Name: Immunoglobulin G N-Glycan Analisi di Ultra-Performance Liquid Chromatoography (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-18T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 1 s
Description: Scopri l'analisi degli N-glicani dell'IgG mediante cromatografia liquida ultra-performante per applicazioni diagnostiche. Questo metodo sensibile e riproducibile consente di separare gli isomeri glicanici con elevata precisione.

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Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dalla National Natural Science Foundation of China (81673247 & 81872682) e dalla australiana-Cina Collaborative Grant (NH & MRC - APP11112767 -NSFC 81561128020).

Tutti i soggetti inclusi nel protocollo sono stati approvati dal Comitato Etico della Capital Medical University, Pechino, Cina12. Il consenso informato scritto è stato ottenuto da ogni materia all'inizio dello studio.
1. Isolamento IgG
<ol><li>Preparare le sostanze chimiche, tra cui il buffer di legatura (fosfato buffer saline, PBS): 1x PBS (pH - 7,4), neutralizzazione del buffer: 10x PBS (pH - 6,6-6,8), eluente: 0,1 M di acido formica (pH - 2,5), soluzione neutralizzante per eluente: 1 M di bicarbonato di ammonio, memorizzato nel buffer: 20% etanolo - 20 mM Tris - 0,1 M NaCl (pH - 7,4), soluzione di pulizia per la proteina G: 0,1 M NaOH - 30% propan-2-ol. NOTA: il livello di pH è fondamentale in questo protocollo. L'eluzione di IgG richiede un pH molto basso, e c'è il rischio di perdita di acidi sialici a causa dell'idrolisi acida. Pertanto, l'eluizione avviene in pochi secondi e il pH viene rapidamente ripristinato alla neutralità, preservando l'integrità di IgG e degli acidi sialici.</li>
	<li>Preparare i campioni: scongelare il campione di plasma congelato, quindi centrifugare a 80 x g per 10 min, e lasciare la proteina G piastra monolitica e le sostanze chimiche di cui sopra per 30 min a temperatura ambiente (RT).</li>
	<li>Trasferire un campione di 100 l (che può essere utilizzato per rilevare 2x per prevenire il primo guasto) in una piastra di raccolta da 2 mL (qui, un totale di sei campioni standard, un campione di controllo [acqua ultrapura] e 89 campioni di plasma sono stati progettati per 96 piastre di pozzo e assegnati in modo casuale al piatto).</li>
	<li>Diluire i campioni con 1x PBS di 1:7 (v/v).</li>
	<li>Pulire una piastra filtrante in polipropilene idrofilo (GHP) di 0,45 m con 200 l di acqua ultrapura (ripetere 2x).</li>
	<li>Trasferire i campioni diluiti nella piastra filtrante e filtrarli nella piastra di raccolta utilizzando una pompa a vuoto (pressione del vuoto di controllo a 266.6-399.9 Pa).</li>
	<li>Preparazione delle piastre monolitiche proteiche G<ol>
<li>Eliminare il buffer di archiviazione.</li>
		<li>Pulire le piastre monolitiche con 2 mL di acqua ultra-pura, 2 mL di 1x PBS, 1 mL di acido formica di 0,1 M, 2 mL di 10x PBS, 2 mL di 1x PBS (in sequenza) e rimuovere il liquido che scorre utilizzando una pompa a vuoto.</li>
	</ol></li>
	<li>Trasferire i campioni filtrati nella proteina G piastra monolitica per il legame IgG e la pulizia, quindi pulire le piastre monolitiche con 2 mL di 1x PBS (ripetere la pulizia 2x).</li>
	<li>Evitare L'IgG con 1 mL di acido formica da 0,1 M e filtrare i campioni nella piastra di raccolta con la pompa a vuoto, quindi aggiungere 170 l of 1 M di bicarbonato di ammonio nella piastra di raccolta.</li>
	<li>Rilevare la concentrazione di IgG utilizzando uno spettrometro di assorbimento (lunghezza d'onda ottimale - 280 nm).<ol>
<li>Aprire il software e selezionare la modalità proteina-CY3.</li>
