Test immunoistochimico per il rilevamento dell'antigene del lyssavirus da tessuti fissati con formalina

I tessuti utilizzati per l'immunoistochimica e per l'istopatologia diagnostica sono regolarmente fissati in formalina tampone fosfato al 10%. Il rilevamento dell'antigene del virus della rabbia nel tessuto cerebrale che è stato fissato nella formalina presenta una sfida unica e il test IHC è stato trovato un metodo sensibile e specifico per il rilevamento dell'antigene del virus della rabbia. Il vantaggio principale della biopsia o di altri metodi di rilevamento è che gli antigeni possono essere rilevati in relazione alla morfologia tissutale e cellulare.

Con IHC, la localizzazione dell'antigene della rabbia nel cervello e nei tessuti non cerebrali, fornisce ulteriori informazioni che non possono essere ottenute attraverso le sezioni di routine di Ematoxylin e Eosin. Il test diagnostico della rabbia è importante per l'inizio della profilassi post-esposizione negli esseri umani esposti al virus della rabbia. IHC è uno dei saggi più comunemente eseguiti su tessuti fissati alla formalina.

Con anticorpi specifici, può essere utilizzato per il rilevamento dei rispettivi agenti patogeni. Per iniziare questa procedura, posizionare da tre a cinque pezzi millimetrici di tessuto cerebrale, raccolti dopo l'autopsia, in una soluzione di formalina tamponata al 10% per 24-72 ore. Registrare il peso approssimativo del tessuto, il tipo di tessuto e il volume di formalina.

Posizionare i tessuti in etanolo al 70% per una conservazione più lunga del tessuto dopo la fissazione della formalina e prima della lavorazione. Dopo la fissazione del campione, sezionare il tessuto per includere le aree cerebrali importanti, come le sezioni trasversali del tronco cerebrale, il cervelletto o l'ippocampo. Ciascuno, tagliato ad uno spessore compreso tra tre e cinque millimetri.

Posizionare i tessuti in cassette di elaborazione. Elaborare le cassette di tessuto per l'infiltrazione di cera di paraffina. Incorporali in blocchi di paraffina e sezionali su un microtomo.

Impostare innanzitutto la parabola di colorazione come indicato nella Figura 1 del protocollo di testo. Riempire ogni piatto con 250 millilitri della soluzione preparata. Per preparare la soluzione madre del substrato AEC, utilizzare una pipetta di vetro per sciogliere una compressa da 20 milligrammi di AEC in 5 millilitri di N, N-dimetilformammide.

Per preparare la soluzione madre di proteasi, sciogliere 7 milligrammi di proteasi in 200 millilitri di PBS. Per preparare il tampone di risciacquo, aggiungere 100 millilitri di Tween da 80 a 990 millilitri di PBS e mescolare bene per formare una soluzione omogenea di PBT-T. Usando un microtomo, crea una sezione di paraffina di cinque micrometri.

Caricare la sezione a bagnomaria a 38 gradi Celsius e raccoglierla su vetrini. Etichettare i vetrini con una penna resistente ai reagenti. Posizionare i vetrini su un vassoio e sciogliere in forno a 55-60 gradi Celsius per un'ora.

Quindi, rimuovere i vetrini dal forno e deparaffinarli immediatamente, utilizzando 3 risciacqui consecutivi di xilene di 5 minuti ciascuno. Successivamente, reidratare le sezioni sulla diapositiva mediante immersioni sequenziali in diluizioni decrescenti di etanolo in acqua deionizzata, come delineato nel protocollo di testo. Trattare i vetrini con la proteasi per 30 minuti per il recupero dell'antigene proteolitico, quindi risciacquare i vetrini in PBS-T per 10 minuti e trattarli con perossido di idrogeno al 3% per 10 minuti.

Successivamente, lavare nuovamente le diapositive con PBS-T per 10 minuti. Per iniziare, rimuovere una diapositiva dal buffer, assicurandosi di maneggiare solo una diapositiva alla volta, mentre le altre rimangono sommerse, e utilizzare un tovagliolo di carta per eliminare il tampone in eccesso da tutta la sezione del tessuto. Posizionare i vetrini in una camera di umidità e incubare con normale siero di capra a temperatura ambiente per 15 minuti.

Quindi, incubare i vetrini nella camera di umidità con l'anticorpo antirabbico primario di diluizione predeterminato ottimale e gli anticorpi di controllo negativi, a temperatura ambiente per 60 minuti senza lavaggi intermedi. Successivamente, lavare i vetrini con PBS-T per 10 minuti e incubare in una camera di umidità con l'anticorpo biotinilato a temperatura ambiente per 15 minuti. Lavare nuovamente le diapositive con PBS-T per 10 minuti.

Incubare i vetrini e la camera di umidità con strip divide e complesso HRB a temperatura ambiente per 15 minuti e lavare il PBS-T per 10 minuti. Quindi, incubare con AEC in una camera di umidità a temperatura ambiente per 10 minuti. Lavare gli scivoli in acqua deionizzata per 10 minuti e controbattere con Gill's Hematoxilyn, diluito uno o due con acqua deionizzata per due minuti.

Successivamente, risciacquare l'ematossilina in eccesso immergendo i vetrini in acqua deionizzata. Risciacquare i vetrini in Scott's Tap Water per 30 secondi e lavare in acqua deionizzata per 10 minuti. Rimuovere le diapositive una alla volta e montarle con un mezzo di montaggio solubile in acqua.

Quindi, utilizzare un microscopio ottico per leggere le diapositive. In questo studio, viene dimostrato un test di chimica immunocitica per il rilevamento dell'antigene del virus della rabbia come test diagnostico alternativo per i tessuti fissati alla formalina. Qui viene mostrato un risultato rappresentativo della colorazione chimica immunocitica di campioni di controllo positivi e negativi in diversi tessuti cerebrali, tra cui il tronco cerebrale, il cervelletto e le cellule di purkinje e l'ippocampo.

La colorazione rosso magenta, che indica lo sviluppo del colore utilizzando il substrato AEC sullo sfondo blu controcolorato, è dovuta alla reattività degli anticorpi contro l'antigene della rabbia. Un risultato positivo in immunoistochimica corrisponde alla colorazione rosso magenta nelle sezioni tissutali. La colorazione di inclusioni citoplasmatiche e inclusioni granulari di varie dimensioni sono indicative di campioni positivi per infezioni da RABV.

I campioni sono considerati negativi se non è stata osservata alcuna colorazione rossa specifica o solo lo sfondo blu, a causa dell'ematossilina. Oltre alla colorazione positiva, la distribuzione delle inclusioni potrebbe fornire una quantificazione indiretta dei livelli di antigene della rabbia nel campione, che potrebbe corrispondere alla carica virale del campione di tessuto. Indipendentemente dai livelli di distribuzione, qualsiasi colorazione specifica classificherà il campione come positivo per il rilevamento dell'antigene RABV.

I tessuti devono essere fissati adeguatamente in formalina ed evitare di congelare i tessuti durante questo processo. L'antigene della rabbia viene rilevato dall'IHC, quindi le tecniche molecolari possono essere eseguite su sezioni di paraffina per determinare la variante del Lyssavirus in base alle informazioni sulla sequenza dell'RNA. Reagenti come xilene e formalina devono essere maneggiati in cappe aspiranti.

Prestare attenzione durante la manipolazione dell'AEC in quanto è cancerogeno.