel carico di peptidi e nell'efficienza di ionizzazione da intensità del peptide riscalare calcolate dalle differenze mediane di intensità relative dei peptidi tra i campioni di fette vicine (Figura 2C).</li>
		<li>Filtrare i dati fotovoltaici per gli outlier e le rimanenti assegnazioni di falsi positivi identificate dall'analisi di coerenza PV interna.</li>
		<li>Normalizza i PV di ogni peptide ai loro valori massimi su tutti i set di dati delle sezioni, producendo profili relativi di abbondanza di peptidi.</li>
		<li>Infine, calcolare i profili relativi di abbondanza proteica come medie di almeno due (e fino a sei o 50%, qualunque valore sia maggiore) dei migliori profili peptidici correlati su una finestra di tre fette consecutive. Ciò consente di colmare i valori fotovoltaici mancanti e di ridurre il rumore. NOTA: Questo ha infine portato a 2.545 (di 2.568 preselezionati) profiliproteici( Figura 2D).</li>
	</ol></li>
	<li>Caratterizzazione dei complessi proteici<ol>
<li>Analizzare i profili delle proteine eseguendo prima il rilevamento dei picchi utilizzando il metodo maxima locale e adattare consecutivamente le distribuzioni normali a questi picchi, producendo la posizione (cioè, indice di sezione o dimensione complessa apparente) del loro massimo e FWHM (larghezza completa a valori di intensità massima (inset della figura 4). NOTA: nel set di dati, i profili vengono analizzati automaticamente utilizzando script personalizzati. I valori FWHM più piccoli sono indicativi della risoluzione effettiva delle dimensioni dell'approccio (qui, 6 x 0,25 x 1,5 mm).</li>
		<li>Utilizzare picchi complessi di proteine di riferimento con massa molecolare definita (come riportato nel database UniProtKB/Swiss-Prot) per l'analisi della regressione lineare dei valori log10(massa molecolare prevista) per convertire gli indici dei numeri di sezione in dimensioni molecolari apparenti (ad esempio, apparente dimensione complessa in kDa). NOTA: in questo studio sono stati selezionati 23 complessi di marcatori nel campione (Figura 4) sulla base di forme (i) monodisperse di picchi di profilo, (ii) supporto sperimentale dei pesi molecolari e (iii) distribuzioni lungo le sezioni del gel BN-PAGE studiate.</li>
	</ol></li>
</ol>

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<li>Kristensen, A. R., Gsponer, J., Forster, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+approach+for+measuring+temporal+changes+in+the+interactome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A high-throughput approach for measuring temporal changes in the interactome.</a> Nature Methods. 9 (9), 907-919 (2012).</li>
</ol>

L'autore Uwe Schulte è un dipendente e azionista di Logopharm GmbH che produce ComplexioLyte 47 utilizzato in questo studio. L'azienda fornisce reagenti ComplexioLyte alle istituzioni accademiche senza scopo di lucro.