		<li>Disegnare 2 - L di acqua ultra-pura e caricarlo nello schermo, quindi fare clic su Vuoto nel software per cancellare lo schermo (ripetere 1x).</li>
		<li>Disegnare 2 - L di acqua ultra-pura e caricarlo nello schermo, quindi fare clic su Campione nel software per rilevare l'acqua ultra-pura.</li>
		<li>Disegnare 2 l- di campione IgG e caricarlo nello schermo, quindi fare clic su Campione nel software per rilevare il campione.</li>
		<li>Disegnare 2 - L di acqua ultra-pura e caricarlo nello schermo, quindi fare clic su Vuoto nel software per cancellare lo schermo.</li>
		<li>Chiudere il software. NOTA: La formula per calcolare la concentrazione di IgG è la seguente: CIgG - coefficiente di assorbimento x estinzione (13,7) x 1.000 g/mL</li>
	</ol></li>
	<li>Mettete l'IgG estratto ad asciugare in forno a 60 gradi centigradi e conservate l'IgG estratto (300 gradi-L estratto IgG per 4 h).<ol>
<li>Rimuovere 300 l di IgG estratto se la concentrazione è maggiore di 1.000 g/mL.</li>
		<li>Rimuovere 350 l di IgG estratto se la concentrazione è compresa tra 500-1.000 g/mL.</li>
		<li>Rimuovere 400 l di IgG estratto se la concentrazione è compresa tra 200-500 g/mL.</li>
		<li>Rimuovere 600 l di IgG estratto se la concentrazione è inferiore a 200 g/mL. NOTA: La concentrazione di IgG dovrebbe essere preferibilmente >200 g/mL per il rilevamento successivo. La quantità media di IgG dovrebbe essere preferibilmente >1.200 g, che può essere testato 2x nel caso in cui il primo test non riesce.</li>
	</ol></li>
	<li>Pulizia della proteina G piastra monolitica per il riutilizzo<ol>
<li>Lavare la piastra con 2 mL di acqua ultra-pura, 1 mL di 0,1 M NaOH (per rimuovere le proteine precipitate), 4 mL di acqua ultra-pura e 4 mL di 1x PBS (sequenza), quindi rimuovere il liquido che scorre utilizzando una pompa a vuoto.</li>
		<li>Lavare la piastra con 2 mL di acqua ultra-pura, 2 mL del 30% propan-2-ol (per rimuovere le proteine idrofobiche legate), 2 mL di acqua ultra-pura e 4 mL di 1x PBS (in sequenza), quindi rimuovere il liquido che scorre utilizzando una pompa a vuoto.</li>
		<li>Lavare la piastra con 1 mL di tampone (20% etanolo , 20 Mm Tris e 0,1 M NaCl) e aggiungere la piastra di 1 mL di tampone (20% di etanolo , 20 Mm Tris , 0,1 M di NaCl) alla piastra, quindi lasciare la piastra a 4 gradi centigradi.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Rilascio di Glycan
<ol><li>Preparare l'IgG essiccato e conservare le sostanze chimiche tra cui 1.33% SDS, 4% Igepal (negozio lontano dalla luce), e 5x PBS a RT.</li>
	<li>Preparare l'enzima PNGase F diluindo 250 U enzima con 250 l di acqua ultra-pura.</li>
	<li>Denaturazione di IgG<ol>
<li>Aggiungere 30 - L di 1,33% SDS e mescolare vortice, trasferire il campione in un forno a 65 gradi per 10 min, quindi toglierlo dal forno e lasciare riposare per 15 min.</li>
		<li>Aggiungere 10 L del 4% Igepal e posizionarlo sull'incubatrice agitazione per 5 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Rimozione e rilascio di glicani<ol>
<li>Aggiungete 20 l di 5x PBS e 30-35 l l di 0,1 mol/L NaOH per regolare un pH di 8,0 e mescolate mediante vortice. Aggiungere 4 L di Enzima PNGase F e mescolare vortice. Quindi, incubare per 18-20 h in un bagno d'acqua a 37 gradi centigradi.</li>
		<li>Mettete i glitrali rilasciati ad asciugare in forno a 60 gradi centigradi per 2,5-3,0 h.</li>
		<li>Salvare i glicani rilasciati a -80 gradi centigradi fino a un'ulteriore misurazione. NOTA: questo passaggio è fondamentale. La chiave per il rilascio di glicani è migliorare l'attività dell'enzima PNGase F per massimizzarne l'efficienza.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Etichettatura e purificazione del glicano
