Name: Differenziazione delle cellule epiteliali del seno del topo HC11 e EpH4 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-27T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: Scopri le tecniche di induzione della differenziazione nelle linee cellulari epiteliali mammarie murine HC11 ed EpH4. Questo metodo consente di studiare la relazione tra differenziazione e trasformazione neoplastica per identificare nuove strategie terapeutiche contro il cancro.

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La linea cellulare HC11 è stata gentilmente fornita dal Dr. D. Medina (Houston, TX). Gli autori sono grati al Dr. Andrew Craig della Queen's University per molti reagenti e preziosi suggerimenti. Le cellule EpH4 sono state un dono del Dr. C. Roskelley (UBC, Vancouver). Colleen Schick ha fornito un'eccellente assistenza tecnica per gli studi di cultura 3D.
L'assistenza finanziaria del Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC), dei Canadian Institutes of Health Research (CIHR), della Canadian Breast Cancer Foundation (CBCF, Ontario Chapter), della Canadian Breast Cancer Research Alliance , i Centri di Eccellenza dell'Ontario, il Breast Cancer Action Kingston (BCAK) e il fondo di lascile Clare Nelson attraverso sovvenzioni a LR sono riconosciuti con gratitudine. BE ha ricevuto il sostegno da CIHR, CBCF, BCAK e Cancer Research Society Inc. PTG è supportato da un presidente di ricerca canadese, Canadian Foundation for Innovation, CIHR, NSERC e Canadian Cancer Society. MN è stato supportato da una nave da uno studente del Terry Fox Training Program in Transdisciplinary Cancer Research di NCIC, un Graduate Award (QGA) e un Dean's Award della Queen's University. MG è stata sostenuta da borse di studio post-dottorato del Programma per il cancro al seno dell'esercito degli Stati Uniti, del Ministero della Ricerca e dell'Innovazione della Provincia dell'Ontario e del Comitato consultivo di ricerca della Queen's University. VH è stata sostenuta da una borsa di dottorato CBCF e da una borsa di studio post-dottorato del Terry Fox Foundation Training Program in Transdisciplinary Cancer Research in collaborazione con CIHR. Hanad Adan è stato il destinatario di uno studio estivo NSERC. LA BS è stata sostenuta da un premio di laurea della Queen's University.

1. Placcatura delle cellule HC11
<ol><li>In una cappa a flusso laminare utilizzando tecniche sterili preparare una bottiglia con 50 mL di HC11 mezzo cellulare: RPMI-1640 con 10% siero bovino fetale (FBS), 5 insulina g/mL, e 10 ng/mL EGF (vedi Tabella dei materiali).</li>
	<li>Piatto di circa 400.000 cellule per piatto Petri da 3 cm: Passare due piatti Petri 10 cm, 50% confluenti in venti piatti 3 cm in mezzo HC11. Le cellule devono essere ben distribuite, ma l'essiccazione deve essere evitata.<ol>
<li>Aspirare il mezzo in un pallone utilizzando una pompa a vuoto.</li>
		<li>Aggiungete 250 di cfrina (vedi Tabella dei materiali)per piastra da 10 cm. Swirl e colpire la piastra dai lati mantenendolo orizzontale per diffondere la trypsin e per spostare le celle collegate</li>
		<li>Osservare la microscopia a contrasto di fase con un obiettivo 4x per assicurarsi che le cellule abbiano iniziato a staccarsi dai bordi prima del pipettaggio.</li>
		<li>Aspirata circa 1,5 mL di HC11 medio in uno sterile, 9 pollici Pasteur pipetta e schizzare verticalmente contro le cellule. Ruotare il piatto Petri mentre si schizza per spostare tutte le cellule. È necessario lavorare velocemente per evitare l'essiccazione delle cellule.</li>
		<li>Trasferire tutte le celle alla bottiglia con il mezzo HC11 e il vortice.</li>
		<li>Pipette 2 mL di sospensione cellulare in ogni piatto Petri di 3 cm. Rock i piatti Petri trasversalmente per diffondersi in modo uniforme. Collocare le cellule in un'incubatrice di CO2 a 37 gradi centigradi.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Il giorno successivo, o quando le cellule sono confluenti del 90-100%, aspirano il mezzo e sostituirlo con mezzo con FBS e insulina ma manca di EGF.</li>
