Immunoglobulin G N-Glycan Analisi di Ultra-Performance Liquid Chromatoography

La cromatografia liquida ad alte prestazioni è una tecnologia consolidata per un'analisi accurata dell'IgG n-glicina A causa della sua sensibilità sembra essere e ha la capacità di fornire una specifica informazione di glico Questo metodo è facile da usare e ha un numero di diversi costi relativamente bassi di incrementi, alta riproducibilità La capacità di glicerinare isomeri. Le misurazioni delle proteine nel plasma potrebbero essere interessanti. in medicina.

associato anche all'IgG in base al glicosio e tale e biologico contenente la popolazione. Sai che dello stato impuro viene usato per testare l'IgG nei glicani. In realtà, può testare n-glicani di proteine.

Questo è necessario in una proteina cross-bound di due stati puri può essere applicato alla proteina Il processo sperimentale OR è relativamente semplice mentre il processo sperimentale deve essere standardizzato. Il processo sperimentale end-to-end richiede tre giorni per funzionare e le fasi sperimentali devono essere memorizzate per padroneggiare le abilità sperimentali. Per preparare i campioni, scongelare il campione di plasma congelato.

Quindi, centrifugare a 80 volte G per 10 minuti. Lasciare la piastra monolitica proteinA G a temperatura ambiente per 30 minuti. Trasferire 100 micrometri di campione in ogni pozzo della piastra di raccolta a due millilitri.

Aggiungere acqua ultra pura come un campione di controllo. Diluire i campioni con un X PBS da uno a sette volume per volume. Pulire una piastra filtrante in polipropolene idrofilo da 0,45 micron con 200 microlitri di acqua ultra pura.

Ripetere la pulizia altre due volte. Trasferire i campioni diluiti nella piastra filtrante e filtrare i campioni nella piastra collettiva utilizzando una pompa per vuoto con pressione da 266,6 a 399,9 Pascal. Per preparare le placche monolitiche proteina G, prima scartare il tampone di stoccaggio.

Pulire le piastre monolitiche con due millilitri di acqua ultra pura, due millilitri di un X PBS, un millilitro di acido formico molare 0,17, due millilitri di 10 X PBS e due millilitri di un X PBS in sequenza. Rimuovere il seguente liquido utilizzando una pompa per vuoto. Utilizzando una pipetta multicanale, trasferire i campioni filtrati nella piastra monolitica proteina G per legare e pulire IgG.

Quindi, aggiungere due millilitri di un X PBS per pulire le piastre monolitiche. Rimuovere il PBS utilizzando una pompa per vuoto e ripetere la pulizia due volte in più. Illute IgG con un millilitro di acido formico molare 0,17 e filtrare i campioni nella piastra di raccolta mediante pompa per vuoto.

Quindi, aggiungere 170 microlitri di un bicarbonato di ammonio molare nella piastra di raccolta. Rilevare la concentrazione IgG utilizzando uno spettrotropetometro di assorbimento alla lunghezza d'onda ottimale di 280 nanometri. Posizionare l'IgG estratto in un forno per asciugare a 60 gradi Celsius per tre ore.

Determinare la quantità da osservare in base alla sua concentrazione descritta nel manoscritto e conservarla in meno 80 gradi Celsius. Raccogliere l'IgG essiccato e conservare prodotti chimici tra cui 1,33%SDS, 4% IgePal e 5%PBS a temperatura ambiente. Preparare l'enzima indoglycosidasi F diluire 250 unità di enzima con 250 microlitri di acqua ultra pura.

Per denaturare l'IgG, aggiungere 30 microlitri di 1,33%SDS e mescolare con il vortice. Trasferire il campione in un forno a 65 gradi Celsius per 10 minuti. Quindi, rimuoverlo dal forno e lasciarlo raffreddare per 15 minuti.

Aggiungere 10 microlitri di IgePal al quattro% nello stesso campione e posizionarlo su un'incubatrice di scuotimento per cinque minuti. Aggiungere 20 microlitri di cinque X PBS e da 30 a 35 microlitri di idrossido di sodio molare 0,1 per regolare il pH a 8,0 e mescolare mediante vortice. Aggiungere quattro microlitri di enzima endoglicosidasi F e mescolare con il vortice.

Quindi, incubare per 18-20 ore in un bagno d'acqua di 37 gradi Celsius. Il giorno dopo, mettere i ginecani rilasciati in un forno a 60 gradi Celsius per asciugare per due ore e mezza o tre ore. Salvare i glicani di rilascio a meno 80 gradi Celsius fino a ulteriori misurazioni.