Lo studio presentato si è basato sulla tecnica csBN-MS precedentemente confrontata con una preparazione mitocondriale11 e ha incorporato miglioramenti nella preparazione dei campioni, nell'elaborazione dei gel e nella valutazione dei dati MS. L'analisi mirata di una sezione del gel BN-PAGE di separazione su larga scala ha fornito una serie completa di dati che mostrano misure di qualità paragonabili allo studio con membrane mitocondriali. Gli errori relativi ai tempi di massa e di ritenzione e le variazioni run-to-run sono stati mantenuti molto bassi e hanno fornito la base per determinare profili affidabili di abbondanza di proteine. La risoluzione delle dimensioni sembrava essere buona, con larghezze di picco semimassime a partire da sei fette (corrispondenti a 1,5 mm, Figura 4) e differenze di dimensioni relative inferiori al 10% risolte (Figura 3, Figura 5A). Questi valori non soddisfacevano pienamente la qualità di risoluzione delle dimensioni della precedente analisi csBN-MS dei mitocondri (nonostante la dimensione del passo di campionamento del gel più piccola scelta), ma sono significativamente migliori rispetto alle prestazioni del BN-MS convenzionale o della SM di esclusione delle dimensioni si avvicinaa 20 che sono recentemente diventati popolari.
L'importanza di un'elevata risoluzione di dimensioni complesse effettive è sottolineata dall'esperimento di simulazione nella figura 3 (utilizzando i complessi associati a TPC1) che difficilmente possono essere risolti dall'analisi della macchia occidentale 2D BN/SDS-PAGE (Figura 1B). Questi risultati suggeriscono che il taglio di 0,25 mm in questo caso ha provocato un sovracampionamento, ma questo si è comunque rivelato utile per l'eliminazione del "rumore di quantificazione" senza compromettere la risoluzione effettiva delle dimensioni. Pertanto, in linea con i risultati precedenti11, è generalmente consigliata una dimensione del passaggio di campionamento di 0,3 mm.
In particolare, la discriminazione dei complessi associati a TPC1 è completamente persa con il campionamento di gel di 1 mm, che è la più piccola dimensione del passo fornita dal taglio manuale nel convenzionale BN-MS5,6. Questo può spiegare il fatto che, nonostante le potenti tecnologie MS disponibili, pochissimi complessi proteici e sottounità sono stati identificati de novo mediante profilazione di complexome. Oltre alla buona potenza di risoluzione, csBN-MS offre un'elevata versatilità. Complessi legati alla membrana e complessi proteici solubili che vanno da 50 kDa a diversi MDa possono essere efficacemente risolti in un unico esperimento con la distorsione minima11. Ciò contrasta con le tecniche di separazione alternative utilizzate per la profilazione di complessioma come l'esclusione delle dimensioni o la cromatografia dello scambio di ioni, che operano con sottoinsiemi di proteine solubili con determinate gamme di dimensioni o proprietà di carica. Al rovescio della medaglia, csBN-MS è meno scalabile (carico massimo di 3 mg di proteine per gel), può essere tecnicamente impegnativo, e non può essere automatizzato.
Nel complesso, i risultati dimostrano che la profilatura complessoma basata su csBN-MS può essere applicata con successo a obiettivi non mitocondriali, ma indicano anche alcune sfide associate. Pertanto, l'estrazione efficiente e la stabilità biochimica dei complessi proteici richiedono una maggiore ottimizzazione e fasi di pulizia e possono ancora essere limitate. All'interno della finestra delle dimensioni studiata, il numero di complessi proteici monodispersi (dati non mostrati) ben focalizzati era notevolmente inferiore (dati non mostrati) rispetto a un campione mitocondriale. Si raccomanda inoltre di ridurre i carichi di campioni di BN-PAGE per ottenere una separazione accettabile del gel. Carichi più elevati possono richiedere corsie gel più ampie che sono più difficili da elaborare correttamente per affettare (vedi video di accompagnamento). Inoltre, la complessità proteica dei campioni era maggiore (circa due volte) rispetto ai digest a fette derivate dai mitocondri, portando a più valori fotovoltaici mancanti e a una gamma dinamica ridotta. Infatti, alcune piccole proteine che dovrebbero far parte dei complessi illustrati nella Figura 5 mancavano nelle analisi. Questi problemi possono essere risolti in futuro utilizzando strumenti MS più veloci e sensibili o modalità di acquisizione indipendenti dai dati.
La preparazione del campione è altamente fondamentale per il recupero complesso proteico, la stabilità e la qualità della separazione del gel. I parametri e le procedure devono essere ottimizzati per ogni tessuto di origine, lisato cellulare, membrana (frazione) e complesso proteico di interesse. Vengono fornite le seguenti raccomandazioni generali che possono aiutare a estendere le applicazioni di csBN-MS:
(i) Preparare campioni freschi ed evitare il riscaldamento/congelamento, forti diluizioni, cambiamenti nelle condizioni del buffer e ritardi inutili;
(ii) Utilizzando tamponi essenzialmente privi di sali (sostituire con 500-750 mm di betaina o acido aminocaproico), circa un pH neutro e contenente fino all'1% (w/v) di detergenti non denatura (proteina:detergent ratio tra 1:4-1:10 per la solubilizzazione della membrana complessi proteici, nessun detersivo necessario per i complessi proteici solubili);
(iii) Test accurati e regolazione delle condizioni detergenti mediante BN-PAGE analitico, poiché queste possono avere un forte impatto sull'efficienza della solubilità complessa, la rappresentazione dei complessi proteici della membrana nel campione, la stabilità e l'omogeneità le micelle proteiche detergenti. Questi ultimi sono prerequisiti per la messa a fuoco delle proteine come bande distinte/popolazioni complesse su gel BN-PAGE. La letteratura precedente offre un'ampia gamma di detergenti neutri. Tuttavia, il DDM (n-dodecyl z-d-maltoside)1,2,4,5,6 e digitonin3,5,7,8, 9,10,13,18 sono state le scelte più popolari per le analisi BN-MS finora. Va sottolineato che qualsiasi condizione detergente rappresenta necessariamente un compromesso tra l'efficienza di solubilizzazione e la conservazione delle interazioni proteiche e potrebbe non essere ugualmente adatta a tutti i tipi di proteine e materiali di origine target;
(iv) Rimozione di polimeri carichi come fibrille, filamenti, polisina, DNA e abbondanti componenti di peso molecolare inferiore (ad esempio, metaboliti, lipidi o peptidi). Questo può essere realizzato da ultracentrifugazione, filtrazione gel, o dialisi. Ciò è particolarmente importante per le lismi totali delle cellule o dei tessuti;
(v) Aggiunta di Coomassie G-250 (concentrazione finale 0,05%-0,1%) e saccarosio (per aumentare la densità per il carico, concentrazione finale 10%-20% [w/v]) al campione appena prima del caricamento, per cancellare con una breve ultracentrifugazione, caricare il campione senza perturbazione, e avviare la corsa immediatamente dopo.
Come prospettiva futura, la profilazione complessa basata su csBN-MS offre opzioni per il multiplexing per studiare le dinamiche complesse di proteine o i cambiamenti relativi a specifiche condizioni biologiche. La combinazione combinata di campioni con etichetta metabolicamente come proposto per la profilatura basata sull'esclusione delle dimensioni21 appare semplice, ma può essere ostacolata dallo scambio spontaneo di sottounità in complessi che si verificano indipendentemente dalla separazione utilizzata metodo. In alternativa, i campioni etichettati possono essere risolti nelle corsie di gel vicine, che possono quindi essere co-fette o combinate post-digestione per l'analisi differenziale con elevata sensibilità e robustezza.