</ol>2. Induzione della differenziazione, monitoraggio e quantitazione delle cellule HC11
<ol><li>Dopo aver fatto crescere le cellule in media privo EGF per 24 h, aggiungere il mezzo di differenziazione (medium HIP) a dieci piastre da 3 cm: RPMI-1640 integrato con 10% FBS, 1 g/mL Hydrocortisone (vedi Tabella dei materiali),5 g/mL Insulin e 5 g/mL Prolactin (vedi Tabella dei Materiali) per un massimo di 10 giorni.</li>
	<li>Mantenere le altre dieci piastre da 3 cm come controlli: passare a un mezzo con 10% FBS e 5 insulina sg/mL privo di EGF e HIP.</li>
	<li>Cambia il mezzo ogni 2-3 giorni in sia cellule trattate con HIP che con controlli. Pipette il mezzo con attenzione per assicurarsi che le cellule non si stacchino.</li>
	<li>Per monitorare la differenziazione (cioè la formazione di "cupole"), osservare le cellule in microscopia a contrasto di fase (Figura 1A, pannello sinistro). Se le cellule esprimono proteine a fluorescenza verde (GFP), osservate sotto microscopia a fluorescenza (eccitazione - 485/20; emissione - 530/25; ingrandimento 240x; obiettivo 20x) (Figura 1A, pannello destro).</li>
	<li>Per quantificare il grado di differenziazione, estrarre le proteine da un piatto Petri ciascuna delle cellule e dei controlli trattati con HIP, una volta al giorno per un totale di 10 giorni e sondare le macchie occidentali per la caseina (vedi Tabella dei materiali)(Figura 1B).<ol>
<li>Raschiare le cellule sul ghiaccio con una salina con buffer di fosfato a freddo ghiaccio da 1,5 ml in un tubo di centrifuga in plastica da 1,8 ml.</li>
		<li>Pellele cellule a 350 x g, 1 min, 4 gradi centigradi.</li>
		<li>Lavare rapidamente il pellet 2x con PBS ghiacciato. Scolare i residui.</li>
		<li>Creare un buffer di lisi: 50 mHE HEPES (pH - 7,4), 150 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mM Na4P2O7, 1% NP-40, 100 mM NaF, 2 mM Na3VO4, 0,5 mM phenylmethylsulphonyl fluoride (PMSF), 10 g/mL di aprotinina, 10 g/mL leupeptina16. Aggiungere 100 l per 3 cm di piatto Petri.</li>
		<li>Chiarire il lisato dalla centrifugazione a 10.000 x g per 10 min al freddo.</li>
		<li>Determinare la concentrazione di proteine (vedi Tabella dei materiali)e caricare da 10 a 20 g di proteine da ciascun campione su un gel poliacrilamitilminismo-SDS del 10%.</li>
		<li>Elettroforo per 15 h a 45 V, o a 100 V per 2–2,5 h.</li>
		<li>Trasferire su una membrana di nitrocellulosa o PVDF utilizzando un apparato di trasferimento elettroblotting (vedere Tabella dei materiali).</li>
		<li>Blocco con 5% di albumina di siero bovino (BSA) in salina con 0,1% Tween-20 (TBST).</li>
		<li>Aggiungere l'anticorpo primario, capra anti-caseina diluita 1:2,000 o topo anti-atto diluito 1:1,000 (vedi Tabella dei materiali).</li>
		<li>Lavare 3x con TBST, 5 min ogni volta.</li>
		<li>Aggiungere l'anticorpo secondario, il rafano perossidasi (HRP) legato asino anti-capra diluito 1:2.500, o HRP collegato cavallo anti-tono anticorpo diluito 1:10,000.</li>
		<li>Lavare 3x con TBST, 5 min ogni volta.</li>
		<li>Aggiungere reagenti ECL alla membrana secondo le istruzioni del produttore (vedere Tabella dei materiali).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Placcatura e crescita 3D delle cellule EpH4 nella matrice EHS
NOTA: La matrice è liquida a temperature <10 gradi centigradi e solida a temperature superiori. Conservare a -80 gradi centigradi. Scongelare a 4 gradi centigradi la sera prima dell'uso. Pre-raffreddare le piastre di coltura dei tessuti e punte di pipetta a -20 gradi centigradi prima di maneggiare e mantenere la matrice, le piastre e le punte di pipetta sul ghiaccio per evitare che si solidifica.
