Name: Generazione di un modello di ratto di insufficienza epatica acuta combinando il 70% di epatitectomia parziale e acetaminofene (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: Scopri come generare un modello di insufficienza epatica acuta nel ratto combinando epatectomia parziale al 70% e acetaminofene. Questo metodo riproducibile permette di testare nuove terapie per l'insufficienza epatica.

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Questo lavoro è stato sostenuto dalla sovvenzione di base ricevuta dal Dipartimento di Biotecnologia, Governo dell'India all'Istituto Nazionale di Immunologia, Nuova Delhi.

La procedura descritta di seguito è stata approvata dal Comitato Etico Istituzionale degli Animali dell'Istituto Nazionale di Immunologia, Nuova Delhi. Il numero di riferimento seriale dell'omologazione è IAEC-355/14.
1. Preparazione
<ol><li>Preparare la procedura chirurgica come descritto in precedenza da Das B et al.26.</li>
	<li>Usa ratti Wistar inbred di 6-8 settimane con un peso corporeo di 200-250 g.</li>
	<li>Alloggiare gli animali in condizioni standard di cura degli animali e dar loro da mangiare con chow ratto e libitum prima e dopo la procedura.</li>
	<li>Quando si esegue il 70% di PHx, utilizzare un mix cocktail standard di cloridrato di chetamina (100 mg/kg di peso corporeo) e xylazina (10 mg/kg peso corporeo), che viene iniettato intraperitonealmente. NOTA: Il tipo di anestetico utilizzato può avere effetti postoperatori sulla mortalità e la morbilità.</li>
	<li>Durante il trapianto di cellule, utilizzare l'anestesia inalante Isoflurane (2-cloro-2-(difluoromethoxy)-1,1-trifluoro-etano) per ridurre il tempo di recupero dell'animale dopo l'intervento di trapianto.</li>
	<li>Indurre e mantenere l'anestesia inalazionale utilizzando un sistema di anestesia personalizzato. Mantenere il flusso di ossigeno a 4 L/min. Per l'uso a induzione èoflurane al 4% e per l'uso di manutenzione 2-3% durante la procedura chirurgica.</li>
</ol>2. Procedure di preoperatoria
<ol><li>Anestesizzare il ratto iniettando la miscela di chetamina-xilazina descritta al punto 3.1 intraperitonealmente. Confermare l'anestesizzazione completa pizzicando la dita dell'animale. Ulteriori procedure vengono eseguite solo quando non c'è riflesso del pedale.</li>
	<li>Per evitare la disidratazione corneale, applicare un carboxy methyl-cellulosa a base di occhio su entrambi gli occhi.</li>
	<li>Restringere l'animale anestesizzato a una scheda chirurgica utilizzando nastro bianco. Posizionare l'animale con il lato addominale rivolto verso l'alto, assicurandosi che la bocca sia sul lato disfatto dalla persona che esegue l'operazione.</li>
	<li>Rimuovere i capelli dall'area chirurgica addominale in alto a destra utilizzando un clipper elettrico.</li>
	<li>Disinfettare il sito chirurgico con tre scrub alternati di iodio povidone e 70% di etanolo utilizzando batuffoli di cotone sterilizzati in movimento circolare.</li>
</ol>3. Epatectomia parziale (PHx) per rimuovere il 70% della massa del fegato
NOTA: Eseguire l'intera procedura chirurgica in un ambiente sterile in una cappa a flusso laminare. Utilizzare solo strumenti chirurgici sterili per ridurre al minimo il rischio di infezione postchirurgica. La rimozione del 70% della massa epatica, chiamata 70% epatectomia parziale (70% PHx), è stata eseguita come descritto da C. Mitchell e H. Willenbring, 200827.
<ol><li>Prima dell'inizio dell'intervento, confermare l'anestesizzazione completa dell'animale pizzicando il dito del dito del dito. Ulteriori procedure vengono eseguite solo quando non c'è riflesso del pedale.</li>
	<li>Contrassegnare la pelle da tagliare appena sotto lo sterno, perpendicolare allo xifoide e parallelamente alla gabbia toracica.</li>
	<li>Posizionare un foglio di drappo sterile con un'apertura di circa 3 cm x 1 cm sulla pelle marcata.</li>
	<li>Eseguire un'incisione trasversale di circa 2-3 cm lungo la linea marcata con un bisturi. Utilizzare la lama chirurgica n. 22. Rimuovere delicatamente l'attaccamento della pelle allo strato muscolare sottostante in prossimità dell'area incisa utilizzando punte sterili di cotone inumidito.</li>
	<li>Successivamente, fare un'incisione trasversale attraverso lo strato peritoneale appena sotto il processo xifoideo.</li>
	<li>Con l'aiuto di due punte di cotone inumidite salina, esporre il lobo sinistro del fegato applicando una leggera pressione sul torace. Posizionare una punta di cotone sulla regione diaframmatica della porzione incisa e l'altra punta di cotone sotto la regione incisa per sollevare il lobo del fegato.</li>
	<li>Scivolare un anello di filo di nylon sterile lungo 8-10 cm (dimensioni 4-0, diametro di 0,15 mm) intorno al lobo epatico esposto. Prendere l'anello alla base del lobo vicino all'hilum con l'aiuto di pinze microdissecting o cotton fioc inumiditi.</li>
	<li>Con l'aiuto del supporto dell'ago di microchirurgia e delle microforza, legare le due estremità del loop, ponendo il nodo il più vicino possibile alla base del lobo per restringere il vaso sanguigno e ridurre il sanguinamento dopo la rimozione del lobo epatico. Legare due nodi aggiuntivi sull'altro lato.</li>
	<li>Prendere precauzione di non legare il nodo troppo vicino ai vasi sanguigni vicini, che altrimenti possono causare ostruzione venosa (stenosi).</li>
	<li>Utilizzare forbici microchirurgiche per tagliare il lobo legato appena sopra il nodo, che lascia una massa scolorita di tessuto chiamata un ceppo ischemico al posto del lobo. NOTA: Il fegato di ratto, come quelli dei topi, è diviso in quattro lobi distinti: il lobo mediano, il lobo laterale destro, il lobo laterale sinistro e il lobo caudato, che rappresentano rispettivamente circa il 40%, il 20%, il 30% e il 7% della massa epatica totale. Qualsiasi combinazione di questi lobi può essere rimosso per accise 70% massa epatica. Nello studio attuale, il lobo mediano e i lobi laterali sinistri sono stati rimossi.</li>