La separazione BN-PAGE è stata prima accoppiata direttamente all'analisi LC-MS (BN-MS) dai gruppi di ricerca Majeran1 e Wessels2 utilizzando il taglio manuale delle corsie di gel BN-PAGE. Le loro analisi hanno identificato una serie di abbondanti complessi proteici di membrana con composizione nota di sottounità da plastidi vegetali e mitocondri cellulari HEK, rispettivamente. Tuttavia, queste analisi erano tutt'altro che complete e non consentivano l'identificazione imparziale di nuove assemblee. Da allora, le prestazioni degli spettrometri di massa e dei metodi di quantificazione senza etichette sono notevolmente migliorate, il che ha permesso analisi BN-MS complete. Questo ha coniato il termine "profilazione complesso". Ad esempio, Heide e colleghi hanno analizzato i mitocondri cardiaci del ratto identificando e raggruppando 464 proteine mitocondriali, confermando così molti gruppi noti. Inoltre, hanno trovato TMEM126B una nuova e cruciale sottounità di un complesso di assemblaggio specifico3. Risultati comparabili (con 437 profili di proteine mitocondriali) sono stati ottenuti in uno studio parallelo dei mitocondri a cellule HEK4.
Nonostante questi miglioramenti, sono rimasti diversi problemi che limitano il pieno potenziale di BN-MS per la profilazione complesso. Una delle principali limitazioni è l'effettiva risoluzione delle dimensioni dei complessi che è determinata da due fattori: la qualità (i) della separazione BN-PAGE, che dipende dall'uniformità del gradiente dei pori a matrice di gel, nonché dalla stabilità/solubilità dei complessi campione, e (ii) dimensione del passaggio del campionamento del gel, che è al massimo 1 mm quando si utilizza il taglio manuale convenzionale5,6. La scarsa risoluzione delle dimensioni non solo manca di sottili isoforme complesse ed eterogeneità, ma influisce anche negativamente sulla gamma dinamica e sulla fiducia dell'assegnazione e della quantificazione di sottounità imparziali e de novo.
Altre sfide includono la precisione della quantificazione delle proteine e la copertura dell'effettiva gamma dinamica di abbondanza di proteine nel campione mediante analisi spettrometrica di massa. Pertanto, l'applicazione della profilazione del complesso BN-MS è rimasta in gran parte limitata a campioni biologici con minore complessità, alta espressione dei complessi bersaglio e proprietà di solubilizzazione favorevoli (ad esempio, plastidi, mitocondri e microrganismi)6,7,8,9,10.
Recentemente abbiamo introdotto IL criomicrotome BN-MS (csBN-MS), che combina un preciso campionamento sub-millimetrico di corsie gel BN-PAGE con un'analisi completa della Ms e un'elaborata elaborazione dei dati MS per la determinazione dei profili proteici con fiducia11. L'applicazione di una preparazione della membrana mitocondriale da cervelli di ratto ha dimostrato una risoluzione effettiva delle dimensioni complesse in precedenza non soddisfatta e la massima copertura delle sottounità complesse della catena respiratoria ossidativa (OXPHOS) (cioè 90 di 90 MS accessibili). Questo esempio ha anche identificato una serie di nuovi gruppi proteici.
Di seguito sono descritte le procedure ottimizzate per la separazione BN-PAGE su scala punziose dei complessi proteici (non limitati a una particolare fonte biologica), la colata di grandi gel BN-PAGE preparativi, la suddivisione criomicrotomi di ampie corsie di gel e i dati MS processo. Le prestazioni della profilazione ad alta risoluzione sono dimostrate per una preparazione complessa proteica dalle membrane arricchite con endosomi rene di topo. Infine, vengono discussi i vantaggi derivanti dall'aumento della risoluzione e della precisione della quantificazione spettrometrica di massa.

