Generazione di un modello di ratto di insufficienza epatica acuta combinando il 70% di epatitectomia parziale e acetaminofene

L'insufficienza epatica acuta o ALF è generalmente definita come rapido sviluppo di lesioni epatiche in un fegato sano ed è accompagnata da una grave compromissione delle sue principali funzioni. Il trapianto di fegato ortotopico è l'unica cura disponibile nella maggior parte dei casi. Ma a causa della carenza di donatori di fegato, il tasso di mortalità nei pazienti affetti da ALF è molto alto.

Per studiare il potenziale di approcci terapeutici alternativi e per comprendere meglio la fisiopatologia dell'ALF, vengono utilizzati modelli animali della malattia. Molti dei modelli ALF sono basati sugli effetti epatotossici dell'acetaminofene, del tetracloruro di carbonio, della concanavalina A, del lipolisaccaride, della D-galattosammina e della tioacetamide. Tuttavia, questi hanno diverse carenze come scarsa riproducibilità e reversibilità, tossicità per altri organi vitali, scarso riflesso della patologia delle malattie umane e variazione delle specie.

Pertanto, è necessario un sistema modello migliore che sia riproducibile e consenta un intervallo di tempo sufficiente per studiare gli effetti di un intervento terapeutico. Nello studio attuale, un modello ALF nei ratti è stato creato combinando gli effetti dell'epatomia parziale e dell'epatotossicità dell'acetaminofene. Il lobo laterale mediano e sinistro del fegato viene rimosso ad accisa al 70% di massa epatica e, inoltre, l'acetaminofene viene somministrato per causare ALF.

Lo sviluppo di ALF nel modello è stato caratterizzato da analisi biochimiche e istologiche e la reversibilità dei danni al fegato è stata confermata dal trapianto di epatociti sigeneici sani del ratto. I ratti Wistar con peso corporeo nell'intervallo da 180 a 250 grammi sono stati utilizzati nello studio attuale. I seguenti passaggi descrivono la procedura chirurgica per l'induzione di ALF in un ratto.

L'animale viene anestetizzato iniettando miscela ketamina-xiazina per via intraperitoneale. L'anestesia completa è confermata pizzicando la dita dei piedi dell'animale e ulteriori procedure vengono eseguite solo quando non c'è riflesso del pedale. Per prevenire l'essiccazione corneale, un colliro a base di carbossimetilcellulosa viene applicato su entrambi gli occhi.

L'animale viene trattenuto sulla tavola chirurgica usando un nastro bianco. I capelli vengono rimossi dall'area chirurgica addominale superiore destra utilizzando un clipper elettrico. Disinfettare il sito chirurgico con tre scrub alternati di 70%etanolo e povidone iodio utilizzando batuffoli di cotone sterilizzati in movimento circolare.

La pelle da tagliare è marcata appena sotto lo sterno perpendicolare allo xifoide e parallela alla gabbia toracica. Un foglio di drappeggio sterile con un'apertura di circa tre centimetri per un centimetro viene posizionato sulla pelle marcata. Un'incisione trasversale di circa due o tre centimetri viene effettuata lungo la linea contrassegnata con l'aiuto di un bisturi.

L'attacco della pelle con strato muscolare sottostante in prossimità dell'area incisa viene delicatamente rimosso da punte sterili in cotone inumidito. Successivamente, un'incisione trasversale viene effettuata attraverso lo strato peritoneale appena sotto il processo xifoide. Il lobo sinistro del fegato è esposto dando una leggera pressione al torace con l'aiuto di due punte di cotone inumidito salina.

Un anello sterile di filo di nylon viene scivolato intorno al lobo del fegato esposto. L'anello viene accuratamente portato alla base del lobo con l'aiuto di micro forcelle di sezionazione o cotton fioc. Con l'aiuto del supporto dell'ago di microchirurgia e dei micro pini, le due estremità del ciclo sono legate, posizionando il nodo il più vicino possibile alla base del lobo.

Questo per restringere i vasi sanguigni e ridurre il sanguinamento dopo la rimozione del lobo epatico. Due nodi aggiuntivi sono legati dall'altra parte. Il lobo legato viene tagliato appena sopra il nodo usando forbici in microchirurgia che lascia un ceppo ischemico.