	<li>Individuare con attenzione il lobo mediano senza danneggiare il resto ceppo del lobo laterale sinistro. Estrarlo delicatamente dalla cavità addominale, e alla base del lobo legare un filo di nylon lungo 8-10 cm (dimensioni 4-0) nodo come accennato in precedenza. Legare due nodi aggiuntivi sull'altro lato. Accisa con attenzione e rimuovere il lobo mediano legato prendendo tutte le precauzioni menzionate.</li>
	<li>Dopo aver rimosso i lobi, suturare il peritoneo utilizzando una sutura cromatica assorbibile 4-0 con punti continui seguiti da sutura della pelle con una sutura interrotta.</li>
	<li>Applicare iodio povidone sulla pelle che circonda le suture per prevenire l'infezione.</li>
	<li>Rimuovere il foglio di drappo e rimuovere l'animale dalla scheda chirurgica.</li>
</ol>4. Cura postoperatoria negli animali
<ol><li>Intraperitonealmente iniettare l'animale con una dose di 12 mg cefotaxime antibiotico in 1 mL di 5% soluzione di glucosio con una siringa da 1 mL per proteggerlo dal rischio di infezione postoperatoria.</li>
	<li>Somministrare un'iniezione sottocutanea di meloxicam analgesica (1 mg/kg di peso corporeo) per alleviare il dolore dopo l'intervento chirurgico e seguirlo da altre due dosi, mantenendo il regime come una dose al giorno.</li>
	<li>Casa gli animali operati in condizioni standard di 12 h ciclo di luce / buio e monitorare a intervalli regolari.</li>
</ol>5. Iniezione di droga in animali parzialmente epatici per indurre l'insufficienza epatica
<ol><li>Dopo 24 ore di postchirurgia, quando gli animali si sono ripresi con successo dal 70% di PHx, misurare il peso corporeo dell'animale seguito dalle iniezioni.</li>
	<li>Iniettare 750 mg/kg di peso corporeo di APAP per via intraperitoneamente in animali parzialmente epatici 24 h dopo il 70% di PHx dopo il recupero riuscito degli animali dalla procedura chirurgica. Ripetere di nuovo la dose dopo 24 h. NOTA: Due dosi di APAP vengono somministrate intraperitonealmente all'animale (rispettivamente 24 h e 48 h post della procedura PHx del 70%).</li>
	<li>Ad ogni momento dopo l'iniezione di APAP, misurare il peso corporeo dell'animale in recupero. NOTA: L'APAP (biocetamolo) viene iniettato negli animali come soluzione da 150 mg/mL nel 2% di alcool benzile.</li>
</ol>6. Trapianto di epatociti sani in modelli animali ALF
NOTA: Per studiare la reversibilità di ALF nei ratti, trapiantare epatociti di ratti sinugenici sani intrasplenically negli animali indotti da ALF insieme alladose di APAP. Nello studio attuale, per fornire ampio tempo alle cellule trapiantate per l'homing e l'innesto, il trapianto è stato fatto subito dopo aver dato ladose di APAP. Gli epatociti rattociti sono isolati da un protocollo pubblicato prima da Berry and Friends et al.28 e successivamente adattati in vari altri studi29,30,31 con alcune modifiche. Per il trapianto intrasplenico di cellule nel modello animale ALF, seguire i passaggi indicati di seguito.
<ol><li>Mettere il ratto in una camera poli (methacritillato metilico) per l'induzione dell'anestesia con 4% di isoflurane e 4 L/min flusso di ossigeno per un ratto di 250-350 g di peso corporeo. Controllare la profondità dell'anestesia per la mancanza di riflessi del pedale quando si pizzica la punta dell'animale.</li>
	<li>Posizionare il ratto anatizzato sulla scheda chirurgica in modo che la sua parte laterale sinistra sia rivolta verso l'alto. Mantenere l'anestesia al 2-3% di inalazione isoflurane attraverso un boccaglio adatto.</li>
	<li>Rasare la pelle sulla regione laterale sinistra e sterilizzarla con soluzione di iodio povidone.</li>
	<li>Fare un'incisione trasversale sulla regione rasata della pelle.</li>
	<li>Fate un taglio di 1-2 cm nello strato peritoneale per esporre la milza.</li>
	<li>Estrarre delicatamente la milza della cavità peritoneale e sollevarla con l'aiuto di due punte di cotone inumidite.</li>
	<li>Mantenere le cellule (tipicamente 107 per animale) da trapiantare sospese in supporti IMDM da 50 anni in una siringa di insulina da 1 mL con un ago da 29 G.</li>
	<li>Forare delicatamente l'ago nella corteccia della milza e rilasciare la sospensione cellulare nella milza entro 2-3 min.</li>
	<li>Dopo aver completato il trapianto di cellule, estrarre con attenzione l'ago e tamponare l'area della puntura dell'ago con una punta di cotone inumidita per evitare perdite della sospensione cellulare dal sito.</li>
	<li>Chiudere il peritoneo e la pelle con una sutura assorbibile 4-0 con sutura continua e discontinua rispettivamente.</li>
	<li>Applicare la soluzione di iodio povidone sulla pelle sul posto delle suture per prevenire l'infezione sul sito azionato.</li>
	<li>Intraperitonemente iniettare 1 mL di 12 mg/mL di soluzione antibiotica (ad esempio cefotaxime) soluzione e sottocutaneamente iniettare analgesico (ad esempio, meloxicam) 1 peso corporeo di 1 mg/kg per l'animale come parte delle cure postoperatorie. Spostare l'animale in una gabbia calda di recupero.</li>
	<li>Mantenere l'animale operato in isolamento in condizioni normali di 12 h ciclo leggero / scuro fino a quando le ferite chirurgiche sono completamente guarite. L'operazione potrebbe richiedere da 3 a 4 giorni.</li>
</ol>7. Caratterizzazione dello sviluppo ALF
<ol><li>Eutanasia gli animali per sovradosaggio di chetamina-xylazina soluzione 2 h dopo la dose 2nd di trattamento APAP e raccogliere campioni di sangue e tessuti.</li>
	<li>Raccogliere il siero dal sangue per studi biochimici32.</li>
	<li>Elaborare campioni di tessuto epatico per studi istologici e di espressione genica33,34,35.</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Lo sviluppo di un modello animale appropriato per ALF è fondamentale per una migliore comprensione della patogenesi e della progressione di ALF. Un modello animale ALF ben caratterizzato offre anche l'opportunità per lo sviluppo e la sperimentazione di nuovi approcci terapeutici contro ALF. Sono stati fatti molti tentativi per sviluppare un modello clinicamente rilevante di ALF6,12,21,23,<...