<table><tbody><tr><td>Soluzione di acrilammide/Bis al 30%, 37,5:1</td><td>Bio Rad</td><td>#1610158</td><td>Consigliato per soluzioni di gel a gradiente di acrilammide fino al 13%</td></tr><tr><td>30% di soluzione di acrilammide/bis, 19:1</td><td>Bio Rad</td><td>#1610154</td><td>Consigliato per soluzioni di gel a gradiente di acrilammide >13%</td></tr><tr><td>SYPRO Ruby Protein Blot Stain</td><td>Bio Rad</td><td>#1703127</td><td>Colorazione proteica totale su membrane blot; sensibile e compatibile con l'immunorilevazione</td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue G-250</td><td>Serva</td><td>n. 35050</td><td>Centrifugare le soluzioni madre prima dell'uso</td></tr><tr><td>ComplexioLyte 47</td><td>Logopharm</td><td>CL-47-01</td><td>Tampone detergente pronto all'uso (1%) per una lieve solubilizzazione delle proteine di membrana</td></tr><tr><td>Terreno di inclusione / Terreno di congelamento dei tessuti</td><td>Leica Biosystems</td><td>14020108926</td><td>Terreno di inclusione per sezioni di gel da affettare con un crio-microtomo</td></tr><tr><td>Membrana Immobilon-P, PVDF, 0,45 &; m</td><td>Merck</td><td>IPVH00010</td><td></td></tr><tr><td>ECL Prime Western Blotting Detection Reagent</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN2232</td><td></td></tr><tr><td>Siringa in plastica con tappo in gomma, 20-30 ml</td><td>n.a.n.a.any</td><td></td> <td>fornitore, importante per la realizzazione di gel sezione di inclusione</td></tr><tr><td>strumento lama di rasoio larga</td><td>n.a.n.a.any</td><td></td> <td>fornitore, per BN-PAGE rifilatura gel / escissione di corsie</td></tr><tr><td>tubo / cilindro metallico, circa 4 cm </td><td>n.a.n.a.mold</td> <td>lungo per l'inclusione e il congelamento di campioni di gel</td><td></td></tr> <tr><td>Provette Protein LoBind, 1,5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>Nr. 0030108116</td><td>altamente raccomandato per ridurre al minimo la perdita di proteine/peptidi grazie alla</td></tr><tr><td>tripsina modificata di grado di sequenziamento</td> dell'assorbimento <td>Promega</td><td>V5111</td><td></td></tr><tr><td>C18 PepMap100 precolonna, dimensione delle particelle 5 e micro; m</td><td>Dionex / Thermo Scientific</td><td>P/N 160454</td><td></td></tr><tr><td>Emettitore PicoTip (i.d. 75 &; micro; m; punta 8 &micro; m)</td><td>Nuovo obiettivo</td><td>FS360-75-8</td><td></td></tr><tr><td>ReproSil-Pur 120 ODS-3 (C18, 3 &micro; m)</td><td>Dr. Maisch GmbH</td><td>r13.93.</td><td>colonne impacchettate manualmente</td></tr><tr><td>coniglio anticorpo anti-TPC1</td><td>Gramsch Laboratories</td><td>produzione personalizzata</td><td>descritta in Castonguay, et al., 2017 (Riferimento 12)</td></tr><tr><td>Cy3-biotinilato capra anti-coniglio IgG</td><td>Vector Laboratories</td><td>CY-1300</td><td>descritto in Castonguay, et al., 2017 (Riferimento 12)</td></tr><tr><td>lectina biotinilata Lotus tetragonolobus, FITC-coniugato</td><td>Vector Laboratories</td><td>#B1325</td><td>descritto in Castonguay, et al., 2017 ( Riferimento 12)</td></tr><tr><td>crio-microtomo Leica CM1950</td><td>Leica Biosystems</td><td>14047743905</td><td></td></tr><tr><td>Mini Protean II Cell con unità wetblot</td><td>Bio Rad</td><td>n.a.</td> <td>per SDS-PAGE e Westernblot (non più venduto)</td></tr><tr><td>Penguin Midi Gel Electrophoresis System</td><td>PeqLab</td><td>n.a.</td> <td>per BN-PAGE (non più venduto)</td></tr><tr><td>Microscopio Zeiss Axiovert 200 M + Fotometria Fotocamera digitale Coolsnap 2</td><td>Zeiss / Fotometrica</td><td>n.a.</td><td></td></tr> <tr><td>pompa peristaltica (IP multicanale ad alta precisione)</td><td>Ismatec</td><td>ISM940</td><td>per colata di gel di poliacrilammide a gradiente miscelatore</td></tr><tr><td>a gradiente con agitazione (due camere)</td><td>autocostruito, in alternativa Bio Rad</td><td>1652000 o 1652001</td><td>per colata di gel di poliacrilammide a gradiente, il manuale fornisce le istruzioni per la colata di gel a gradiente lineare o iperbolico (http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/M1652000.pdf)</td></tr><tr><td>ultracentrifuga Sorvall M120 con rotore S80 AT3</td><td>Sorvall / Thermo Scientific</td><td>n.a.per</td> <td>la preparazione del campione (non più venduto)</td></tr><tr><td>UltiMate 3000 RSLCnano HPLC</td><td>Dionex / Thermo Scientific</td><td>ULTIM3000RSLCNANO</td><td></td></tr><tr><td>Spettrometro di massa Orbitrap Elite</td><td>Thermo Scientific</td><td>IQLAAEGAAPFADBMAZQ</td><td></td></tr></tbody></table>