<ol><li>Preparare il reagente di etichettatura 2-aminobenzamide (2-AB) con 0,70 mg di 2-AB, 10,50 l di acido acetico, 6 mg di cianoboboidride di sodio (NaBH3CN) e 24,50 - L di dimetilfossido di dimetilluso (DMSO) (volume totale 35 . Quindi, aggiungere acido acetico, 2-AB, e NaBH3CN nel DMSO in ordine.</li>
	<li>Etichettare i glicani utilizzando 35 gradi l di reagente di etichettatura 2-AB, trasferire i glicani etichettati all'oscillatore per 5 min, trasferire al forno per 3 h a 65 gradi centigradi, quindi trasferire a RT per 30 min. NOTA: l'intero passaggio di etichettatura glican deve essere eseguito mentre è protetto dalla luce.</li>
	<li>Pretrattare una piastra filtrante GHP da 0,2 m con 200 gradi l di 70% di etanolo, 200 l di acqua ultrapura e 200 luna del 96% acetonitrile (4 gradi), quindi rimuovere i rifiuti con una pompa a vuoto.</li>
	<li>Purificazione del glicano etichettato 2-AB<ol>
<li>Aggiungere 700 loffi del 100% di acetonitrile al glicano etichettato 2-AB e trasferirlo in un'incubatrice tremante per 5 min.</li>
		<li>Centrifuga a 134 x g per 5 min (4 gradi centigradi).</li>
		<li>Trasferire il campione su una piastra filtrante GHP di 0,2 m per 2 min e rimuovere il filtrato (liquido che scorre) utilizzando una pompa a vuoto.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lavare il glicano etichettato 2-AB con 200 -L of 96% acetonitrile (4 ) e rimuovere il filtrante (liquido scorrevole) utilizzando una pompa a vuoto 5x-6x.</li>
	<li>Glicano etichettato 2-AB eluito con 100 litri di acqua ultrapura 3x.</li>
	<li>Trasferire il glicano con etichetta 2-AB in forno ad asciugare a 60 gradi centigradi per 3,5 h.</li>
	<li>Salvare gli N-glicani con l'etichetta a -80 gradi centigradi fino a un'ulteriore misurazione.</li>
</ol>4. Cromatografia e analisi dell'interazione idrofila
<ol><li>Condizionamento degli strumenti UPLC e preparazione delle fasi mobili<ol>
<li>Preparare fasi mobili, tra cui solvente A: 100 mM di formato di ammonio (pH - 4,4), solvente B: acetonitrile 100%, solvente C: 90% acqua ultra-pura (10% metanolo) e solvente D: 50% metanolo (acqua ultra-pura).</li>
		<li>Aprire il software per controllare le fasi mobili.</li>
		<li>Lavare gli strumenti UPLC a una portata di 0,2 mL/min (50% solvente B e 50% solvente C) bilanciato per 30 min, quindi ad una velocità di flusso di 0,2 mL/min (25% solvente A e 75% solvente B) bilanciamento per 20 min, quindi una velocità di flusso di 0,4 mL/ bilanciamento.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sciogliere i n-glicani etichettati con 25 gradi di una miscela di acetonitrile 100% e acqua ultra-pura ad un rapporto 2:1 (v/v). Quindi, centrifugare a 134 g per 5 min (4 gradi centigradi) e caricare 10 -L degli strumenti N-glicani etichettati negli strumenti UPLC. </li>
	<li>Separare i valori etichettati N-glicani alla portata di 0,4 mL/min con una pendenza lineare del 75% al 62% di acetonitrile per 25 min. Quindi, eseguire una corsa analitica da dextran calibrazione colonna / colonna di glicopeptide su un UPLC a 60 gradi centigradi (qui, i campioni sono stati tenuti a 4 gradi centigradi prima dell'iniezione).</li>
	<li>Rileva la fluorescenza N-glican a lunghezze di eccitazione ed emissione di 330 e 420 nm, rispettivamente.</li>
	<li>Integrare i glicani in base alla posizione di picco e al tempo di ritenzione.</li>
	<li>Calcolare il valore relativo di ogni picco di Glycan (GP)/ tutti i picchi di Glycan (GP) (percentuale, %) come segue: GP1: GP1/GP-100, GP2: GP2/GP-100, GP3: GP3/GP-100, ecc.</li>
</ol>

