Tono basale biassiale e test passivi del sistema riproduttivo Murine utilizzando un miografo a pressione
13 agosto 2019
Questo protocollo utilizzava un sistema miografo a pressione disponibile in commercio per eseguire test miografici di pressione sulla vagina murina e sulla cervice. Utilizzando i media con e senza calcio, i contributi del tono basale delle cellule muscolari lisce (SMC) e della matrice extracellulare passiva (ECM) sono stati isolati per gli organi in condizioni fisiologiche stimate.
Questo protocollo indaga le proprietà meccaniche biassiali degli organi riproduttivi che spiegano il contributo delle cellule muscolari lisce e della matrice passiva. Questa tecnica mantiene la geometria dell'organo e le interazioni native del muscolo liscio con le interazioni matriciali permettendo la sottosezione dell'organo a una gamma fisiologica di pressioni ed estensioni assiali. Lo studio della funzione biassiale dell'organo sotto carichi fisiologicamente rilevanti può aiutare a comprendere meglio l'eziologia delle patologie riproduttive.
Testare biassialmente la cervice e la vagina fornisce informazioni sui campi della salute e della biomeccanica delle donne. Metodi simili vengono utilizzati per studiare i vasi sanguigni, l'esofago e l'intestino crasso. Quando si lavora con un nuovo organo, potrebbe essere necessario del tempo per finalizzare i dettagli tecnici come come suturare al meglio il tessuto o come determinare la lunghezza scaricata.
Per raccogliere il sistema riproduttivo dall'animale sperimentale, posizionare il mouse su un cuscinetto assorbente sotto un microscopio sezionante e utilizzare pinzette angolate e forbici per sollevare la pelle intorno all'addome. Fai un'incisione iniziale alla base dell'addome sopra l'osso pubico abbastanza bassa da non forare la parete muscolare addominale e continuare l'incisione in modo superiore verso la gabbia toracica e in profondità attraverso i muscoli addominali. Dopo aver rimosso il grasso superficiale e tagliato attentamente la sinfisi pubica, utilizzare una pinzetta dritta per afferrare la vescica per creare tensione e utilizzare la dissezione smussata per separare il tessuto circostante dalla vagina.
Quindi tagliare la base del sistema riproduttivo per rimuovere i tessuti dalla cavità corporea. Dopo aver determinato la cannula di dimensioni appropriate per il sistema raccolto, montare il lato cervicale sulla porzione del trasduttore di forza del dispositivo di cannula e montare l'estremità opposta dell'organo sulla porzione di micrometro del dispositivo. Quindi stringere entrambe le estremità con suture.
Per trovare la lunghezza scaricata del tessuto montato, allungare prima l'organo in modo che la parete non sia in tensione. Per la vagina, osservare le scanalature sulla parete vaginale. Per la cervice, tagliare immediatamente sotto i punti d'inchiostro situati sopra e sotto il segno centrale della cervice.
Utilizzare pinze per misurare la lunghezza del sistema dalla sutura alla sutura e aumentare la pressione del sistema del miografo da zero a 10 millimetri di mercurio in un millimetro di incrementi di mercurio. La pressione in cui l'organo non è più collassato può essere determinata come il salto più grande nel diametro esterno ad una data pressione. Dopo aver registrato la pressione e il diametro esterno, notare questi dati come il primo punto in cui l'organo non viene collassato e azzerare la forza.
Per trovare l'allungamento sperimentale in vivo, regolare l'organo alla lunghezza in vivo stimata mentre si è alla pressione scaricata e fare clic sull'inizio per valutare i valori di pressione rispetto alla forza per i valori di pressione che vanno dalla pressione scaricata alla pressione massima. Quindi fare clic su Interrompi e salva il file. Per il precondi condizionamento del diametro della pressione, impostare la pressione a zero millimetri di mercurio, la lunghezza alla lunghezza sperimentale in vivo e il gradiente a 1,5 millimetri di mercurio al secondo.
Eseguire una sequenza che porta la pressione da zero millimetri di mercurio alla pressione massima più la pressione scaricata, trattenere per 30 secondi e tornare a zero millimetri di mercurio con un ulteriore periodo di attesa di 30 secondi. Dopo aver ripetuto questa sequenza per un totale di cinque cicli, fare clic su interrompi e salva il file. Per il precondicondizione della lunghezza della forza, inserire 1/3 della pressione massima più la pressione scaricata sia per le pressioni di ingresso che di uscita e regolare l'organo a meno 2% della lunghezza in vivo.