profilazione complesso ad alta risoluzione di cryoslicing bn-ms analysis

High-Resolution Complexome Profiling by Cryoslicing BN-MS Analysis

Le proteine generalmente esercitano funzioni biologiche attraverso interazioni con altre proteine, sia in gruppi proteici dinamici che come parte di complessi formati stabilmente. Quest'ultimo può essere elegantemente risolto in base alle dimensioni molecolari utilizzando l'elettroforesi gel poliacrilamide nativo (BN-PAGE). L'accoppiamento di tali separazioni alla spettrometria di massa sensibile (BN-MS) è stato ben consolidato e teoricamente consente una valutazione esaustiva del complesso estraibile in campioni biologici. Tuttavia, questo approccio è piuttosto laborioso e fornisce una risoluzione e una sensibilità limitate e complesse. Inoltre, la sua applicazione è rimasta limitata ad abbondanti proteine mitocondriali e plastidi. Pertanto, per la maggior parte delle proteine, mancano ancora informazioni sull'integrazione in complessi proteici stabili. Presentato qui è un approccio ottimizzato per la profilazione complessoma che comprende la separazione BN-PAGE in scala puntuale, il campionamento sub-millimetrico di ampie corsie gel mediante affettare il criomicrotomi e l'analisi spettrometrica di massa con quantificazione delle proteine prive di etichette. Le procedure e gli strumenti per i passaggi critici sono descritti in dettaglio. Come applicazione, il rapporto descrive l'analisi complessoma di una frazione di membrana soluttivo arricchita da reni di topo, con 2.545 proteine profilate in totale. I risultati dimostrano l'identificazione di proteine della membrana uniformi e a bassa abbondanza, come i canali ionici intracellulari, nonché modelli di assemblaggio di proteine complessi e ad alta risoluzione, comprese le isoforme della glicosilazione. I risultati sono in accordo con analisi biochimiche indipendenti. In sintesi, questa metodologia consente un'identificazione completa e imparziale delle proteine (super)complessi e della loro composizione di sottounità, fornendo una base per studiare la stoichiometria, l'assemblaggio e la dinamica di interazione dei complessi proteici in qualsiasi sistema biologico.