<ol><li>Crescere le cellule EpH4 in 2D nel mezzo RPMI-1640 con 10% FBS e 5 insulina g/mL (l'EGF non è richiesto).</li>
	<li>Preparare il mezzo di crescita EpH4 integrato con una matrice del 10% (v/v, 3.500 ) o del 20% (v/v 2.000 ) in due tubi conici da 50 ml. Tenere sul ghiaccio fino a quando pronto per l'uso.</li>
	<li>Cappotto 10 pozze (1 cm2 ciascuno) di un pozzo 24 con 150 l di matrice non diluita. Stendere la matrice utilizzando una punta pipetta. Evitare di creare bolle. Toccare delicatamente i lati della piastra tenendola orizzontalmente per assicurarsi che la matrice sia distribuita uniformemente sul fondo del pozzo.</li>
	<li>Incubare la piastra 24 pozza a 37 gradi centigradi per 1 h per consentire alla matrice di solidificarsi.</li>
	<li>Provaa le cellule EpH4 come descritto sopra per le cellule HC11 e contale con un emocitometro. Trasferire 5 x 104 cellule per pozzo in un tubo di centrifuga conica sterile da 1,5 mL e girare a 250 x g per 5 min.</li>
	<li>Aspirare con attenzione il mezzo e posizionare il tubo sul ghiaccio.</li>
	<li>Risospendere le cellule in 350 -L di EpH4 growth medium integrata con una matrice del 20% utilizzando una punta di pipetta da 1 mL, mantenendo il tubo conico sul ghiaccio. Evitare le bolle. È importante garantire una sospensione a cella singola.</li>
	<li>Una volta che la matrice dello strato inferiore si è solidificata (la matrice dovrebbe apparire di colore traslucido e più chiaro rispetto al rivestimento iniziale dei pozze), aggiungere la 350 l di sospensione cellulare ad ogni pozzo rivestito e posizionare in un'incubatrice di CO2 a 37 gradi centigradi per 1 h per consentire alla matrice del 20% di solidificarsi.<ol>
<li>Osservare le cellule microscopicamente in fase contrasto con un obiettivo 4x. Le celle singole devono essere visibili.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aggiungere 200 L di epH4 di supporto contenente 10% matrice sopra il 350 - L di celle sospese in 20% matrice. Incubare a 37 gradi centigradi.</li>
</ol>4. Induzione differenziazione delle cellule EpH4 cresciute in 3D (Figura 2)
NOTA: Oltre alla differenziazione, le cellule EpH4 possono anche subire tubulogenesi quando stimolate con HGF (fattore di crescita epatocite) nella coltura 3D. Le escrescenze tubolari possono essere viste dopo 10 giorni di stimolazione HIP e HGF.
<ol><li>Iniziare l'induzione della differenziazione delle cellule EpH4 1 giorno dopo la placcatura nella matrice. Rimuovere con cura 150 -L di mezzo superiore contenente 10% matrice dai pozzi utilizzando una punta di pipetta di plastica. Aggiungere 200 l di epH4 media contenente HIP e 10% di matrice.</li>
	<li>Sostituire il mezzo 10% matrix-HIP ogni 2 giorni per un massimo di 10 giorni. Crescere le celle di controllo nello stesso mezzo a matrice 10% senza HIP.</li>
	<li>Monitorare la formazione della mammosfera in contrasto di fase (Figura 3A,pannello inferiore).</li>
</ol>5. Tubulogenesi Induzione delle cellule EpH4 cresciute in 3D (Figura 3A e 3C)
<ol><li>Preparare 24 lastre e celle EpH4 per la crescita in matrix, come descritto nei passaggi da 3.1 a 3,9. Il giorno dopo aver placcato le cellule nella matrice, rimuovere 150 L di epH4 medio contenente 10% matrice dai pozzi utilizzando una punta di pipetta di plastica. Aggiungere 200 l di supporto EpH4 contenente 10% matrice, HIP e 20 ng/mL HGF (vedere Tabella dei materiali).</li>
	<li>Sostituire il supporto 10% matrix/HIP/HGF ogni 2 giorni per un massimo di 12-14 giorni.</li>
	<li>Monitorare la formazione di tubuli al microscopio utilizzando un obiettivo 20x o 40x(Figura 3A, pannello destro).</li>
</ol>6. Quantitazione della differenziazione: Blotting occidentale per la caseina z
<ol><li>Con attenzione pipetta fuori il 10% matrice-HIP mezzo dai pozzi. Risciacquare lo strato di 20% a matrice 2x con 350 gradi di PBS ghiacciato. Gli sferoidi dovrebbero essere ancora presenti nel livello della matrice.</li>
	<li>Aggiungere 700-1.000 gradi di PBS ghiacciato con 1 mM di acido etilenediaminetracetraacetica (EDTA) direttamente nei pozzi. Staccare delicatamente lo strato inferiore della matrice 100% dal pozzo con una punta di pipette per recuperare gli sferoidi presenti in quel livello. Agitare delicatamente per 30 min a 4 gradi centigradi.</li>
	<li>Trasferire con attenzione la sospensione sferoide in un tubo conico. Sciacquare i pozzetti con 500 dollari loff di PBS-EDTA per recuperare gli sferoidi rimanenti nei pozzetti e aggiungerli al tubo conico.</li>
	<li>Roccia sul ghiaccio per altri 30 min. Assicurarsi che la matrice si sia completamente dissolta. Se si osservano grumi a matrice visibile, aggiungere più PBS-EDTA o scuotere più a lungo.</li>
	<li>Centrifugare la soluzione per pellet gli sferoidi a 350 x g per 5 min.</li>
	<li>Aspirati il superatante, lividi gli sferoidi nel tampone di lisi ghiacciato e sondano per la caseina, la ciclica D1 e la p120RasGAP dal gonfiore occidentale come nel punto 2,5 sopra16. Come anticorpi primari, utilizzare capra anti-s-casein diluito 1:2,000, coniglio anti-ciclone D1 diluito 1:2,000, e topo anti-p120 diluito 1:2,000. Per gli anticorpi secondari, utilizzare HRP collegato anti-capra anti-capra diluito 1:2,500, HRP collegato asino anti-coniglio diluito 1:2,500, e HRP collegato cavallo anti-topo diluito 1:10,000.</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno conflitti da divulgare.

