Generazione di un modello di ratto di insufficienza epatica acuta combinando il 70% di epatitectomia parziale e acetaminofene
November 27th, 2019
Il modello animale acuto di insufficienza epatica sviluppato nell'attuale studio presenta un'alternativa fattibile per lo studio di potenziali terapie. L'attuale modello utilizza l'effetto combinato di lesioni epatiche fisiche e farmacologiche e fornisce una finestra temporale adatta per studiare il potenziale di nuove terapie.
L'insufficienza epatica acuta o ALF è generalmente definita come rapido sviluppo di lesioni epatiche in un fegato sano ed è accompagnata da una grave compromissione delle sue principali funzioni. Il trapianto di fegato ortotopico è l'unica cura disponibile nella maggior parte dei casi. Ma a causa della carenza di donatori di fegato, il tasso di mortalità nei pazienti affetti da ALF è molto alto.
Per studiare il potenziale di approcci terapeutici alternativi e per comprendere meglio la fisiopatologia dell'ALF, vengono utilizzati modelli animali della malattia. Molti dei modelli ALF sono basati sugli effetti epatotossici dell'acetaminofene, del tetracloruro di carbonio, della concanavalina A, del lipolisaccaride, della D-galattosammina e della tioacetamide. Tuttavia, questi hanno diverse carenze come scarsa riproducibilità e reversibilità, tossicità per altri organi vitali, scarso riflesso della patologia delle malattie umane e variazione delle specie.
Pertanto, è necessario un sistema modello migliore che sia riproducibile e consenta un intervallo di tempo sufficiente per studiare gli effetti di un intervento terapeutico. Nello studio attuale, un modello ALF nei ratti è stato creato combinando gli effetti dell'epatomia parziale e dell'epatotossicità dell'acetaminofene. Il lobo laterale mediano e sinistro del fegato viene rimosso ad accisa al 70% di massa epatica e, inoltre, l'acetaminofene viene somministrato per causare ALF.
Lo sviluppo di ALF nel modello è stato caratterizzato da analisi biochimiche e istologiche e la reversibilità dei danni al fegato è stata confermata dal trapianto di epatociti sigeneici sani del ratto. I ratti Wistar con peso corporeo nell'intervallo da 180 a 250 grammi sono stati utilizzati nello studio attuale. I seguenti passaggi descrivono la procedura chirurgica per l'induzione di ALF in un ratto.
L'animale viene anestetizzato iniettando miscela ketamina-xiazina per via intraperitoneale. L'anestesia completa è confermata pizzicando la dita dei piedi dell'animale e ulteriori procedure vengono eseguite solo quando non c'è riflesso del pedale. Per prevenire l'essiccazione corneale, un colliro a base di carbossimetilcellulosa viene applicato su entrambi gli occhi.
L'animale viene trattenuto sulla tavola chirurgica usando un nastro bianco. I capelli vengono rimossi dall'area chirurgica addominale superiore destra utilizzando un clipper elettrico. Disinfettare il sito chirurgico con tre scrub alternati di 70%etanolo e povidone iodio utilizzando batuffoli di cotone sterilizzati in movimento circolare.
La pelle da tagliare è marcata appena sotto lo sterno perpendicolare allo xifoide e parallela alla gabbia toracica. Un foglio di drappeggio sterile con un'apertura di circa tre centimetri per un centimetro viene posizionato sulla pelle marcata. Un'incisione trasversale di circa due o tre centimetri viene effettuata lungo la linea contrassegnata con l'aiuto di un bisturi.
L'attacco della pelle con strato muscolare sottostante in prossimità dell'area incisa viene delicatamente rimosso da punte sterili in cotone inumidito. Successivamente, un'incisione trasversale viene effettuata attraverso lo strato peritoneale appena sotto il processo xifoide. Il lobo sinistro del fegato è esposto dando una leggera pressione al torace con l'aiuto di due punte di cotone inumidito salina.
Un anello sterile di filo di nylon viene scivolato intorno al lobo del fegato esposto. L'anello viene accuratamente portato alla base del lobo con l'aiuto di micro forcelle di sezionazione o cotton fioc. Con l'aiuto del supporto dell'ago di microchirurgia e dei micro pini, le due estremità del ciclo sono legate, posizionando il nodo il più vicino possibile alla base del lobo.
Questo per restringere i vasi sanguigni e ridurre il sanguinamento dopo la rimozione del lobo epatico. Due nodi aggiuntivi sono legati dall'altra parte. Il lobo legato viene tagliato appena sopra il nodo usando forbici in microchirurgia che lascia un ceppo ischemico.