Allo stesso modo, il lobo mediano del fegato viene sollevato usando punte di cotone. Riconoscere la forma unica del lobo mediano del fegato. Posizionare un anello di filo di nylon sul lobo, legare saldamente le estremità.

Due nodi aggiuntivi sono legati sull'altro lato e rispecchiano il lobo. Dopo aver rimosso i lobi, il peritoneo viene suturato utilizzando sutura cromata catgut 4/0 assorbibile assorbibile con punti continui seguita da sutura della pelle con semplice sutura interrotta. Dopo la chiusura della pelle, la soluzione di iodio povidone viene applicata intorno al sito chirurgico.

Il foglio del drappo viene rimosso e l'animale viene tolto dal comitato di chirurgia. Una dose antibiotica di 12 milligrammi di cefotaxime in un ml di soluzione di glucosio al 5% viene somministrata per via intraperitoneale all'animale per proteggerlo dal rischio di infezione postoperatoria. Per il sollievo dal dolore dopo l'intervento chirurgico, la meloxicam analgesica, in genere 1 mg per kg di peso corporeo viene somministrata per via sottocutanea all'animale, seguita da una dose ogni giorno per due giorni.

L'animale viene spostato in una gabbia di recupero calda. L'animale diventa cosciente entro 30-40 minuti e inizia a muoversi. L'animale operato viene tenuto in isolamento fino a quando le ferite chirurgiche non sono completamente guarite, il che può richiedere da tre a quattro giorni.

Per l'induzione di ALF, 750 milligrammi per kg di peso corporeo di acetaminofene e la seconda dose di meloxicam viene iniettata per via intraperitoneale 24 ore dopo la procedura parziale di epatomia. Questo regime di dose viene ripetuto dopo 24 ore. Dopo l'induzione dell'ALF, la sopravvivenza negli animali è stata gravemente ridotta.

Per caratterizzare lo sviluppo dell'ALF, gli animali utilizzati sono stati eutanasiati dopo la seconda dose di acetaminofene e sono stati effettuati vari studi biochimici e istologici. I risultati sono descritti in anticipo nel video. La percentuale di sopravvivenza nel gruppo indotto dall'ALF è stata notevolmente diminuita e fino all'80% di mortalità è stata osservata entro 24 ore dalla seconda dose di acetaminofene.

I danni al fegato erano evidenti a livello morfologico nel gruppo indotto dall'ALF e solo nel 70% in un gruppo parziale di epatotectomia. Mentre il gruppo di controllo e solo il gruppo trattato con acetaminofene avevano un aspetto sano. I livelli enzimatici di alanina amminotransferasi, aspartato amino transferasi e fosfatasi alcalina sono risultati altamente elevati nel gruppo indotto da ALF rispetto ad altri gruppi.

L'analisi del profilo di espressione genica da parte del qPCR ha mostrato un'elevata espressione dei geni coinvolti nell'apoptosi, nell'infiammazione e nella progressione della lesione epatica. La colorazione ematossilina ed eosina delle sezioni del tessuto epatico ha rivelato per lo più epatociti normali nel gruppo di controllo. Nel gruppo ALF, è stata osservata una degenerazione grassa macro vescicolare per lo più moderata.

Il tempo di protrombina e il rapporto normalizzato internazionale sono risultati elevati nel gruppo indotto da ALF, indicando un processo di coagulazione del sangue ostacolato. La percentuale di sopravvivenza è stata ripristinata nel gruppo indotto da ALF dopo il trapianto di epatociti sigeneici sani del ratto. I livelli sieri di enzimi alanina aminotransferasi, aspartato aminotransferasi e fosfatasi alcalina sono stati trovati restaurati negli animali indotti dalla ALF dopo il trapianto di cellule.

Questo metodo di induzione dell'ALF nei ratti è riproducibile, mostra una buona reversibilità e fornisce un'adeguata finestra di tempo per testare nuove terapie. Pertanto, questo modello può servire come modello di malattia efficiente per la valutazione di potenziali approcci terapeutici per trattare l'ALF.