Le cellule HC11 sono ideali per lo studio della differenziazione in combinazione con la trasformazione neoplastica. Un ulteriore vantaggio è che le cellule HC11 sono facilmente infettivabili con vettori retrovirali basati su Mo-MLV per esprimere una varietà di geni. Nelle nostre mani, le cellule EpH4 erano più difficili da infettare con gli stessi vettori retrovirali di HC112.
Il contatto tra celle e l'arresto della crescita sono i prerequisiti fondamentali per la diffe...

Nei tessuti normali o tumori, le cellule hanno ampie opportunità di adesione ai loro vicini in un'organizzazione tridimensionale, e questo è imitato nella coltura dalla crescita cellulare ad alta densità. L'adesione da cellula a cellula è mediata principalmente attraverso i recettori della cadherin, che definiscono l'architettura cellulare e tissutale. È interessante notare che è stato recentemente dimostrato che le cadherine svolgono anche un ruolo potente nella trasduzione del segnale, specialmente nella segnalazione di sopravvivenza1. Paradossalmente, alcuni di questi segnali di adesione da cellula a cellula provenienti da cadherins sono stati recentemente trovati per essere condivisi sia dalla differenziazione che dalla neoplasia2. Qui, descriviamo i metodi di induzione e valutazione della differenziazione in due tipi rappresentativi di linee cellulari epiteliali del seno del topo, HC11 e EpH4.
La linea cellulare epiteliale del seno del topo HC11 può fornire un modello utile per lo studio della differenziazione delle cellule epiteliali. Le cellule HC11 sono una linea cellulare derivata da COMMA-1D, proveniente dalla ghiandola mammaria di un topo Balb/c a metà gravidanza3. A differenza di altri cloni derivati COMMA-1D, il clone hC11 non ha alcun requisito per la matrice extracellulare aggiunta esogenao o la cocoltivazione con altri tipi di cellule per l'induzione in vitro del gene endogeno della caseina endogena dagli ormoni lattogenici3 . Questa linea cellulare è stata ampiamente utilizzata negli studi di differenziazione perché ha mantenuto importanti caratteristiche del normale epitelio mammario: le cellule HC11 possono parzialmente ricostituire l'epitelio duttale in un cuscinetto di grasso mammario eliminato4. Inoltre, possono differenziarsi in una coltura bidimensionale (2D) quando coltivati alla confluenza attaccata alla superficie di un piatto di Petri di plastica in presenza di uno steroide come Hydrocortisone o Dexamethasone, oltre a Insulin e Prolactin (media HIP) privo di fattore di crescita epidermica (EGF), un inibitore della differenziazione5,6,7. In queste condizioni, le cellule HC11 producono proteine del latte come la caseina e la WAP, che sono rilevabili dalla gonfiore occidentale entro 4 giorni dall'induzione. Allo stesso tempo, una porzione di cellule HC11 forma strutture rudimentali simili alla ghiandola mammaria definite "cupole" in modo stocastico. Le cupole sono visibili 4-5 giorni dopo l'induzione e aumentano gradualmente di dimensioni fino al giorno 10, concomitanti con un aumento della produzione di banofaz 8. È interessante notare che le cellule HC11 possiedono p539mutanti e quindi rappresentano uno stato preneoplastico. Per questo motivo, il modello HC11 è ideale per studiare le reti di segnalazione di differenziazione in combinazione con la neoplasia nello stesso sistema cellulare.