<ol><li>Kolarich, D., Lepenies, B., Seeberger, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycomics%2C+glycoproteomics+and+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Glycomics, glycoproteomics and the immune system.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 16, 214(2012).</li>
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<li>Liu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ischemic+stroke+is+associated+with+the+pro-inflammatory+potential+of+N-glycosylated+immunoglobulin+G%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Ischemic stroke is associated with the pro-inflammatory potential of N-glycosylated immunoglobulin G.</a> Journal of Neuroinflammation. 15, 123(2018).</li>
<li>Russell, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+N-glycosylation+of+immunoglobulin+G+as+a+novel+biomarker+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22GLYCOBIOLOGY%22%5BJournal%5D)">The N-glycosylation of immunoglobulin G as a novel biomarker of Parkinson's disease.</a> GLYCOBIOLOGY. 27, 501(2017).</li>
<li>Bones, J., Mittermayr, S., O'Donoghue, N., Guttman, A., Rudd, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra+performance+liquid+chromatographic+profiling+of+serum+N-glycans+for+fast+and+efficient+identification+of+cancer+associated+alterations+in+glycosylation%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Ultra performance liquid chromatographic profiling of serum N-glycans for fast and efficient identification of cancer associated alterations in glycosylation.</a> Analytical Chemistry. 82, 10208(2010).</li>
<li>Pucic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+isolation+and+glycosylation+analysis+of+IgG-variability+and+heritability+of+the+IgG+glycome+in+three+isolated+human+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">High throughput isolation and glycosylation analysis of IgG-variability and heritability of the IgG glycome in three isolated human populations.</a> Molecular Cellular Proteomics. 10, M111(2011).</li>
<li>Berruex, L. G., Freitag, R., Tennikova, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+antibody+binding+to+immobilized+group+specific+affinity+ligands+in+high+performance+monolith+affinity+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+and+Biomedical+Analysis%22%5BJournal%5D)">Comparison of antibody binding to immobilized group specific affinity ligands in high performance monolith affinity chromatography.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 24, 95(2000).</li>
<li>Ren, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+IgG+galactosylation+as+a+promising+biomarker+for+cancer+screening+in+multiple+cancer+types%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Distribution of IgG galactosylation as a promising biomarker for cancer screening in multiple cancer types.</a> Cell Research. 26, 963(2016).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