L'insufficienza epatica acuta (ALF) è definita dall'Associazione Americana per lo Studio delle Malattie del Fegato come rapido sviluppo di lesioni epatiche acute senza segni previi di danno ed è caratterizzata da una grave compromissione delle funzioni sintetiche, metaboliche e disintossicanti del fegato1. ALF si differenzia dall'insufficienza epatica cronica in cui l'insufficienza si verifica a causa di lesioni epatiche causate per un lungo periodo di tempo e da insufficienza epatica cronica acuta (ACLF), dove si verificano danni epatici bruschi a causa di malattie epatiche croniche2,3,4. L'unica cura disponibile per ALF è il trapianto di fegato ortotopico (OLT), o la morte può verificarsi. A causa della carenza di donatori di fegato, il tasso di mortalità nei pazienti affetti da ALF è molto alto.
Per studiare il potenziale di approcci terapeutici alternativi e per comprendere meglio la fisiofisiologia dell'ALF, sono necessari modelli animali che possano riflettere l'ALF che si verifica negli esseri umani. Molti dei modelli animali ALF già disponibili presentano diverse carenze. Gli effetti dell'acetaminofene (APAP) sono difficili da riprodurre, ma hanno le somiglianze più vicine in termini di parametri temporali, clinici, biochimici e patologici. I modelli animali indotti da APAP- incontrano spesso problemi dovuti alla presenza di methemoglobinemia causata dall'ossidazione dell'emoglobina da parte dell'APAP e dei suoi intermedi5,6,7. Un altro problema è la mancanza di riproducibilità riflessa da risposte imprevedibili alla dose e l'ora della morte. I modelli animali ALF prodotti con tetra cloruro di tetra di carbonio (CCl4) hanno scarsa riproducibilità8,9,10,11. I modelli animali ALF indotti da Concavalin A (Con A) e lipoplysaccharide (LPS) non riflettono il modello clinico della malattia umana, anche se hanno vantaggi nello studio dei meccanismi cellulari coinvolti nelle malattie epatiche autoimmuni e nello studio della sepsi rispettivamente12,13,14,15. Allo stesso modo, la tioacetamide (TAA) richiede anche la biotrasformazione in un metabolita attivo di tioacetamide e mostra la variazione delle specie16,17,18,19. D-galactosamine (D-Gal) produce alcuni cambiamenti biochimici, metabolici e fisiologici simili a ALF ma non è in grado di riflettere l'intera condizione patologica ALF20,21,22,23. Ci sono stati pochissimi tentativi di combinare due o più di questi metodi per sviluppare un modello ALF che è in grado di riflettere la sindrome ALF in modo migliore13. Pertanto, sono necessari ulteriori studi per sviluppare un modello in grado di riflettere i parametri della malattia, ha una migliore riproducibilità e fornisce abbastanza tempo per studiare gli effetti di un intervento terapeutico.
Nello studio attuale, è stato creato un modello alternativo ALF nei ratti combinando gli effetti dell'epatectomia parziale (PHx) e le dosi più basse di un reagente epatotossico. APAP ha un ruolo ben consolidato nel causare lesioni epatiche5,24,25. È un analgesico ampiamente usato ed è tossico per il fegato a dosi sopraterapeutiche formando metaboliti tossici. L'APAP è la causa di molti decessi nei paesi sviluppati. La lesione fisica causata dall'epatectomia parziale avvia l'attivazione di vari processi coinvolti nell'infiammazione e nella rigenerazione del fegato. L'iniezione dell'agente epatotossico APAP provoca un ambiente ostile nel fegato, impedendo la proliferazione di epatociti. Questo riduce il periodo di stress sull'animale, che quando combinato con piccole dosi di epatotossina, porta a una migliore riproducibilità della procedura. Pertanto, utilizzando questo modello, è stato studiato un effetto combinatorio di due tipi di lesioni epatiche. Per caratterizzare il modello animale ALF sviluppato, sono stati studiati i parametri fisiologici e biochimici. Una corretta reversibilità di ALF è stata confermata dal trapianto di epatociti di ratto sano singenico.