Le cellule EpH4, un derivato delle cellule IM-2, sono una linea cellulare non tumorale originariamente derivata da cellule epiteliali della ghiandola mammaria del topo immortalate spontaneamente isolate da un topo balb/c medio-gravidanza10. Le cellule EpH4 formano monostrati epiteliali continui in coltura 2D, ma non si differenziano in strutture simili alla ghiandaia10,11. Tuttavia, a seguito della crescita 3D in un materiale costituito da una miscela di proteine a matrice extracellulare prodotte dalle cellule sarcoma del topo EHS12 (matrice EHS, matrice o Matrigel, vedi Tabella dei materiali), oltre alla stimolazione con HIP, le cellule EpH4 possono ricapitolare le fasi iniziali della differenziazione della ghiandola mammaria. In queste condizioni, le cellule EpH4 formano sferoidi (chiamati anche mammosferie) che presentano polarità apicale-basale e un lume cavo, e sono in grado di produrre le proteine del latte, la caseina e la WAP, simili alle cellule epiteliali mammarie che allattano. Contrariamente alle cellule HC11, che sono indifferenziate, e alcuni esprimono marcatori mesenchymal13, cellule EpH4 mostrano una morfologia puramente luminale14. Cellule EpH4 sono stati segnalati anche per produrre proteine del latte nella coltura 2D attraverso la stimolazione con dexamethasone, insulina, e prolattina15. Tuttavia, questo approccio preclude lo studio degli effetti normativi che imitano il microambiente della ghiandola mammaria nella coltura 3D.

<table><tbody><tr><td>Soluzione di acrilammide al 30% / 0,8% bis</td><td>Bio Rad</td><td>1610154</td><td>Western Blotting</td></tr><tr><td>Anti-Cyclin D1 anticorpo</td><td>coniglio, Santa Cruz</td><td>sc-717</td><td>Western Blotting</td></tr><tr><td>Anti-p120 anticorpo</td><td>topo, Santa Cruz</td><td>sc-373751</td><td>Western Blotting</td></tr><tr><td>Anti-&beta; anticorpo actina</td><td>topo, Cell Signalling technology</td><td>3700</td><td>Western Blotting</td></tr><tr><td>Anti-&beta; caseina anticorpo</td><td>capra, Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-17971</td><td>Western Blotting</td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>Bio Shop</td><td>APR600</td><td>Lisi Tampone</td></tr><tr><td>Soluzione di acido bicinconnico</td><td>Sigma</td><td>B9643-1L-KC</td><td>Determinazione delle proteine</td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina</td><td>Bio Shop</td><td>ALB007.500</td><td>Determinazione delle proteine</td></tr><tr><td>Chiarezza Substrato ECL occidentale</td><td>Bio Rad</td><td>170-5061</td><td>Western Blotting</td></tr><tr><td>Solfato di rame (II)</td><td>Sigma</td><td>C2284-25ML</td><td>Determinazione delle proteine</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>D1306</td><td>Colorazione</td></tr><tr><td>Digitonin</td><td>Calbiochem, Cedarlane Laboratories Ltd</td><td>14952-500</td><td>Colorazione</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Bio Shop</td><td>EDT001.500</td><td></td></tr><tr><td>Fattore di crescita epidermico</td><td>Sigma</td><td>E9644</td><td>Terreno per cellule HC11</td></tr><tr><td>Siero fetale di vitello</td><td>PAA</td><td>A15-751</td><td>Terreno per colture cellulari</td></tr><tr><td>Capra- Anti coniglio-HRP</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-2004</td><td>Western Blotting</td></tr><tr><td>Fattore di crescita degli epatociti ricombinante</td><td>Gibco</td><td>PHG0321</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma</td><td>7365-45-9</td><td>Coltura cellulare</td></tr><tr><td>Cavallo Anti-Topo HRP</td><td>Tecnologia di segnalazione cellulare</td><td>7076</td><td>Western Blotting</td></tr><tr><td>Idrocortisone</td><td>Sigma</td><td>H0888</td><td>HIP Insulina media</td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>I6634</td><td>HIP</td></tr><tr><td>Medium Cappa a flusso laminare Cappa</td><td>BioGard Coltura</td><td></td><td>cellulare</td></tr><tr><td>Leupeptin</td><td>Bio Shop</td><td>LEU001.10</td><td>Matrice tampone di lisi</td></tr><tr><td>(matrice Engelbreth-Holm-Swarm, Matrigel)</td><td>Corning</td><td>CACB 354230</td><td></td></tr><tr><td>Topo Anti-Capra HRP</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-8360</td><td>Western Blotting</td></tr><tr><td>Mowiol 4-88 Reagente</td><td>Calbiochem, Cedarlane Laboratories Ltd</td><td>475904-100GM</td><td>Colorazione</td></tr><tr><td>Microscopio confocale multi-fotone</td><td>Leica TCS SP2</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Na3VO4</td><td>Bio