Fare clic sul pulsante start e regolare la lunghezza su più 2% di lunghezza in vivo e tornare a meno 2% a una velocità di 10 micrometri al secondo. Ripetere l'estensione assiale per un totale di cinque cicli prima di fare clic su Interrompi e salva il file. Per il test del diametro della pressione della lunghezza in vivo, fare clic sull'inizio e regolare l'organo sulla lunghezza in vivo, impostare la pressione su zero millimetri di mercurio e impostare il gradiente su 1,5 millimetri di mercurio al secondo.
Aumentare la pressione da zero millimetri di mercurio alla pressione massima prima di riportare la pressione a zero millimetri di mercurio con un periodo di attesa di 20 secondi. Quindi ripetere il test per cinque cicli prima di arrestare il sistema e salvare i dati. Per la prova della lunghezza della forza di 1/3 della pressione massima più la pressione scaricata, impostare la pressione su 1/3 della pressione massima più la pressione scaricata e regolare l'organo a meno 2% della lunghezza in vivo.
Dopo aver fatto clic sull'inizio, allungare l'organo a più il 2% della lunghezza in vivo e tornare a meno 2% della lunghezza in vivo a una velocità di 10 micrometri al secondo. Quindi ripetere il test per un totale di tre cicli prima di arrestare il sistema e salvare i dati. Dopo l'ultimo test, rimuovere il mezzo di prova KRB e lavare l'organo con mezzo KRB privo di calcio.
Dopo il lavaggio, incubare l'organo con una fresca soluzione KRB priva di calcio integrata con eGTA millimolare per 30 minuti prima di sostituire la soluzione di trattamento con KRB fresco privo di calcio. Al termine del test del tono basale, per il precondi condizionamento del diametro della pressione, fare clic sull'inizio e impostare la pressione a zero millimetri di mercurio, la lunghezza come lunghezza stimata in vivo e il gradiente a 1,5 millimetri di mercurio al secondo. Inizia a eseguire una sequenza che porta la pressione da zero millimetri di mercurio alla pressione massima e torna a zero millimetri di mercurio.
Ripetere questo processo attraverso cinque cicli con un tempo di attesa di 30 secondi. Per il precondizione della lunghezza della forza, regolare l'organo alla lunghezza in vivo ed entrare manualmente nella pressione scaricata per entrambe le pressioni. Fare clic sull'inizio e impostare la sfumatura su 1,5 millimetri di mercurio e la pressione su 1/3 del massimo.
Allungare l'organo fino a più 2% e tornare a meno 2% di allungamento a 10 micrometri al secondo e ripetere il ciclo per un totale di cinque volte. Per il test del diametro della pressione, con l'organo a meno 2% della lunghezza in vivo determinata sperimentalmente e la pressione a zero millimetri di mercurio, fare clic sull'inizio e aumentare la pressione da zero millimetri di mercurio alla pressione massima e tornare a zero millimetri di mercurio. Tenere gli zero millimetri di passo del mercurio per 20 secondi e ripetere il ciclo cinque volte.
Per il test della lunghezza della forza, impostare la pressione su una pressione nominale e regolare l'organo a meno 2% della lunghezza in vivo. Allungare l'organo fino a più 2% della lunghezza in vivo e tornare a meno 2% della lunghezza in vivo ad una velocità di 10 micrometri al secondo. Dopo un totale di tre cicli, salvare i dati e ripetere il test della lunghezza della forza per 1/3 della pressione massima, 2/3 della pressione massima e alla pressione massima.
Per un'analisi di successo delle proprietà meccaniche degli organi riproduttivi femminili, è imperativo esplantare le corna uterine nella vagina senza difetti. A seconda del tipo di organo, la dimensione della cannula varierà. La cannulazione deve essere eseguita in modo che l'organo non possa muoversi durante l'esperimento ma senza danneggiare la parete dell'organo durante la procedura.
