Caratterizzazione degli aggregati proteici individuali mediante nanospettroscopia a infrarossi e microscopia a forza atomica

I metodi basati sulla microscopia a forza atomica rendono possibile caratterizzare i processi biomolecolari su scala nanometrica con risoluzione morfologica chimica o strutturale, aprendo infine una nuova finestra frontale di osservazione sulla biologia. I metodi a singola molecola consentono di sondare sistemi altamente eterogenei, una caratteristica particolarmente rilevante per comprendere l'aggregazione proteica. Combinando singole molecole con approcci alla schiena, possiamo ottenere informazioni fondamentali sul comportamento delle proteine, sui loro legami con le malattie umane e progettare interventi farmacologici che possono avere successo.

Inoltre, questo metodo può essere applicato con successo per studiare le proprietà chimiche e strutturali dei biomateriali per la somministrazione di farmaci, applicazioni e altri scopi biotecnologici. Potrebbe essere difficile impostare inizialmente i parametri AFM corretti per l'alta risoluzione ed è facile impostare l'AFM durante la misurazione degli aggregati fibrillari. 30 minuti prima dell'imaging AFM, accendere il sistema AFM e fare clic su Configura e sonda.

Nella finestra di modifica della sonda fare clic su avanti per preparare lo stadio di messa a fuoco Z. Spegnere l'interruttore del fascio AFM se è in accensione e sbloccare le serrature a coda di rondine. Scollegare la testa dal sistema e nella finestra di cambio sonda fare clic su Avanti.

Montare il sbalzino AFM sul supporto della sonda. Collegare la testa al sistema e bloccare le serrature a coda di rondine. Accendere l'interruttore del raggio laser AFM e nella finestra di cambio sonda fare clic su Avanti.

Nella finestra popup, fare clic su no se il tipo a sbalzi di sbalzi non è cambiato e regolare le manopole di allineamento ottico per trovare il sbalzino. Regolare lo stato attivo sul sbalzino e fare clic su Avanti. Nella finestra popup fare clic su sì se lo stato attivo è sul sbalzino.

Utilizzare le manopole del raggio laser di rilevamento per posizionare il raggio laser all'estremità del cantilever. Utilizzare le manopole del raggio laser deviato per massimizzare il segnale totale misurato dal diodo fotografico a quattro quadranti ad almeno un volt. Nella finestra di cambio probe fare clic su Avanti e chiudi.

Dopo aver atteso 15 minuti affinché il cantilever raggiunga la stabilità termica, riregolare la posizione del raggio laser deviato sul diodo fotografico sensibile alla posizione, se necessario. Fate clic su Sweep NCM (NCM sweep), selezionate l'ampiezza desiderata di oscillazione, fate clic su Usa fase (Use Phase) e fate clic su auto. Sintonizzare la sbalzo vicino al massimo della sua prima risonanza libera di oscillazione a circa 300 kilohertz per un sbalzo con una costante di molla di 40 newton al metro.

Posizionare il campione sul supporto del campione. Fare clic sull'area di scansione e impostare la risoluzione su 256 per 256 e 1024 per 1024 pixel, quindi impostare le dimensioni della scansione e il numero di pixel. Impostare la velocità di scansione su 0,3 su un hertz per un'area di scansione da uno a cinque per cinque micrometri al quadrato.

Mettere a fuoco la vista ottica sul campione e fare clic sull'approccio per avvicinarsi alla superficie del campione. Quindi, fare clic su solleva 100 micrometri per sollevare la punta AFM a 100 micrometri sopra la superficie del campione e fare clic su espandi sull'immagine ottica del campione. Fare clic sulla barra dello stato attivo per concentrare la vista sulla superficie del campione e usare le frecce per spostarsi nell'area del campione di interesse.

Fate clic su approccio (approach) per attivare la superficie e fate clic su scansione linea (Line Scan) per verificare se la punta sta seguendo bene la superficie. Regolare il set point in base alle esigenze. Quindi fare clic su scansione per iniziare a diagnosticare la superficie del campione, mantenendo un regime costante di cambiamento di fase non superiore al delta 20 durante l'imaging per evitare una grande forza di imaging e mantenere la coerenza tra campioni indipendenti.

Per l'imaging a nanospectroscopia IR, da 30 a 60 minuti prima dell'analisi, accendere il sistema IR AFM e il laser IR. Aprire il software integrato per controllare lo strumento e fare clic sul file e nuovo per aprire un nuovo file nano IR. Fare clic su initialize per avviare il sistema a infrarossi AFM e aprire il coperchio dello strumento.

Montare una sonda rivestita in oro silicone con un raggio nominale di 30 nanometri e una costante di molla di 0,2 newton per metro sul sistema IR AFM per misurare il campione in modalità di contatto. Fare clic su carica nella sezione della sonda AFM e successivamente. Utilizzare la messa a fuoco sulle frecce della sonda per mettere a fuoco la fotocamera sul sbalzino e utilizzare la punta per il mirino per posizionare il mirino alla fine del cantilever.