UPLC funge da metodo di analisi quantitativa relativa5,15. I risultati indicano che UPLC è una tecnologia di rilevamento stabile con una buona riproducibilità e relativa precisione quantitativa. La quantità di glicani in ogni picco è espressa come percentuale dell'area totale integrata utilizzando UPLC, che è il valore relativo. La quantificazione relativa migliora la comparabilità dei campioni di prova. Inoltre, 96 piastre g di proteine sono utilizzate per purif...

N-glicosilazione delle proteine umane è una modifica post-traduzionale comune ed essenziale1 e può aiutare a prevedere l'insorgenza e lo sviluppo di malattie in modo relativamente accurato. A causa della complessità della sua struttura, si prevede che ci siano più di 5.000 strutture glicane, fornendo un grande potenziale come biomarcatori diagnostici e predittivi per le malattie2. N-glicani attaccati all'immunoglobulina G (IgG) hanno dimostrato di essere essenziali per la funzione di IgG, e IgG N-glycosylation partecipa all'equilibrio tra i sistemi pro e antinfiammatori3. La legatura IgG Ndifferenziale è coinvolta nello sviluppo e nella progressione della malattia, che rappresenta sia una predisposizione che un meccanismo funzionale coinvolto nella patologia della malattia. Il ruolo infiammatorio di IgG N-glycosylation è stato associato con l'invecchiamento, malattie infiammatorie, malattie autoimmuni, e cancro4. 
Con lo sviluppo della tecnologia di rilevamento, i seguenti metodi sono più ampiamente utilizzati nei licoli ad alta produttività: cromatografia ad interazione idrofila (HILIC) cromatografia liquida ad altissima prestazione con rilevamento della fluorescenza (UPLC-FLR), elettroforesi gelpillara multiplalesa con fluorino indotto dal laser rilevamento dell'escenza (xCGE-LIF), spettrometria di massa di desorption/ionizzazione del tempo di ionizzazione del tempo di volo (MALDI-TOF-MS) e spettrometria di massa elettrospray a matrice (LC-ESI-MS) . Questi metodi hanno superato le precedenti carenze di basso flusso, risultati instabili e scarsa specificità di sensibilità5,6.
UPLC è ampiamente usato per esplorare l'associazione tra IgG N-glicosilazione e alcune malattie (ad esempio, invecchiamento7, obesità8, dislipidemia9, tipo II diabete10, ipertensione11, ictus ischemico12, e morbo di Parkinson13). Rispetto agli altri tre metodi di cui sopra, UPLC ha i seguenti vantaggi5,14. In primo luogo, fornisce un metodo di analisi quantitativa relativa e l'analisi dei dati che comporta la normalizzazione totale delle aree migliora la comparabilità di ogni campione. In secondo luogo, il costo delle attrezzature e le competenze richieste sono relativamente bassi, il che rende più facile implementare e trasformare i biomarcatori della glicosilazione in applicazioni cliniche. Presentato qui è un'introduzione a UPLC in modo che possa essere più ampiamente utilizzato.

<table><tbody><tr><td>2-amminobenzamide, 2-AB</td><td>Sigma, Cina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Piastra di raccolta a 96 pozzetti</td><td>AXYGEN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Piastra filtrante a 96 pozzetti</td><td>Pol</td><td>0,45 um GHP</td> Piastra monolitica a 96 pozzetti BIA <td></td></tr><tr><td></td><td>Separazioni</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rotore a piastra a 96 pozzetti</td><td>Eppendorf Co., Ltd, Germania</td><td>T_1087461900</td><td></td></tr><tr><td>Acido acetico</td><td>Sigma, Cina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>Huihai Keyi Technology Co., Ltd, Cina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato di ammonio</td><td>Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, Cina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Formiato di ammonio</td><td>Beijing Minruida Technology Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubatore/bilanciere a scuotimento costante</td><td>Zhicheng strumento analitico manufacturing co., Ltd, Cina</td><td>ZWY-10313</td><td></td></tr><tr><td>Scala di calibrazione destrano/colonna glicopeptidica</td><td>Watts technology Co., Ltd, Cina</td><td>Colonna</td><td></td>BEH</tr><tr><td>Dimetil solfossido (DMSO)</td> <td>Sigma, Cina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fosfato disodico</td><td>Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, Cina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forni elettrici</td><td>Tester instruments Co., Ltd</td><td>202-2AB</td><td></td></tr><tr><td>Empower 3.0</td><td>Waters technology Co., Ltd, America</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Huihai Keyi Technology Co., Ltd, Cina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acido formico</td><td>Sigma, Cina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GlycoProfile 2-AB Kit di etichettatura</td><td>Sigma, Cina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Junrui Biotechnology Co., Ltd, Cina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga ad alta velocità</td><td>Eppendorf Co., Ltd, Germania</td><td>5430</td><td></td></tr><tr><td>Igepal</td><td>Sigma, Cina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga a bassa temperatura</td><td>Eppendorf Co., Ltd, Germania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Frigorifero a bassa temperatura</td><td>Qingdao Haier Co., Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Collettore a 96 pozzetti per piastre</td><td>Tecnologia Watt Co., Ltd, Cina</td><td>186001831</td><td></td></tr><tr><td>metanolo</td><td>Huihai Keyi Technology Co., Ltd, Cina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q contatore di acqua pura</td><td>Millipore Co., Ltd, America</td><td>Advantage A10</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, Cina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PH tester</td><td>Sartorius Co., Ltd, Germania</td><td>PB-10</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato, PBS</td><td>Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, Cina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipetta</td><td>Eppendorf Co., Ltd, Germania</td><td>4672100, 0,5-10 & mu; l & 10-100&mu; l & 20-200&mu; l & 1000&mu; </td><td></td>l</tr><tr><td>PNGasi F enzima</td><td>Sigma, Cina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Potassio diidrogeno fosfato</td><td>Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, Cina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Propan-2-olo</td><td>Huihai Keyi Technology Co., Ltd, Cina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma, Cina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, Cina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cianoboroidruro di sodio (NaBH3CN)</td> <td>Sigma, Cina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spettrofotometro</td><td>Shanghai Yuanxi instrument Co., Ltd</td><td>B-500</td><td></td></tr><tr><td>Pistola liquida di trasferimento</td><td>Smer Fell Science and Technology Co., Ltd, Cina</td><td>4672100</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Amresco, America</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Frigorifero a bassissima temperatura</td><td>Thermo Co., Ltd, America</td><td>MLT-1386-3-V; MDF-382E</td><td></td></tr><tr><td>Cromatografia liquida ad alte prestazioni</td><td>Watts technology Co., Ltd, Cina</td><td>Acquity MLtraPerformance LC</td><td></td></tr><tr><td>Vacuum Pump</td><td>Watts technology Co., Ltd, Cina</td><td>725000604</td><td></td></tr><tr><td>Volatilizzatore / Essiccatore</td><td>Eppendorf Co., Ltd, Germania</td><td>T_1087461900</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Changzhou Enpei instrument Co., Ltd, Cina</td><td>NP-30S</td><td></td></tr><tr><td>Tester a bagno d'acqua</td><td>strumenti Co., Ltd</td><td>DK-98-IIA</td><td></td></tr><tr><td>Bilancia</td><td>Shanghai Jingke Scientific Instrument Co., Ltd.</td><td>MP200B</td><td></td></tr></tbody></table>