Il sistema di miografia a pressione può essere utilizzato per monitorare vari aspetti dell'organo mentre viene sottoposto a test meccanici e il sistema ad ultrasuoni può essere utilizzato per misurare lo spessore degli organi nello stato scaricato con e senza tono basale. Dopo le prove meccaniche, i moduli tangenti possono essere calcolati per le direzioni circonferenziale e assiale. Sia il test del tono basale che il test passivo producono proprietà meccaniche chiave del tratto riproduttivo con e senza il contributo contrattile delle cellule muscolari lisce.
Il ridimensionamento tra gli organi richiede alcune regolazioni dei protocolli poiché la cervice e la vagina sperimentano carichi diversi in vivo. È fondamentale eseguire rapidamente la dissezione per mantenere la vitalità delle cellule muscolari lisce ma con attenzione per non forare l'organo desiderato. Gli esperimenti ad angolo di apertura che misurano il ceppo residuo dell'organo possono essere eseguiti dopo procedure di prova meccaniche e vari saggi istologici e biochimici.
Dopo il suo sviluppo e l'indagine del contributo basale delle cellule muscolari lisce, questa tecnica consente anche di valutare la massima risposta contrattile muscolare liscia del sistema riproduttivo sotto carichi fisiologicamente rilevanti.
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Panoramica
Questo protocollo analizza le proprietà meccaniche biaxiali degli organi riproduttivi, concentrandosi sui contributi delle cellule muscolari lisce e della matrice extracellulare passiva. La tecnica preserva la geometria dell'organo e le interazioni native, consentendo test in condizioni fisiologicamente rilevanti.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Biomeccanica
- Salute della donna
- Fisiologia riproduttiva
Sfondo
- Comprendere le proprietà meccaniche degli organi riproduttivi è fondamentale per la salute delle donne.
- Lo studio del contributo delle cellule muscolari lisce può chiarire le patologie riproduttive.
- I metodi di prova biaxiali sono comunemente utilizzati in vari studi biologici.
- I dettagli tecnici sono essenziali per misurazioni accurate nei nuovi studi sugli organi.
Scopo dello studio
- Chiarire le proprietà meccaniche della cervice e della vagina.
- Isolare gli effetti delle cellule muscolari lisce e della matrice extracellulare.
- Migliorare la comprensione della funzione degli organi riproduttivi in condizioni fisiologiche.
Metodi Utilizzati
- Test con micromanometro su vagina e collo dell'utero di topo.
- Utilizzo di mezzi con e senza calcio per valutare i contributi.
- Mantenimento della geometria dell'organo durante i test.
- Applicazione di pressione fisiologica ed estensioni assiali.
Risultati principali
- Approfondimenti sul comportamento meccanico degli organi riproduttivi.
- Identificazione dei ruoli delle cellule muscolari lisce e della matrice extracellulare.
- Ripercussioni potenziali per la comprensione delle patologie riproduttive.
- Confronto con metodologie simili utilizzate nello studio di altri organi.
Conclusioni
- Il test biaxiale fornisce informazioni preziose sulla salute femminile.
- La comprensione della meccanica degli organi può orientare gli approcci clinici alle patologie riproduttive.
- Un'ulteriore affinatura delle tecniche è necessaria per nuovi studi sugli organi.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La valutazione delle proprietà meccaniche biaxiali degli organi riproduttivi consente una riduzione del rischio meccanicistica nella validazione di bersagli per la salute femminile, isolando i contributi del muscolo liscio e della matrice extracellulare. Questo approccio supporta la fiducia predittiva nei modelli preclinici quantificando il tono basale e la meccanica passiva sotto carichi fisiologicamente rilevanti. La metodologia favorisce l'allineamento traslazionale di biomarcatori per i disturbi del pavimento pelvico e l'insufficienza cervicale attraverso un fenotipaggio biomeccanico quantitativo e riproducibile.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Verifica ipotesi terapeutiche misurando il tono basale come la parziale costrizione delle cellule muscolari lisce in assenza di stimolazione ormonale e nervosa.
- Valore operativo: Permette la validazione funzionale degli obiettivi sperimentali separando l'attività delle cellule contrattili dalla meccanica passiva della matrice mediante mezzi privi di calcio e integrati con EGTA.
- Valore predittivo: Supporta la selezione del portafoglio studi identificando alterazioni indotte dalla matrice extracellulare nel fenotipo delle cellule muscolari lisce, correlate alla perdita di forza contrattile nelle patologie riproduttive.