Shop</td><td>SOV850</td><td>Tampone di lisi</td></tr><tr><td>Na4P207</td><td>Sigma</td><td>125F-0262</td><td>Tampone di lisi</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Bio Shop</td><td>SOD001.1</td><td>Western Blotting</td></tr><tr><td>NaF</td><td>Fisher Scientific</td><td>7681-49-4</td><td>Tampone di lisi</td></tr><tr><td>Nikon fotocamera digitale</td><td>Coolpix 995</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nitrocellulosa</td><td>Bio Rad</td><td>1620112</td><td>Western Blotting</td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Sigma</td><td>9016-45-9</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Fisher Scientific</td><td>30525-89-4</td><td>Microscopio</td></tr> a <tr><td>contrasto di fase</td> di colorazione <td>Olympus IX70</td><td></td><td>Coltura cellulare</td></tr><tr><td>Fenilmetilsufonile fluoruro</td><td>Sigma</td><td>329-98-6</td><td>Tampone di lisi</td></tr><tr><td>pMX GFP Rac G12V</td><td>Addgene</td><td>14567</td><td></td></tr><tr><td>Prolattina</td><td>Sigma</td><td>L6520</td><td>HIP Medio</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Sigma</td><td>R8758</td><td>Cellula Terreno di coltura</td></tr><tr><td>Piatto di coltura tissutale 35</td><td>Sarstedt</td><td>83.3900.</td><td>Coltura cellulare</td></tr><tr><td>Piastra per colture tissutali-24 pozzetti</td><td>Sarstedt</td><td>83.1836.300</td><td>Apparecchio per il trasferimento di colture cellulari</td></tr><tr><td></td><td>CBS Scientific Co</td><td>EBU-302</td><td>Western Blotting</td></tr><tr><td>Tris Acetate</td><td>Bio Shop</td><td>TRA222.500</td><td>Western Blotting</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Sigma</td><td>9002-07-7.</td><td>Coltura cellulare</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Bio Shop</td><td>TWN510.500</td> Western <td>Blotting</td></tr><tr><td>Veritical Gel Electrophoresis</td> System <td>CBS Scientific Co</td><td>MGV-202-33</td><td>Western Blotting</td></tr></tbody></table>

differenziazione delle cellule epiteliali del seno del topo hc11 e eph4

Differentiation of Mouse Breast Epithelial HC11 and EpH4 Cells

I cadherin svolgano un ruolo importante nella regolazione della differenziazione cellulare e della neoplasia. Qui descriviamo le origini e i metodi dell'induzione della differenziazione di due linee cellulari epiteliali del seno del topo, HC11 ed EpH4, e il loro uso per studiare fasi complementari dello sviluppo della ghiandola mammaria e della trasformazione neoplastica.
La linea cellulare epiteliale del seno del topo HC11 ha avuto origine dalla ghiandola mammaria di un topo balb/c incinta. Si differenzia quando viene coltivato alla confluenza attaccata alla superficie di un piatto Petri di plastica in un mezzo contenente siero di vitello fetale e Hydrocortisone, Insulin e Prolactin (medium HIP). In queste condizioni, le cellule HC11 producono le proteine del latte proteina acida (WAP), simili alle cellule epiteliali mammarie che allattano, e formano rudimentali strutture simili a ghiandole mammarie definite "cupole".
La linea cellulare EpH4 è stata derivata da cellule epiteliali mammarie topoimmortalizzate spontaneamente isolate da un topo balb/c incinta. A differenza dell'HC11, le cellule EpH4 possono differenziarsi completamente in sferoidi (chiamati anche mammosferie) quando coltivate in condizioni di crescita tridimensionali (3D) nel mezzo HIP. Le cellule sono ortopsinizzate, sospese in una matrice del 20% costituita da una miscela di proteine a matrice extracellulare prodotte da cellule di sarcoma tono Engelbreth-Holm-Swarm (EHS), placcate sopra uno strato di matrice concentrata che riveste una piastra Petri di plastica o piastra multiwell, e coperte da uno strato di mezzo HIP composto da matrice del 10%. In queste condizioni, le cellule EpH4 formano sferoidi cavi che presentano polarità apicale-basale, un lume cavo, e producono la caseina e la WAP.
Utilizzando queste tecniche, i nostri risultati hanno dimostrato che l'intensità del segnale cadherin/Rac è fondamentale per la differenziazione delle cellule HC11. Mentre Rac1 è necessario per la differenziazione e bassi livelli di Attivato RacV12 aumentare la differenziazione, alti livelli di RacV12 bloccano la differenziazione mentre inducono neoplasia. Al contrario, le cellule EpH4 rappresentano una fase precedente nella differenziazione epiteliale mammaria, che è inibita anche da bassi livelli di RacV12.