immunoglobulin g n-glycan analisi di ultra-performance liquid chromatoography

Immunoglobulin G N-Glycan Analysis by Ultra-Performance Liquid Chromatography

Il glicomics è una nuova sottospecializzazione nella ricerca sul sistema omico che offre un potenziale significativo nella scoperta di biomarcatori di nuova generazione per la suscettibilità alle malattie, la scoperta di bersagli farmacologici e la medicina di precisione. I iggini alternativi IgG Nsono stati riportati in diverse malattie croniche comuni e hanno suggerito di avere un grande potenziale nelle applicazioni cliniche (ad esempio, biomarcatori per la diagnosi e la previsione delle malattie). IgG N-glicani sono ampiamente caratterizzati utilizzando il metodo di cromatografia di interazione idrofila (HILIC) cromatografia liquida ad altissima prestazione (UPLC). UPLC è una tecnologia di rilevamento stabile con una buona riproducibilità e un'elevata precisione quantitativa relativa. Inoltre, la struttura di IgG N-glycan è chiaramente separata, e la composizione glicana e l'abbondanza relativa nel plasma sono caratterizzati.

Come illustrato nella Figura 1, IgG N-glicani sono stati analizzati in 24 picchi iniziali di glicani (GP) in base alla posizione di picco e al tempo di ritenzione. Le strutture N-glicani sono disponibili attraverso il rilevamento della spettrometria di massa secondo uno studio precedente (Tabella 1)15. Per garantire che i risultati fossero comparabili, è stata applicata la normalizzazione totale dell'...

ImmunoglobulinG (IgG) N-glican è caratterizzato utilizzando l'interazione idrofila cromatografica UPLC. Inoltre, la struttura di IgG N-glycan è chiaramente separata. Presentato qui è un'introduzione a questo metodo sperimentale in modo che possa essere ampiamente utilizzato nelle impostazioni di ricerca.

Immunoglobulin G N-Glycan Analisi di Ultra-Performance Liquid Chromatoography

Glycomics is a new subspecialty in omics system research that offers significant potential in discovering next-generation biomarkers for disease ...