<table><tbody><tr><td>Paracetamolo (Biocetamolo)</td><td>EG Pharmaceuticals</td><td></td><td>Nessun numero di catalogo specifico (Approvvigionamento locale)</td></tr><tr><td>Kit di fosfatasi alcalina (DEA)</td><td>Coral Clinical System, India</td><td></td><td>Nessun numero di catalogo specifico (Approvvigionamento locale)</td></tr><tr><td>Analizzatore automatizzato</td><td>Tulip, Alto Santracruz, India</td><td>Screen Maaster 3000</td><td>Analizzatore biochimico per test funzionali epatici</td></tr><tr><td>Betadine ( Soluzione di iodio povidon)</td><td>Win-Medicare; India</td><td></td><td>Nessun numero di catalogo specifico (Approvvigionamento locale)</td></tr><tr><td>Armadio di sicurezza biologica (Classe I)</td><td>Kartos international; India</td><td></td><td>Nessun numero di catalogo specifico (approvvigionamento locale)</td></tr><tr><td>Microscopio a campo chiaro</td><td>Olympus, Giappone</td><td>LX51</td><td></td></tr><tr><td>Cefotaxime (Taxim&reg;)</td><td>AlKem; India</td><td></td><td>cefotaxima sodio iniezione, nessun numero di catalogo specifico (approvvigionamento locale)</td></tr><tr><td>Cell Strainer</td><td>Sigma; US</td><td>CLS431752</td><td></td></tr><tr><td>Collagenasi Tipo I</td><td>Gibco di Life Technologies</td><td>17100-017</td><td></td></tr><tr><td>Cotton Buds</td><td>Pure Swabs Pvt Ltd; India</td><td></td><td>Nessun numero di catalogo specifico (approvvigionamento locale)</td></tr><tr><td>Foglio di tende</td><td>JSD Surgicals, Delhi, India</td><td></td><td>Nessun numero di catalogo specifico (approvvigionamento locale)</td></tr><tr><td>DPX Mountant</td><td>Sigma; US</td><td>6522</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di eosina Y,</td><td>Sigma alcolico; US</td><td>HT110132</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Major Surgicals; India</td><td></td><td>Nessun numero di catalogo specifico (Approvvigionamento locale)</td></tr><tr><td>Sistema di anestesia dei gas</td><td>Ugo Basile; Italia</td><td>211000</td><td></td></tr><tr><td>Glucosio</td><td>Himedia, India</td><td>GRM077</td><td></td></tr><tr><td>Crema depilatoria (Veet&reg;)</td><td>Reckitt Benckiser, India</td><td></td><td>Nessun numero di catalogo specifico (approvvigionamento locale)</td></tr><tr><td>Soluzione di ematossilina, Mayer's</td><td>Sigma; US</td><td>MHS16</td><td></td></tr><tr><td>Eparina sale sodico</td><td>Himedia; India</td><td>RM554</td><td></td></tr><tr><td>Ialuronidasi da Pecora Testes</td><td>Sigma; US</td><td>H6254</td><td></td></tr><tr><td>Cannula I.V. (Plusflon)</td><td>Mediplus, India</td><td>Ref 1732411420</td><td></td></tr><tr><td>Siringhe da insulina</td><td>BD; US</td><td>REF 303060</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano (Forano&reg;)</td><td>Asecia Queenborough</td><td>No B506</td><td>Anestetico per inalazione</td></tr><tr><td>Ketamina (Ketamax&reg;)</td><td>Troikaa Pharmaceuticals Ltd.</td><td></td><td>Ketamina cloridrato IP, nessun numero di catalogo specifico (approvvigionamento locale)</td></tr><tr><td>Meloxicam (Melonex&reg;)</td><td>Intas Pharmaceuticals Ltd; India</td><td></td><td>Nessun numero di catalogo specifico (Approvvigionamento locale)</td></tr><tr><td>Micro portaaghi dritto & curvo</td><td>merciano; Inghilterra</td><td>BS-13-8</td><td></td></tr><tr><td>Micro portaaghi dritto & curvo</td><td>merciano; Inghilterra</td><td>BS-13-8</td><td></td></tr><tr><td>Microtomo</td><td>Histo-Line Laboratories, Italia</td><td>MRS3500</td><td></td></tr><tr><td>Filo di nylon</td><td>potente; India</td><td></td><td>Nessun numero di catalogo specifico (Approvvigionamento locale)</td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Himedia; India</td><td>GRM 3660</td><td></td></tr><tr><td>Percoll&reg;</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0891-01</td><td></td></tr><tr><td>Gel per lacrime/nebbia per occhi</td><td>Allergan India Private Limited/Sun Pharma, India</td><td>P3060</td><td>Nessun numero di catalogo specifico</td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Himedia; India</td><td></td><td>Nessun numero di catalogo specifico (approvvigionamento locale)</td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>Major Surgicals; India</td><td></td><td>Nessun numero di catalogo specifico (approvvigionamento locale)</td></tr><tr><td>Forbici</td><td>Major Surgicals; India</td><td></td><td>Nessun numero di catalogo specifico (Approvvigionamento locale)</td></tr><tr><td>SGOT (ASAT) KIT</td><td>Coral Clinical System, India</td><td></td><td>Nessun numero di catalogo specifico (Approvvigionamento locale)</td></tr><tr><td>SGPT (ALAT) KIT</td><td>Coral Clinical System, India</td><td></td><td>Nessun numero di catalogo specifico (Approvvigionamento locale)</td></tr><tr><td>Shandon Cryotome E Cryostat</td><td>Thermo Electron Corporation; Stati Uniti</td><td></td><td>Nessun numero di catalogo specifico</td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>Sigma; US</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Lama chirurgica n. 22</td><td>La Medcare, India</td><td></td><td>Nessun numero di catalogo specifico (approvvigionamento locale)</td></tr><tr><td>Scheda chirurgica</td><td>Prodotta</td><td></td> localmente <td>Nessun numero di catalogo specifico (approvvigionamento locale)</td></tr><tr><td>Nastro bianco chirurgico</td><td>3M India; India</td><td>1530-1</td><td>Suture a nastro chirurgico microporoso</td></tr><tr><td></td><td>Ethicon, Johnson & Johnson, India</td><td>NW 5047</td><td></td></tr><tr><td>Siringhe (1ml, 26 G)</td><td>Dispo Van; India</td><td></td><td>Nessun numero di catalogo specifico (Approvvigionamento locale)</td></tr><tr><td>Trimmer (Clipper)</td><td>Philips</td><td>NL9206AD-4 DRACHTEN QT9005</td><td></td></tr><tr><td>Pesatrice</td><td>Braun</td><td></td><td>Nessun numero di catalogo specifico (Approvvigionamento locale)</td></tr><tr><td>William's E Media</td><td>Himedia; India</td><td>AT125</td><td></td></tr><tr><td>Xilazina (Xylaxin&reg;)</td><td>Immunologici indiani limitati</td><td></td><td>Sedativo, pre-anestetico, analgesico e miorilassante</td></tr></tbody></table>