Preparare i due reagenti per l'etichettatura dell'ammino benzimide con 24,5 microlitri di DMSO, 10,5 microlitri di acido acetico, 0,7 milligrammi di due ammino benzimide e sei milligrammi di cianoboroidro di sodio. Successivamente, in una stanza buia, etichettare i glicani aggiungendo 35 microlitri di due ammino benzimide che etichettano il reagente. Trasferire i glcan etichettati su un oscillatore per cinque minuti, quindi trasferirli al forno per tre ore a 65 gradi Celsius.

Successivamente, trasferirlo a temperatura ambiente per 30 minuti. L'IgG n-glicasi, lo etichettamo per essere rilevato dal rilevamento fluorescente dello stato impuro. Pretrattare una piastra filtrante GHP da 0,2 micron con 200 microlitri di etanolo al 70%, 200 microlitri di acqua ultra pura e 200 microlitri di nitrile di aceto al 96% a quattro gradi Celsius.

Quindi, rimuovere i rifiuti utilizzando una pompa per vuoto. Per purificare i due glicani etichettati come ammino benzimide, aggiungere 700 microlitridi di acetonitrile al 100% al campione e trasferirlo in un'incubatrice di scuotimento per cinque minuti. Centrifuga a 134 volte G per cinque minuti a quattro gradi Celsius.

Trasferire il supernatante su una piastra filtrante GHP da 0,2 micron per due minuti e rimuovere il filtrato utilizzando il vuoto. Lavare i due amino benzimidi etichettati glicina con 200 microlitridi del 96% di acetonitrile a quattro gradi Celsius e rimuovere il filtrato utilizzando una pompa per vuoto da cinque a sei volte. Male due ammino benzimide etichettati glicina con 100 microlitri di acqua ultra pura tre volte.

Trasferire i due amino benzimide etichettati glicina in un forno per asciugare a 60 gradi Celsius per tre ore e mezza. Salvare gli n-glicani etichettati a meno 80 gradi Celsius fino a ulteriore misurazione. In primo luogo, aprire il software per controllare le fasi mobili.

Lavare gli strumenti UPLC con 50%solvente B e 50% solvente C alla portata di 0,2 millilitri al minuto per 30 minuti. Quindi lavare con il 25% solvente A e il 75% solvente B ad una portata di 0,2 millilitri al minuto per 20 minuti. Quindi, aggiungere una portata di 0,4 millilitri al minuto.

Sciogliere gli n-glicani etichettati con 25 microlitri di una miscela di acetonitrile al 100% e acqua ultra pura con un rapporto volume/volume due a uno. Quindi, centrifugare a 134 volte G per cinque minuti a quattro gradi Celsius e utilizzare un tubo asciutto per caricare 10 microlitri del supernatente negli strumenti UPLC. Separare gli n-glicani etichettati alla portata di 0,4 millilitri al minuto con un gradiente lineare dal 75% al 62% di acetonitrile per 25 minuti.

Quindi, eseguire un'analisi eseguita dalla colonna glicopeptide della scala di calibrazione Dexteran su un UPLC a 60 gradi Celsius. Rileva fluorescenti n-glicane rispettivamente a X citando e lunghezze d'onda di emissione di 330 nanometri e 420 nanometri. Come mostrato in questa figura, i n-glicani IgG sono stati analizzati in 24 picchi di glicina IgG iniziali in base alla posizione di picco e al tempo di ritenzione.

Le strutture n-glicane sono disponibili in 24 tipi attraverso il rilevamento della spettrometria di massa. Per valutare la ripetibilità e la stabilità del metodo, il campione standard è stato testato in parallelo sei volte. I picchi di glico con proporzioni relativamente piccole hanno mostrato elevati errori di misurazione superiori al 10% del coefficiente di variazione.

Nel pezzo e importante per la formazione ad un stabilito di struttura IgG n-glica, specialmente per stabilire terminale Pertanto, invece di 3.3 IgG n-glicasi trovato in è fondamentale in questo l'importanza di IgG. I glicani sono noti per essere diversi. Con gli sviluppi della prototomica glica, combinati in glicani per esplorare le informazioni a questo tale che può essere utilizzato come potenziale per la diagnosi di oggi.

Dopo questo sviluppo della tecnica, fornisce un nuovo modo di esplorare