Sviluppo di screening e saggi
- Prontezza del saggio: Prepara sistemi biologici validati per flussi di lavoro successivi, stabilendo i parametri di lunghezza scarica e allungamento in vivo mediante il montaggio su miografo a pressione.
- Risultati quantitativi: Genera misurazioni di diametro in funzione della pressione e di forza in funzione della lunghezza, che consentono la standardizzazione e la riproducibilità nei saggi di fenotipizzazione meccanica.
- Riutilizzo della piattaforma: Permette una valutazione scalabile degli effetti di composti sulla meccanica dei tessuti attraverso cicli di precondizionamento e rampe progressive di pressione/lunghezza.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Rilevanza per la patologia: Modella i cambiamenti patofisiologici della matrice extracellulare associati al prolasso degli organi pelvici e al rimodellamento prematuro della cervice mediante l'analisi della composizione di collagene ed elastina.
- Continuità traslazionale: Collega la scoperta alla validazione preclinica, mettendo in relazione i cambiamenti di rigidità a livello microstrutturale con le alterazioni del fenotipo del muscolo liscio e la disfunzione contrattile.
- Progressione basata sul rischio: Fornisce indicazioni per decisioni di avanzamento o interruzione quantificando in che modo le alterazioni della rigidità della matrice extracellulare modulano l'attività del muscolo liscio e l'integrità meccanica a livello d'organo.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nella biologia della scoperta attraverso la verifica di ipotesi sulle interazioni tra muscolo liscio e matrice, nello screening mediante fenotipizzazione meccanica standardizzata e nella ricerca traslazionale consentendo una continuità preclinica allineata ai biomarcatori per indicazioni legate alla salute delle donne.
- Biologia della scoperta: Supporta la chiarificazione dei percorsi misurando come l'ambiente biochimico e la distensione meccanica alterino le condizioni contrattili del muscolo liscio in stati fisiologici di base.
- Screening: Garantisce la prontezza del saggio mediante precondizionamento pressione-diametro con gradiente di 1,5 mmHg/sec e cicli forza-lunghezza a velocità di 10 µm/sec per stabilizzare la risposta del tessuto.
- Analisi: Fornisce il calcolo dei moduli tangenziali nelle direzioni circonferenziale e assiale, consentendo il confronto quantitativo tra meccanica passiva e contributi contrattili attivi in diverse condizioni.
- Ricerca traslazionale: Si collega alla validazione preclinica valutando come i cambiamenti nella microstruttura della matrice extracellulare influenzino il fenotipo del muscolo liscio e la generazione di forza in modelli rilevanti per la malattia.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile di fenotipizzazione biomeccanica applicabile ai sistemi degli organi vascolare, gastrointestinale e riproduttivo sotto carico fisiologico biaxiale.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Riduce l'ambiguità meccanicistica isolando il tono basale del muscolo liscio dai contributi passivi della matrice extracellulare (ECM) mediante l'utilizzo di mezzi modulati per il calcio.
- Valore operativo: Garantisce standardizzazione attraverso la determinazione della lunghezza scarica mediante scanalature della parete vaginale o punti di inchiostro cervicali e la rilevazione del punto di collasso a pressione zero.
- Valore strategico: Migliora l'efficienza del capitale consentendo un de-risking precoce di bersagli coinvolti in patologie riproduttive guidate da fattori biomeccanici.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione aggiustata per il rischio quantificando come le variazioni nella composizione della matrice extracellulare (collagene I/III/V, elastina, GAG) alterino la rigidità dell'organo e la meccanotrasduzione cellulare.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche in dissezione del tessuto, cannullazione e tecniche di sutura per mantenere la geometria e la vitalità dell'organo.
- È dipendente da strumentazione miografica a pressione in grado di controllare biaxialmente la pressione (0-10 mmHg) e la lunghezza assiale (±2% in vivo).
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro riguardo ai protocolli di lunghezza non caricata e ai cicli di precondizionamento (5x diametro in funzione della pressione, 5x lunghezza in funzione della forza) per stabilire una baseline riproducibile.
- Comporta considerazioni di adattamento relative alla scala specifica dell'organo, a causa dei diversi carichi in vivo tra collo dell'utero e vagina.
- È limitato dai vincoli di vitalità del tessuto, che richiedono una dissezione rapida per preservare la funzionalità delle cellule muscolari lisce, evitando al contempo danni alla parete durante la cannullazione.