generazione di un modello di ratto di insufficienza epatica acuta combinando il 70% di epatitectomia parziale e acetaminofene

Generation of a Rat Model of Acute Liver Failure by Combining 70% Partial Hepatectomy and Acetaminophen

L'insufficienza epatica acuta (ALF) è una condizione clinica causata da varie eziologie con conseguente perdita di funzioni metaboliche, biochimiche, sintetizzanti e disintossicanti del fegato. Nella maggior parte dei casi di danni al fegato irreversibili, trapianto di fegato ortotropico (OLT) rimane l'unico trattamento disponibile. Per studiare il potenziale terapeutico di un trattamento per ALF, è essenziale il suo test precedente in un modello animale di ALF. Nello studio attuale, è stato sviluppato un modello ALF nei ratti combinando il 70% di epatectomia parziale (PHx) e iniezioni di acetaminofene (APAP) che fornisce una finestra terapeutica di 48 h. I lobi laterali mediani e lasciati del fegato sono stati rimossi per accise 70% della massa epatica e APAP è stato dato 24 h postchirurgico per 2 giorni. La sopravvivenza negli animali indotti da ALF è risultata essere gravemente diminuita. Lo sviluppo di ALF è stato confermato da livelli alterati di siero degli enzimi alanine aminoasi (ALT), aminoatomomomomomosoe aspartato (AST), fosfatosi alcalina (ALP); cambiamenti nel tempo protrombina (PT); e valutazione del rapporto internazionale normalizzato (INR). Lo studio del profilo di espressione genica da parte di qPCR ha rivelato un aumento dei livelli di espressione dei geni coinvolti nell'apoptosi, nell'infiammazione e nella progressione della lesione epatica. La degenerazione diffusa degli epatociti e l'infiltrazione delle cellule immunitarie è stata osservata mediante valutazione istologica. La reversibilità di ALF è stata confermata dal ripristino dei livelli di sopravvivenza e siero di ALT, AST e ALP dopo il trapianto intrasplenico di epatociti di ratti sani sinosgenici. Questo modello presenta un'alternativa affidabile ai modelli animali ALF disponibili per studiare la fisiofisiologia di ALF e per valutare il potenziale di una nuova terapia per ALF. L'uso di due approcci diversi consente inoltre di studiare l'effetto combinato delle lesioni epatiche fisiche e indotte da farmaci. La riproducibilità e la fattibilità della procedura corrente è un ulteriore vantaggio del modello.

Percentuale di sopravvivenza nei modelli animali di ALF La dose ottimale di APAP per causare ALF in combinazione con 70% PHx è stato standardizzato come 750 mg/kg peso corporeo. Il regime di trattamento è iniziato 24 h dopo 70% PHx, quando gli animali si erano completamente ripresi dall'intervento chirurgico, e consisteva di due dosi di APAP a intervalli di 24 h. La mortalità è stata osservata al tasso dell'80% dopo la somministrazione della seconda dose di APAP, 48 h post-intervento chirurgico. La pe...

Il modello animale acuto di insufficienza epatica sviluppato nell'attuale studio presenta un'alternativa fattibile per lo studio di potenziali terapie. L'attuale modello utilizza l'effetto combinato di lesioni epatiche fisiche e farmacologiche e fornisce una finestra temporale adatta per studiare il potenziale di nuove terapie.

Generazione di un modello di ratto di insufficienza epatica acuta combinando il 70% di epatitectomia parziale e acetaminofene

Acute liver failure (ALF) is a clinical condition caused by various etiologies resulting in the loss of metabolic, biochemical, synthesizing, and ...