È noto da tempo che la differenziazione delle cellule epiteliali e degli adipociti richiede confluenza e impegno di cadherins2. Noi e altri abbiamo dimostrato che l'adesione cellulare-cellulare e l'impegno di E- o N-cadherin e cadherin-11, come avviene con la confluenza di cellule coltivate, innesca un drammatico aumento dell'attività del piccolo GTPases Rac e della divisione cellulare controlla la proteina di controllo 42 (Cdc42), e questo processo porta all'attivazione di interleuchina-6 (IL6) c...

Descriviamo tecniche per l'induzione della differenziazione di due linee epiteliali mammarie, HC11 ed EpH4. Mentre entrambi richiedono siero di vitello fetale, insulina e prolattina per produrre proteine del latte, le cellule EpH4 possono differenziarsi completamente in mammosfere in coltura tridimensionale. Questi modelli complementari sono utili per gli studi di trasduzione del segnale di differenziazione e neostrulasia.

Differenziazione delle cellule epiteliali del seno del topo HC11 e EpH4

Cadherins play an important role in the regulation of cell differentiation as well as neoplasia. Here we describe the origins and methods of the induction ...

Le cellule HC11 ed EpH4 sono linee cellulari epiteliali del seno del topo che possono differenziarsi in coltura. Allo stesso tempo, queste cellule possono essere trasformate da un certo numero di oncogeni. Queste cellule sono ideali per lo studio dell'interrelazione tra differenziazione e trasformazione neoplastica.Queste tecniche possono essere utilizzate negli studi di trasduzione del segnale per scoprire obiettivi per la terapia del cancro. Ad esempio, la piccola GTPasi Rac e altre molecole possono innescare la trasformazione delle cellule epiteliali del seno quando espresse a livelli elevati, ma sorprendentemente a bassi livelli, possono indurre differenziazione. Altri trasduttori di segnale possono comportarsi in modo simile.I principi possono applicarsi anche ad altri tipi di differenziazione in cui la confluenza cellulare gioca un ruolo importante, ad esempio la differenziazione di adipociti o miotubi. Qualcuno che esegue questa tecnica per la prima volta dovrebbe tenere a mente che la placcatura delle cellule HC11 è importante. Questo perché il contatto da cellula a cellula è importante per la differenziazione.Un altro punto da notare è che una corretta estrazione delle cellule EpH4 dalla matrice è fondamentale per la quantificazione delle proteine perché qualsiasi residuo influenzerà la determinazione delle proteine. La dimostrazione visiva di questo metodo è utile perché alcuni dettagli del protocollo sono difficili da descrivere su carta. Inizia preparando una bottiglia di 50 millilitri di mezzo cellulare HC11 secondo le indicazioni del manoscritto.Per placcare le cellule, aspirare il mezzo da cinque piastre di Petri confluenti al 50% di centimetri e lavare le celle con circa 1,8 millilitri di tripside utilizzando una pipetta Pasteur sterile a nove pollici collegata in cotone. Quindi aggiungere 200 microlitri di tripina per piastra e ruotare la piastra per spostare le celle attaccate. Osservare le cellule in microscopia a contrasto di fase con un obiettivo 4X per assicurarsi che abbiano iniziato a spodestarsi.Quindi aspirare circa 1,5 millilitri di mezzo HC11 con una pipetta Pasteur sterile da nove pollici e spruzzarla verticalmente contro le cellule mentre ruota il piatto assicurandosi di evitare schizzi. Trasferire tutte le celle in bottiglia con mezzo HC11 e ruotare per disperdersi uniformemente nella bottiglia. Quindi aliquote la sospensione cellulare in 20 piastre di Petri di tre centimetri pipettando due millilitri di cellule per piatto.Dondolare le piastre di Petri per diffondere le cellule e incubarle a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica durante la notte. Il giorno successivo, quando le cellule sono confluenti dal 90 al 100%, aspirano il mezzo e lo sostituiscono con mezzo con FBS ma senza EGF. Dopo aver fatto crescere le cellule in mezzo senza EGF per 24 ore, aggiungere il mezzo di differenziazione a 10 piatti e far crescere le cellule per un massimo di 10 giorni mantenendo gli altri 10 piatti come controlli.Cambiare il mezzo ogni due o tre giorni con cellule trattate e di controllo HIP. Per monitorare la differenziazione, osservare le cellule con microscopia a contrasto di fase. Utilizzare la microscopia a fluorescenza se le cellule esprimono proteine fluorescenti verdi.Inoltre, quantificare il grado di differenziazione estraendo proteine dalle cellule trattate e di controllo HIP una volta al