La cromatografia liquida ad alte prestazioni è una tecnologia consolidata per un'analisi accurata dell'IgG n-glicina A causa della sua sensibilità sembra essere e ha la capacità di fornire una specifica informazione di glico Questo metodo è facile da usare e ha un numero di diversi costi relativamente bassi di incrementi, alta riproducibilità La capacità di glicerinare isomeri. Le misurazioni delle proteine nel plasma potrebbero essere interessanti. in medicina.associato anche all'IgG in base al glicosio e tale e biologico contenente la popolazione. Sai che dello stato impuro viene usato per testare l'IgG nei glicani. In realtà, può testare n-glicani di proteine.Questo è necessario in una proteina cross-bound di due stati puri può essere applicato alla proteina Il processo sperimentale OR è relativamente semplice mentre il processo sperimentale deve essere standardizzato. Il processo sperimentale end-to-end richiede tre giorni per funzionare e le fasi sperimentali devono essere memorizzate per padroneggiare le abilità sperimentali. Per preparare i campioni, scongelare il campione di plasma congelato.Quindi, centrifugare a 80 volte G per 10 minuti. Lasciare la piastra monolitica proteinA G a temperatura ambiente per 30 minuti. Trasferire 100 micrometri di campione in ogni pozzo della piastra di raccolta a due millilitri.Aggiungere acqua ultra pura come un campione di controllo. Diluire i campioni con un X PBS da uno a sette volume per volume. Pulire una piastra filtrante in polipropolene idrofilo da 0,45 micron con 200 microlitri di acqua ultra pura.Ripetere la pulizia altre due volte. Trasferire i campioni diluiti nella piastra filtrante e filtrare i campioni nella piastra collettiva utilizzando una pompa per vuoto con pressione da 266,6 a 399,9 Pascal. Per preparare le placche monolitiche proteina G, prima scartare il tampone di stoccaggio.Pulire le piastre monolitiche con due millilitri di acqua ultra pura, due millilitri di un X PBS, un millilitro di acido formico molare 0,17, due millilitri di 10 X PBS e due millilitri di un X PBS in sequenza. Rimuovere il seguente liquido utilizzando una pompa per vuoto. Utilizzando una pipetta multicanale, trasferire i campioni filtrati nella piastra monolitica proteina G per legare e pulire IgG.Quindi, aggiungere due millilitri di un X PBS per pulire le piastre monolitiche. Rimuovere il PBS utilizzando una pompa per vuoto e ripetere la pulizia due volte in più. Illute IgG con un millilitro di acido formico molare 0,17 e filtrare i campioni nella piastra di raccolta mediante pompa per vuoto.Quindi, aggiungere 170 microlitri di un bicarbonato di ammonio molare nella piastra di raccolta. Rilevare la concentrazione IgG utilizzando uno spettrotropetometro di assorbimento alla lunghezza d'onda ottimale di 280 nanometri. Posizionare l'IgG estratto in un forno per asciugare a 60 gradi Celsius per tre ore.Determinare la quantità da osservare in base alla sua concentrazione descritta nel manoscritto e conservarla in meno 80 gradi Celsius. Raccogliere l'IgG essiccato e conservare prodotti chimici tra cui 1,33%SDS, 4% IgePal e 5%PBS a temperatura ambiente. Preparare l'enzima indoglycosidasi F diluire 250 unità di enzima con 250 microlitri di acqua ultra pura.Per denaturare l'IgG, aggiungere 30 microlitri di 1,33%SDS e mescolare con il vortice. Trasferire il campione in un forno a 65 gradi Celsius per 10 minuti. Quindi, rimuoverlo dal forno e lasciarlo raffreddare per 15 minuti.Aggiungere 10 microlitri di IgePal al quattro% nello stesso campione e posizionarlo su un'incubatrice di scuotimento per cinque minuti. Aggiungere 20 microlitri di cinque X PBS e da 30 a 35 microlitri di idrossido di sodio molare 0,1 per regolare il pH a 8,0 e mescolare mediante vortice. Aggiungere quattro microlitri di enzima endoglicosidasi F e mescolare con il vortice.Quindi, incubare per 18-20 ore in un bagno d'acqua di 37 gradi Celsius. Il giorno dopo, mettere i ginecani rilasciati in un forno a 60 gradi Celsius per asciugare per due ore e mezza o tre ore. Salvare i glicani di rilascio a meno 80 gradi Celsius fino a ulteriori misurazioni.Preparare i due reagenti per l'etichettatura dell'ammino benzimide con 24,5 microlitri di DMSO, 10,5 microlitri di acido acetico, 