L'insufficienza epatica acuta o ALF è generalmente definita come rapido sviluppo di lesioni epatiche in un fegato sano ed è accompagnata da una grave compromissione delle sue principali funzioni. Il trapianto di fegato ortotopico è l'unica cura disponibile nella maggior parte dei casi. Ma a causa della carenza di donatori di fegato, il tasso di mortalità nei pazienti affetti da ALF è molto alto.Per studiare il potenziale di approcci terapeutici alternativi e per comprendere meglio la fisiopatologia dell'ALF, vengono utilizzati modelli animali della malattia. Molti dei modelli ALF sono basati sugli effetti epatotossici dell'acetaminofene, del tetracloruro di carbonio, della concanavalina A, del lipolisaccaride, della D-galattosammina e della tioacetamide. Tuttavia, questi hanno diverse carenze come scarsa riproducibilità e reversibilità, tossicità per altri organi vitali, scarso riflesso della patologia delle malattie umane e variazione delle specie.Pertanto, è necessario un sistema modello migliore che sia riproducibile e consenta un intervallo di tempo sufficiente per studiare gli effetti di un intervento terapeutico. Nello studio attuale, un modello ALF nei ratti è stato creato combinando gli effetti dell'epatomia parziale e dell'epatotossicità dell'acetaminofene. Il lobo laterale mediano e sinistro del fegato viene rimosso ad accisa al 70% di massa epatica e, inoltre, l'acetaminofene viene somministrato per causare ALF.Lo sviluppo di ALF nel modello è stato caratterizzato da analisi biochimiche e istologiche e la reversibilità dei danni al fegato è stata confermata dal trapianto di epatociti sigeneici sani del ratto. I ratti Wistar con peso corporeo nell'intervallo da 180 a 250 grammi sono stati utilizzati nello studio attuale. I seguenti passaggi descrivono la procedura chirurgica per l'induzione di ALF in un ratto.L'animale viene anestetizzato iniettando miscela ketamina-xiazina per via intraperitoneale. L'anestesia completa è confermata pizzicando la dita dei piedi dell'animale e ulteriori procedure vengono eseguite solo quando non c'è riflesso del pedale. Per prevenire l'essiccazione corneale, un colliro a base di carbossimetilcellulosa viene applicato su entrambi gli occhi.L'animale viene trattenuto sulla tavola chirurgica usando un nastro bianco. I capelli vengono rimossi dall'area chirurgica addominale superiore destra utilizzando un clipper elettrico. Disinfettare il sito chirurgico con tre scrub alternati di 70%etanolo e povidone iodio utilizzando batuffoli di cotone sterilizzati in movimento circolare.La pelle da tagliare è marcata appena sotto lo sterno perpendicolare allo xifoide e parallela alla gabbia toracica. Un foglio di drappeggio sterile con un'apertura di circa tre centimetri per un centimetro viene posizionato sulla pelle marcata. Un'incisione trasversale di circa due o tre centimetri viene effettuata lungo la linea contrassegnata con l'aiuto di un bisturi.L'attacco della pelle con strato muscolare sottostante in prossimità dell'area incisa viene delicatamente rimosso da punte sterili in cotone inumidito. Successivamente, un'incisione trasversale viene effettuata attraverso lo strato peritoneale appena sotto il processo xifoide. Il lobo sinistro del fegato è esposto dando una leggera pressione al torace con l'aiuto di due punte di cotone inumidito salina.Un anello sterile di filo di nylon viene scivolato intorno al lobo del fegato esposto. L'anello viene accuratamente portato alla base del lobo con l'aiuto di micro forcelle di sezionazione o cotton fioc. Con l'aiuto del supporto dell'ago di microchirurgia e dei micro pini, le due estremità del ciclo sono legate, posizionando il nodo il più vicino possibile alla base del lobo.Questo per restringere i vasi sanguigni e ridurre il sanguinamento dopo la rimozione del lobo epatico. Due nodi aggiuntivi sono legati dall'altra parte. Il lobo legato viene tagliato