Per la profilazione complesso ad alta risoluzione viene presentato un versatile protocollo BN-MS crioscillante utilizzando un microtoma.

Profilazione complesso ad alta risoluzione di Cryoslicing BN-MS Analysis

Proteins generally exert biological functions through interactions with other proteins, either in dynamic protein assemblies or as a part of stably formed ...

L'obiettivo centrale per lo sviluppo della tecnica csBN-MS era ottenere un accesso completo all'organizzazione e all'assemblaggio di complessi proteici che sono alla base della trasduzione del segnale su e attraverso la membrana plasmatica di vari tipi di tessuti e organi. csBN-MS offre attualmente la massima versatilità di risoluzione per l'analisi del complesso proteico nativo e della loro composizione di subunità, in particolare per quanto riguarda le proteine di membrana. Sebbene la tecnica csBN-MS sia stata sviluppata per analizzare miscele complesse di gruppi proteici di membrana nel cervello dei roditori, può essere facilmente adattata all'analisi di qualsiasi tipo di campione biologico.Uno dei passaggi chiave del nostro metodo è l'incorporamento del pezzo di gel e il suo corretto allineamento al piano di taglio prima dell'affettamento. Fare attenzione a non strappare o comprimere il gel e assicurarsi che non sia inclinato sul piano di taglio poiché ciò ridurrebbe la risoluzione dell'analisi. La nostra tecnica csBN-MS ha diversi passaggi pratici che sono cruciali per buoni risultati.È più facile mostrare come eseguire questi passaggi in dettaglio piuttosto che semplicemente descriverli. Per iniziare questa procedura utilizzare un miscelatore di gradiente a due camere agitato guidato da una pompa per lanciare un gel gradiente lineare o iperbolico dei pori. Preparare soluzioni per la camera di miscelazione anteriore e la camera del serbatoio come delineato nel protocollo di testo.Avviare l'agitatore e aggiungere 30 microlitri di APS e 2,5 microlitri di TEMED alla soluzione nella camera frontale. Quindi, avviare la pompa e aprire la valvola anteriore. Dopo circa un minuto, aggiungere 90 microlitri di APS e cinque microlitri di TEMED alla camera del serbatoio e aprire la connessione della camera.Lasciare che il gel polimerizzi lentamente e accuratamente per almeno 24 ore a temperatura ambiente per generare un gradiente omogeneo delle dimensioni dei pori. Se mantenuto umido, il gel polimerizzato può essere conservato in posizione verticale a quattro gradi Celsius per un massimo di una settimana. Successivamente, preparare le fessure di carico inserendo gli spazi appropriati tra le piastre di vetro per separare tra 0,5 e 2,0 milligrammi di proteine.Le fessure dovrebbero essere larghe almeno tre centimetri. Per l'esecuzione di tamponi, preparare un tampone catodo permanente composto da 50 millimolare tricina, 50 millimolare Bis-Tris e 0,01%Coomassie G-250. Preparare un tampone anodo standard composto da Bis-Tris da 50 millimolare.Solubilizzare circa 2,5 milligrammi di membrana e due millilitri di tampone di solubilizzazione contenenti 1% di detersivo non denaturante sul ghiaccio per 30 minuti. Quindi ultracentrifugo a 130.000 volte G per 11 minuti. Concentrare il solubilisato su un breve gradiente di gradino di saccarosio del 50%20% mediante ultracentrifugazione a 400.000 volte G per un'ora.Successivamente, raccogliere il gradiente di saccarosio dal fondo del tubo, aggiungere lo 0,05%Coomassie G-250 al solubilisato e caricare il campione sul gel. Eseguire un BN-PAGE preparatore a 10 gradi Celsius durante la notte utilizzando un protocollo di tensione in tre step, come delineato nel protocollo di testo. Dopo che il gel è stato eseguito, scansionare i gel a scopo di documentazione mantenendoli tra le lastre di vetro.Ispezionare la qualità della separazione del gel. Quindi, disperi le targhe e accisa i tratti di corsia di interesse. Fissare le corsie due volte con il 30% di etanolo e il 15% di acido acetico per almeno 30 minuti.Trasferire il campione di mezzo di incorporamento e permettergli di immergersi ed equilibrare per almeno due ore mantenendo la lastra di gel al rallentatore su uno shaker orbitale. Quindi, tagliare le corsie di gel fisse in sezioni esattamente parallele al fronte di migrazione proteica o al modello di banda. Posizionare ogni sezione su un