0,7 milligrammi di due ammino benzimide e sei milligrammi di cianoboroidro di sodio. Successivamente, in una stanza buia, etichettare i glicani aggiungendo 35 microlitri di due ammino benzimide che etichettano il reagente. Trasferire i glcan etichettati su un oscillatore per cinque minuti, quindi trasferirli al forno per tre ore a 65 gradi Celsius.Successivamente, trasferirlo a temperatura ambiente per 30 minuti. L'IgG n-glicasi, lo etichettamo per essere rilevato dal rilevamento fluorescente dello stato impuro. Pretrattare una piastra filtrante GHP da 0,2 micron con 200 microlitri di etanolo al 70%, 200 microlitri di acqua ultra pura e 200 microlitri di nitrile di aceto al 96% a quattro gradi Celsius.Quindi, rimuovere i rifiuti utilizzando una pompa per vuoto. Per purificare i due glicani etichettati come ammino benzimide, aggiungere 700 microlitridi di acetonitrile al 100% al campione e trasferirlo in un'incubatrice di scuotimento per cinque minuti. Centrifuga a 134 volte G per cinque minuti a quattro gradi Celsius.Trasferire il supernatante su una piastra filtrante GHP da 0,2 micron per due minuti e rimuovere il filtrato utilizzando il vuoto. Lavare i due amino benzimidi etichettati glicina con 200 microlitridi del 96% di acetonitrile a quattro gradi Celsius e rimuovere il filtrato utilizzando una pompa per vuoto da cinque a sei volte. Male due ammino benzimide etichettati glicina con 100 microlitri di acqua ultra pura tre volte.Trasferire i due amino benzimide etichettati glicina in un forno per asciugare a 60 gradi Celsius per tre ore e mezza. Salvare gli n-glicani etichettati a meno 80 gradi Celsius fino a ulteriore misurazione. In primo luogo, aprire il software per controllare le fasi mobili.Lavare gli strumenti UPLC con 50%solvente B e 50% solvente C alla portata di 0,2 millilitri al minuto per 30 minuti. Quindi lavare con il 25% solvente A e il 75% solvente B ad una portata di 0,2 millilitri al minuto per 20 minuti. Quindi, aggiungere una portata di 0,4 millilitri al minuto.Sciogliere gli n-glicani etichettati con 25 microlitri di una miscela di acetonitrile al 100% e acqua ultra pura con un rapporto volume/volume due a uno. Quindi, centrifugare a 134 volte G per cinque minuti a quattro gradi Celsius e utilizzare un tubo asciutto per caricare 10 microlitri del supernatente negli strumenti UPLC. Separare gli n-glicani etichettati alla portata di 0,4 millilitri al minuto con un gradiente lineare dal 75% al 62% di acetonitrile per 25 minuti.Quindi, eseguire un'analisi eseguita dalla colonna glicopeptide della scala di calibrazione Dexteran su un UPLC a 60 gradi Celsius. Rileva fluorescenti n-glicane rispettivamente a X citando e lunghezze d'onda di emissione di 330 nanometri e 420 nanometri. Come mostrato in questa figura, i n-glicani IgG sono stati analizzati in 24 picchi di glicina IgG iniziali in base alla posizione di picco e al tempo di ritenzione.Le strutture n-glicane sono disponibili in 24 tipi attraverso il rilevamento della spettrometria di massa. Per valutare la ripetibilità e la stabilità del metodo, il campione standard è stato testato in parallelo sei volte. I picchi di glico con proporzioni relativamente piccole hanno mostrato elevati errori di misurazione superiori al 10% del coefficiente di variazione.Nel pezzo e importante per la formazione ad un stabilito di struttura IgG n-glica, specialmente per stabilire terminale Pertanto, invece di 3.3 IgG n-glicasi trovato in è fondamentale in questo l'importanza di IgG. I glicani sono noti per essere diversi. Con gli sviluppi della prototomica glica, combinati in glicani per esplorare le informazioni a questo tale che può essere utilizzato come potenziale per la diagnosi di oggi.Dopo questo sviluppo della tecnica, fornisce un nuovo modo di esplorare

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Un metodo specifico e sensibile al fine di conoscere il profilo di espressione di antigeni glicosfingolipidi in organi e cellule immunitarie è descritto. Il metodo sfrutta la spettrometria di massa a trappola ionica consentendo graduale frammentazione delle molecole glicosfingolipidi per l'analisi strutturale rispetto agli standard sintetizzati chimicamente.

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