Allo stesso modo, il lobo mediano del fegato viene sollevato usando punte di cotone. Riconoscere la forma unica del lobo mediano del fegato. Posizionare un anello di filo di nylon sul lobo, legare saldamente le estremità.
Due nodi aggiuntivi sono legati sull'altro lato e rispecchiano il lobo. Dopo aver rimosso i lobi, il peritoneo viene suturato utilizzando sutura cromata catgut 4/0 assorbibile assorbibile con punti continui seguita da sutura della pelle con semplice sutura interrotta. Dopo la chiusura della pelle, la soluzione di iodio povidone viene applicata intorno al sito chirurgico.
Il foglio del drappo viene rimosso e l'animale viene tolto dal comitato di chirurgia. Una dose antibiotica di 12 milligrammi di cefotaxime in un ml di soluzione di glucosio al 5% viene somministrata per via intraperitoneale all'animale per proteggerlo dal rischio di infezione postoperatoria. Per il sollievo dal dolore dopo l'intervento chirurgico, la meloxicam analgesica, in genere 1 mg per kg di peso corporeo viene somministrata per via sottocutanea all'animale, seguita da una dose ogni giorno per due giorni.
L'animale viene spostato in una gabbia di recupero calda. L'animale diventa cosciente entro 30-40 minuti e inizia a muoversi. L'animale operato viene tenuto in isolamento fino a quando le ferite chirurgiche non sono completamente guarite, il che può richiedere da tre a quattro giorni.
Per l'induzione di ALF, 750 milligrammi per kg di peso corporeo di acetaminofene e la seconda dose di meloxicam viene iniettata per via intraperitoneale 24 ore dopo la procedura parziale di epatomia. Questo regime di dose viene ripetuto dopo 24 ore. Dopo l'induzione dell'ALF, la sopravvivenza negli animali è stata gravemente ridotta.
Per caratterizzare lo sviluppo dell'ALF, gli animali utilizzati sono stati eutanasiati dopo la seconda dose di acetaminofene e sono stati effettuati vari studi biochimici e istologici. I risultati sono descritti in anticipo nel video. La percentuale di sopravvivenza nel gruppo indotto dall'ALF è stata notevolmente diminuita e fino all'80% di mortalità è stata osservata entro 24 ore dalla seconda dose di acetaminofene.
I danni al fegato erano evidenti a livello morfologico nel gruppo indotto dall'ALF e solo nel 70% in un gruppo parziale di epatotectomia. Mentre il gruppo di controllo e solo il gruppo trattato con acetaminofene avevano un aspetto sano. I livelli enzimatici di alanina amminotransferasi, aspartato amino transferasi e fosfatasi alcalina sono risultati altamente elevati nel gruppo indotto da ALF rispetto ad altri gruppi.
L'analisi del profilo di espressione genica da parte del qPCR ha mostrato un'elevata espressione dei geni coinvolti nell'apoptosi, nell'infiammazione e nella progressione della lesione epatica. La colorazione ematossilina ed eosina delle sezioni del tessuto epatico ha rivelato per lo più epatociti normali nel gruppo di controllo. Nel gruppo ALF, è stata osservata una degenerazione grassa macro vescicolare per lo più moderata.
Il tempo di protrombina e il rapporto normalizzato internazionale sono risultati elevati nel gruppo indotto da ALF, indicando un processo di coagulazione del sangue ostacolato. La percentuale di sopravvivenza è stata ripristinata nel gruppo indotto da ALF dopo il trapianto di epatociti sigeneici sani del ratto. I livelli sieri di enzimi alanina aminotransferasi, aspartato aminotransferasi e fosfatasi alcalina sono stati trovati restaurati negli animali indotti dalla ALF dopo il trapianto di cellule.
Questo metodo di induzione dell'ALF nei ratti è riproducibile, mostra una buona reversibilità e fornisce un'adeguata finestra di tempo per testare nuove terapie. Pertanto, questo modello può servire come modello di malattia efficiente per la valutazione di potenziali approcci terapeutici per trattare l'ALF.
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Panoramica
Il modello animale di insufficienza epatica acuta sviluppato in questo studio offre un'alternativa pratica per investigare potenziali terapie. Questo modello combina lesioni epatiche fisiche e indotte da farmaci, fornendo un lasso di tempo adatto per valutare nuovi approcci terapeutici.