supporto per pellicole di plastica con dimensioni uguali per una manipolazione più semplice.Trasferire le corsie in un tubo aperto con tappi chiusi sul fondo e perforati centralmente sulla parte superiore, entrambi allineati con precisione con le estremità superiore e inferiore della sezione gel. Immergere brevemente il cilindro nell'azoto liquido per avviare rapidamente la solidificazione. Il supporto di incorporamento trasparente si solidifica in pochi secondi e diventa di colore bianco.Riempire la cavità con il mezzo di incorporamento, immergere brevemente il cilindro in azoto liquido e quindi lasciarlo congelare accuratamente a meno 20 gradi Celsius per diverse ore. Dopo lo smontaggio, rimuovere la pellicola di plastica e trasferire il blocco con la sezione di gel incorporata in un cilindro metallico raffreddato. Il cilindro ha un diametro maggiore e sigillato all'esterno con mezzo di incorporamento.È posto su un supporto piatto. Riempire il cilindro con un supporto di incorporamento e congelare accuratamente come accennato in precedenza. Ripetete questa procedura con l'altro lato del cilindro per ottenere un blocco solido con una superficie inferiore complanare.Quindi, rimuovere il blocco dal cilindro e utilizzare il mezzo di incorporamento per incollarlo a un supporto metallico pre-raffreddato. Inserire il supporto metallico nella criosciettatrice. Il supporto deve essere accuratamente allineato rispetto al piano di affezione.Lasciare che il blocco equilibra alla temperatura ottimale per il processo di affezione. Dopo questo raccolto il gel taglia uno dopo l'altro con uno spessore finale desiderato di 0,25 millimetri e li trasferisce singolarmente in tubi di reazione con basse proprietà di legame proteico. Quindi, le fette vengono sottoposte a digestione triptica e analisi spettrometrica di massa.Questo protocollo estende l'applicazione della profilazione del complexoma ad alta risoluzione alle membrane non mitocondriali che esprimono proteine a bassa abbondanza. La separazione complessa mostra bande proteiche fortemente macchiate con pochissimi artefatti di migrazione. Le deviazioni dei segnali peptidici in massa e nel tempo di ritenzione indicano un tasso molto basso per l'assegnazione del volume di picco falso positivo.Le varianti run-to-run vengono facilmente eliminate ridimensionando i set di dati del volume di picco. Le informazioni sull'intensità peptidica risultanti vengono quindi utilizzate per ricostruire 2545 profili proteici di abbondanza relativa. La pertinenza della dimensione del passo di campionamento del gel per la risoluzione dei complessi proteici è stata valutata unendo set di dati di fette adiacenti.A 0,25 millimetri, la separazione delle dimensioni delle popolazioni complesse associate al TPC1 è ben in accordo con i risultati dell'analisi western blot. L'adesione di più di due fette abolisce la discriminazione delle sottopopolazioni complesse di TPC1. Infine, l'analisi fornisce informazioni su complessi ben caratterizzati e dimostra l'esistenza di nuove subunità e assiemi complessi.Per la ferritina, i profili delle subunità regolati per la loro abbondanza relativa suggeriscono l'esistenza di almeno tre isoforme complesse con distinte stechiometrie a catena pesante/leggera. Al contrario, i complessi nicalin-nomo1, il complesso del nucleo gamma-secretasi e i macchinari GPI-transamidasi mostrano rapporti di abbondanza fissi delle loro subunità principali nell'intera gamma di dimensioni e indipendenti dall'associazione con proteine aggiuntive. Il parametro chiave dell'analisi csBN-MS è la risoluzione efficace dei complessi, che è determinata dalla biochimica del campione, dalla qualità del gel BN, dal corretto allineamento durante l'incorporamento e l'affettamento e dalla qualità dei dati MS acquisiti.La pettinatura del csBN-MS con l'etichettatura isotopica di proteine e campioni consentirà il confronto diretto di complessi in diversi stati fisiopatologici, biologici o dello sviluppo. csBN-MS eseguito su membrane dal cervello dei roditori ha rivelato l'enorme diversità di recettori, canali ionici e trasportatori rispetto alla loro composizione di subunità e alla loro funzione, e sarà strumentale per analizzare la struttura 3D nei preparati nativi.

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