appena sopra il nodo usando forbici in microchirurgia che lascia un ceppo ischemico.Allo stesso modo, il lobo mediano del fegato viene sollevato usando punte di cotone. Riconoscere la forma unica del lobo mediano del fegato. Posizionare un anello di filo di nylon sul lobo, legare saldamente le estremità.Due nodi aggiuntivi sono legati sull'altro lato e rispecchiano il lobo. Dopo aver rimosso i lobi, il peritoneo viene suturato utilizzando sutura cromata catgut 4/0 assorbibile assorbibile con punti continui seguita da sutura della pelle con semplice sutura interrotta. Dopo la chiusura della pelle, la soluzione di iodio povidone viene applicata intorno al sito chirurgico.Il foglio del drappo viene rimosso e l'animale viene tolto dal comitato di chirurgia. Una dose antibiotica di 12 milligrammi di cefotaxime in un ml di soluzione di glucosio al 5% viene somministrata per via intraperitoneale all'animale per proteggerlo dal rischio di infezione postoperatoria. Per il sollievo dal dolore dopo l'intervento chirurgico, la meloxicam analgesica, in genere 1 mg per kg di peso corporeo viene somministrata per via sottocutanea all'animale, seguita da una dose ogni giorno per due giorni.L'animale viene spostato in una gabbia di recupero calda. L'animale diventa cosciente entro 30-40 minuti e inizia a muoversi. L'animale operato viene tenuto in isolamento fino a quando le ferite chirurgiche non sono completamente guarite, il che può richiedere da tre a quattro giorni.Per l'induzione di ALF, 750 milligrammi per kg di peso corporeo di acetaminofene e la seconda dose di meloxicam viene iniettata per via intraperitoneale 24 ore dopo la procedura parziale di epatomia. Questo regime di dose viene ripetuto dopo 24 ore. Dopo l'induzione dell'ALF, la sopravvivenza negli animali è stata gravemente ridotta.Per caratterizzare lo sviluppo dell'ALF, gli animali utilizzati sono stati eutanasiati dopo la seconda dose di acetaminofene e sono stati effettuati vari studi biochimici e istologici. I risultati sono descritti in anticipo nel video. La percentuale di sopravvivenza nel gruppo indotto dall'ALF è stata notevolmente diminuita e fino all'80% di mortalità è stata osservata entro 24 ore dalla seconda dose di acetaminofene.I danni al fegato erano evidenti a livello morfologico nel gruppo indotto dall'ALF e solo nel 70% in un gruppo parziale di epatotectomia. Mentre il gruppo di controllo e solo il gruppo trattato con acetaminofene avevano un aspetto sano. I livelli enzimatici di alanina amminotransferasi, aspartato amino transferasi e fosfatasi alcalina sono risultati altamente elevati nel gruppo indotto da ALF rispetto ad altri gruppi.L'analisi del profilo di espressione genica da parte del qPCR ha mostrato un'elevata espressione dei geni coinvolti nell'apoptosi, nell'infiammazione e nella progressione della lesione epatica. La colorazione ematossilina ed eosina delle sezioni del tessuto epatico ha rivelato per lo più epatociti normali nel gruppo di controllo. Nel gruppo ALF, è stata osservata una degenerazione grassa macro vescicolare per lo più moderata.Il tempo di protrombina e il rapporto normalizzato internazionale sono risultati elevati nel gruppo indotto da ALF, indicando un processo di coagulazione del sangue ostacolato. La percentuale di sopravvivenza è stata ripristinata nel gruppo indotto da ALF dopo il trapianto di epatociti sigeneici sani del ratto. I livelli sieri di enzimi alanina aminotransferasi, aspartato aminotransferasi e fosfatasi alcalina sono stati trovati restaurati negli animali indotti dalla ALF dopo il trapianto di cellule.Questo metodo di induzione dell'ALF nei ratti è riproducibile, mostra una buona reversibilità e fornisce un'adeguata finestra di tempo per testare nuove terapie. Pertanto, questo modello può servire come modello di malattia efficiente per la valutazione di potenziali approcci terapeutici per trattare l'ALF.