Componenti principali dello studio
Area della scienza
- Neuroscienze
- Biologia
- Epatologia
Contesto
- L'insufficienza epatica acuta (ALF) è caratterizzata da un rapido danno epatico in individui altrimenti sani.
- Il trapianto di fegato ortotopico è il trattamento principale, ma la carenza di donatori porta ad alti tassi di mortalità.
- I modelli animali esistenti hanno limitazioni, inclusa scarsa riproducibilità e tossicità per altri organi.
- Comprendere la fisiopatologia dell'ALF è cruciale per sviluppare terapie alternative.
Obiettivo dello studio
- Sviluppare un nuovo modello animale per studiare l'ALF.
- Valutare l'efficacia di nuovi approcci terapeutici.
- Affrontare le limitazioni dei modelli ALF esistenti.
Metodi utilizzati
- Combinazione di lesioni epatiche fisiche e indotte da farmaci.
- Valutazione della funzione epatica su un periodo di tempo definito.
- Valutazione di potenziali terapie nel modello sviluppato.
- Confronto con i modelli ALF esistenti.
Risultati principali
- Il nuovo modello dimostra riproducibilità nell'indurre l'ALF.
- Fornisce un lasso di tempo adatto per la valutazione terapeutica.
- Le nuove terapie mostrano promesse nel migliorare la funzione epatica.
- I risultati indicano una migliore riflessione della patologia della malattia umana.
Conclusioni
- Il modello animale sviluppato è un'alternativa praticabile per la ricerca sull'ALF.
- Affronta le principali limitazioni dei modelli precedenti.
- Questo modello può facilitare la scoperta di terapie efficaci per l'ALF.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
This rat model of acute liver failure combines 70% partial hepatectomy with acetaminophen dosing to create a reproducible system with a 48-hour therapeutic window, enabling evaluation of novel interventions before irreversible damage. The model addresses key limitations of existing ALF models by improving reproducibility and providing a platform to study combined physical and drug-induced liver injury mechanisms relevant to translational hepatology research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses in a clinically relevant ALF phenotype driven by combined surgical and chemical injury.
- Operational Value: Provides a standardized system for functional target validation through measurable biochemical and histological endpoints.
- Predictive Value: Supports predictive confidence by modeling human-relevant pathways of apoptosis, inflammation, and coagulation dysfunction.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates quantifiable outputs including ALT, AST, ALP, PT, and INR for compound screening and dose-response analysis.
- Reproducibility: Demonstrates consistent ALF induction with up to 80% mortality within 24 hours of second acetaminophen dose, supporting assay standardization.
- <Scalability: Uses syngeneic hepatocyte transplantation to confirm reversibility, enabling recovery-based readouts for therapeutic screening.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Recapitulates human ALF pathophysiology through elevated transaminases, impaired coagulation, and immune cell infiltration.
- Translational Continuity: Allows assessment of hepatocyte transplantation efficacy, linking discovery to cellular therapy development.
- Risk Mitigation: Provides a 48-hour window for intervention testing, reducing false negatives in preclinical efficacy studies.
Pipeline & Workflow Integration
The model fits within the discovery-to-preclinical continuum by providing a phenotypically defined system for target validation, assay development, and therapeutic screening in acute liver injury.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of apoptosis and inflammation pathways through qPCR gene expression and histological analysis.
- Screening: Enables compound evaluation via serial biochemical measurements (ALT, AST, ALP) and survival endpoints.
- Analytics: Delivers quantitative dependent variables including enzyme levels, PT, INR, and survival rates for statistical comparison.
- Translational Research: Connects to preclinical validation through demonstrated reversibility via syngeneic hepatocyte transplantation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for iterative testing of therapeutic candidates across discovery and preclinical stages.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Mechanistic de-risking through validated biomarkers of liver injury and regeneration.
- Operational Value: Standardized surgical and dosing protocol ensures reproducibility across laboratories and studies.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing a time-bound window for therapeutic intervention assessment.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of candidates based on recovery of liver function and survival.
Implementation Considerations
- Requires microsurgical expertise for 70% partial hepatectomy and vascular ligation.
- Needs instrumentation for serum enzyme analysis, coagulation testing, and qPCR.
- Demands standardization of acetaminophen dosing and postoperative analgesia across study sites.
- Involves adaptation considerations for syngeneic hepatocyte isolation and transplantation procedures.
- Limited by rodent-to-human scaling in immune response and drug metabolism, per source material.