Ruotare le manopole che controllano la posizione del laser di rilevamento per posizionare il laser all'estremità della sbalziola. Ruotare le manopole laser per rilevare e massimizzare la somma misurata dal diodo fotografico a quattro quadranti a un valore maggiore di tre volt. Ruotare la manopola di deflessione per regolare la deflessione a sbalzi a meno un volt e fare clic su avanti.

Quindi chiudere il coperchio dello strumento. Usa lo stato attivo sulle frecce della sonda per mettere a fuoco la fotocamera sul campione e punta alle frecce del mirino per spostarti nella regione di interesse del campione. Fare clic su Avanti e coinvolgere.

Nella finestra del microscopio, selezionare l'altezza per la morfologia, l'ampiezza due per l'assorbimento IR e la frequenza PLL per mappare la punta alla risonanza di contatto del campione. Nella sezione di scansione AFM, impostare i parametri come dimostrato per l'imaging AFM e fare clic sulla scansione per acquisire una mappa morfologica. Al termine della mappatura morfologica, nella finestra del microscopio fare clic sulla mappa dell'altezza per posizionare la sonda nella parte superiore di un aggregato.

Nella sezione nano IR, fare clic su avvia IR per illuminare il campione con il laser IR. Per mettere a fuoco il laser a infrarossi sul sbalzino, fare clic su ottimizza e immettere 1655 centimetri per il numero d'onda. Fare clic su aggiungi e scansiona per determinare la posizione del laser a infrarossi e fare clic su aggiorna e ok per allinearne la posizione con il sbalzino.

Nella sezione generale immettere un numero d'onda per il quale è prevista un'elevata assorbanza nel campo relativo e disattivare l'opzione filtro passa banda. Fare clic su Avvia ir, quindi controllare la lettura del misuratore e l'FFT della risposta a sbalzi. Nella finestra FFT, spostare il cursore verde per leggere la frequenza di risonanza del cantilever.

Un valore tipico della FFT della risonanza dei cantilevers è di circa 200 kilohertz. Immettere il valore di frequenza di risonanza generato nella sezione generale nel campo del centro di frequenza e utilizzare una finestra di frequenza di 50 kilohertz. Fare clic sulla finestra di sintonizzazione dell'impulso laser per selezionare la modalità potenziata della risonanza e impostare una frequenza di impulsi di 222 kilohertz, un intervallo di sintonizzazione di 50 kilohertz e un duty cycle laser del 5%Fare clic acquisire per spazzare la frequenza di impulso del laser.

Utilizzare il cursore per sintonizzare l'impulso laser sulla frequenza della risposta meccanica dell'espansione termica del campione che assorbe la luce IR. Quindi selezionare il ciclo phase locked per monitorare la risonanza di contatto tra il campione e la punta e fare clic su zero. Per altre proprietà chimiche su scala nanometrica, tenere traccia della risonanza di contatto durante l'acquisizione degli spettri per assicurarsi che lo spettro del campione non sia influenzato dal surriscaldamento e dall'ammorbidimento.

Selezionare abilita per tenere traccia del campione per premere la risonanza di contatto e selezionare un guadagno integrale di 0,5 e un guadagno proporzionale di 10, quindi fare clic su OK. Nella finestra di ottimizzazione, fare clic sulla lunghezza d'onda e eseguire la scansione per individuare il laser IR per almeno tre numeri d'onda corrispondenti alle principali bande di assorbanza del campione e per almeno un numero d'onda per ogni chip del laser. Fare clic su strumenti, calibrazione dello sfondo a infrarossi e nuovi e impostare i numeri d'onda su 1200-1800 centimetri. Impostare gli sfondi su una media, il duty cycle del 5% e la velocità di sweep a 100 centimetri al quadrato.

Fare clic su acquire per misurare lo sfondo laser IR per la normalizzazione degli spettri localizzati su nanoscala misurati, salvare il file e chiudere la finestra. Nelle impostazioni degli spettri IR, selezionare una risoluzione dello spettro IR compresa tra uno e quattro centimetri e un numero di co-medie di almeno 64 volte. Quindi fare clic su acquisisci per misurare uno spettro IR localizzato su scala nanometrica nell'intervallo proteico.

Per acquisire una mappa chimica risolta su scala nanometrica, selezionare 1655 centimetri e l'imaging IR e fare clic sulla scansione nella finestra di scansione AFM. Al termine della mappatura, salvare le misurazioni. Quindi utilizzare il software di elaborazione delle immagini AFM integrato per analizzare le mappe acquisite di morfologia, risonanza di contatto e chimica e spettri localizzati su nanoscala.

È un passo fondamentale per ottenere una soluzione monomerica altamente pura in quanto la presenza di specie aggregate può comportare una scarsa riproducibilità della cinetica e introdurre artefatti nelle misurazioni. Un fattore fondamentale per studiare con successo campioni biologici ad alta eterogeneità è la corretta posizione dei substrati solidi. La deposizione di spray microfluidico può essere sfruttata invece di quella manuale al fine di preservare l'architettura e l'eterogeneità del campione.

Questi metodi aprono la strada allo svelamento della struttura chimica e delle proprietà delle singole biomolecole e delle loro interazioni in ambiente liquido fisiologico e nativo.