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Trapianto di fegato nei ratti è un modello sperimentale indispensabile per la ricerca biomedica. Qui vi presentiamo le nostre procedure chirurgiche per il trapianto ortotopico di fegato di ratto con la ricostruzione arteriosa epatica con un trapianto parziale del 50%.

Procedure chirurgiche per un modello di Rat parziale trapianto di fegato con la ricostruzione arteriosa epatica

Trapianto di fegato ausiliario fornisce un supporto temporaneo in insufficienza epatica acuta, fino a quando la rigenerazione del fegato fallire. Il trapianto eterotopico ausiliario di fegato (HALT) con arterialization vena porta (PVA) rende del fegato è sufficiente. Abbiamo sviluppato una tecnica analoga nel ratto, di esaminare l'influenza del arterialization vena porta sulla morfologia e la funzione del trapianto.

Eterotopica ausiliario Ratto trapianto di fegato con flusso regolato Portal Vein arterialization in acuta insufficienza epatica

Descriviamo un metodo per produrre un modello animale di fibrosi epatica nel ratto e valutiamo il grado di fibrosi mediante esame istologico del fegato. Il modello può essere utilizzato per studiare lo sviluppo della malattia epatica e per testare l'efficacia di potenziali agenti antifibrotici.

Il dimetilnitrosamina indotta fibrosi epatica modello nel ratto

Un modello di morsetto ilare unico fegato di ratto è stato sviluppato per studiare l'impatto di molecole farmacologiche nel migliorare danno da ischemia-riperfusione. Questo modello include incannulazione diretta della fornitura portale per il segmento epatico ischemico tramite un ramo della vena porta, consentendo la consegna epatica diretta.

Metodo di consegna diretta segmentale intra-epatico utilizzando un modello di fegato di ratto Hilar morsetto

Indurre ipertrofia epatica rapida utilizzando associando i fegato partizione e legatura della vena portale per un'epatectomia Staged (ALPPS) è stato proposto per la resezione dei tumori del fegato resecabile limite. Questo modello può delucidare i meccanismi coinvolti nell'ipertrofia rapido e permette di testare farmaci che promuovono o bloccano l'accelerazione della rigenerazione.

Modello del ratto della partizione del fegato associando i e legatura della vena portale per procedura di messa in scena epatectomia (ALPPS)

Qui descriviamo un metodo comune per indurre la lesione cronica del fegato nei topi di alimentazione di una dieta di colina-carenti ed etionina-completati (CDE). Dimostriamo che la sorveglianza sanitaria, aspersione epatica, isolamento e conservazione. Un corso di sei settimane di tempo può informare circa il disturbo al fegato, pathohistology, fibrosi, infiammatoria e risposte delle cellule progenitrici del fegato.

La murino colina-carenti, etionina-completati (CDE) dieta modello della lesione epatica cronica

Qui, un protocollo che coinvolge il trapianto di fegato parziale ri-arterialized ratto è presentato. In particolare, 70% fegato è stato resecato in vivo utilizzando una tecnica aggiornata di hepatectomy orientato alla nave. L'arteria epatica è stato ricostruito in maniera fine--lato. La tecnica del polsino è stata modificata per accorciare i tempi di anastomosi della vena cava infrahepatic.

Ri-Arterialized trapianto parziale di fegato del ratto con un in vivo vaso-Oriented 70% Hepatectomy

Qui, presentiamo un nuovo metodo per la resezione parziale del lobo epatico di sinistra in topi neonatali (giorno 0). Questo nuovo protocollo è adatto per lo studio delle lesioni epatiche acute e risposta di lesione in ambito neonatale.

Epatectomia parziale lobulare: Un modello chirurgico per rigenerazione epatica morfologica

Questo protocollo descrive un metodo comune e fattibile per indurre lesioni epatiche acute (ALI) tramite l'esposizione di CCl4 attraverso un tubo orogastrico. L'esposizione a CCl4 induce ALI attraverso la formazione di specie reattive dell'ossigeno durante la sua biotrasformazione nel fegato. Questo metodo viene utilizzato per analizzare la fisiopatologia di ALI ed esaminare diverse strategie eaptoprotettive.

Indurre lesioni acute al fegato nei ratti tramite Carbon Tetrachloride (CCl4) Esposizione attraverso un tubo orogastrico

Il modello murino di epatectomia parziale 2/3 (66%) è ben descritto in letteratura, ma sono state raramente utilizzate epatectomie più estese che imitano la sindrome di piccole dimensioni dopo trapianto di fegato. Descriviamo una procedura di epatectomia estesa al 78% in un modello murino che si traduce in circa il 50% di letalità postoperatoria nei topi sani.

Epatectomia estesa al 78% in un modello chirurgico murino

Scopri come generare un modello di insufficienza epatica acuta nel ratto combinando epatectomia parziale al 70% e acetaminofene. Questo metodo riproducibile permette di testare nuove terapie per l'insufficienza epatica.

Generazione di un modello di ratto di insufficienza epatica acuta combinando il 70% di epatitectomia parziale e acetaminofene

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