giorno ed eseguendo l'analisi western Blot. Raccogliere e posizionare il mezzo di crescita EpH4, la matrice EHS e due tubi conici da 50 millilitri sul ghiaccio. Prechill le piastre di coltura tissutale con punte di pipetta a meno 20 gradi Celsius e preparare il mezzo di crescita EpH4 integrato con matrice del 10 o 20% in due tubi conici da 50 millilitri e tenerli sul ghiaccio fino a quando non sono pronti per l'uso.Dopo aver recuperato le piastre di coltura tissutale prechilled a meno 20 gradi Celsius, rivestire 10 pozzi della piastra a 24 porri con 150 microlitri di matrice non diluita diffondendo la matrice con una pipetta. Evitare di creare bolle quando si diffonde la matrice. Quindi toccare delicatamente i lati della piastra e incubare la piastra a 37 gradi Celsius per un'ora per consentire alla matrice di solidificarsi.Nel frattempo, preparati per la differenziazione tripinando le cellule EpH4 così come precedentemente descritte e garantendo sospensioni a singola cellula dopo la resopensione delle cellule tripsinti. Quindi, conta le cellule in sospensione con un emocitometro. Trasferire cinque volte 10 alle quattro cellule per pozzo in un tubo di centrifuga conico sterile da 1,5 millilitri e girarle a 250 volte g per cinque minuti.Aspirare con cura il mezzo supernatante e posizionare il tubo sul ghiaccio. Utilizzare una punta di pipetta da un millilitro per rimescolare le celle in 350 microlitri di mezzo di crescita EpH4 integrati con una matrice del 20% mantenendo i tubi sul ghiaccio assicurandosi di evitare bolle. Una volta che lo strato inferiore si è solidificato, aggiungere i 350 microlitri di sospensione cellulare a ciascun pozzo rivestito e posizionarlo in un incubatore di anidride carbonica a 37 gradi Celsius per un'ora per consentire allo strato a matrice del 20% di solidificarsi.Osservare le celle con microscopia a contrasto di fase per assicurarsi che le singole celle siano visibili. Quindi aggiungere 200 microlitri di mezzo EpH4 con matrice del 10% in cima e incubare la piastra a 37 gradi Celsius. Inizia l'induzione della differenziazione un giorno dopo aver placcato le cellule nella matrice.Rimuovere con cura 150 microlitri del mezzo matrice superiore al 10% e aggiungere 200 microlitri di supporto EpH4 contenente HIP e matrice al 10% e per i controlli aggiungere un mezzo matrice al 10% senza HIP. Sostituire il mezzo ogni due giorni per un massimo di 10 giorni monitorando la formazione della mammosfera con microscopia a contrasto di fase. Per quantificare la differenziazione, pipettare con cura il mezzo HIP a matrice del 10% dai pozzi e risciacquare lo strato a matrice del 20% con 350 microlitri di PBS ghiacciato.Quindi aggiungere da 70 a 100 microlitri di PBS ghiacciato con un EDTA millimolare direttamente nei pozzi e staccare delicatamente lo strato inferiore della matrice al 100% con una punta di pipetta. Agitare delicatamente il piatto a quattro gradi Celsius per 30 minuti. Trasferire con cura la sospensione dello sferoide su un tubo conico e sciacquare i pozzi con 500 microlitri di PBS EDTA per recuperare eventuali sferoidi rimanenti.Dondolare il tubo sul ghiaccio per altri 30 minuti assicurandosi che la matrice si dissolva completamente. Se si vedono grumi a matrice visibile, aggiungere più PBS EDTA o agitare più a lungo. Centrifugare la soluzione a 350 volte g per pellettare gli sferoidi.Quindi aspirare il supernatante, lisciviare gli sferoidi e sondare le cellule per la beta-caseina, la ciclina D1 e p120RasGAP mediante gonfiore occidentale. C'è una sorprendente dipendenza dalla differenziazione dalla forza del segnale Rac nelle cellule HC11. Mentre il CRAC1 endogeno è necessario per la differenziazione e bassi livelli di RacV12 attivati mutazionalemente causano un aumento della capacità di differenziazione, alti livelli di RacV12 innescano un blocco di differenziazione e inducono neoplasia.Quando le proprietà di differenziazione delle cellule EpH4 sono state esplorate in una coltura di matrice 3D, è stato scoperto che la produzione di beta-caseina ha raggiunto il picco da otto a 10 giorni e l'espressione di cyclin D1 era massima a quattro o sei giorni dopo la stimolazione HIP. Per determinare il posizionamento delle singole celle, sono state macchiate con DAPI e immagini con microscopia confocale. La morte cellulare interna e la formazione di lumen cavi sono state osservate nelle mammosfere mentre l'aggiunta di HGF ha portato alla formazione di strutture tubolari.Qualcuno che esegue questa tecnica per la prima volta dovrebbe tenere a mente che la placcatura delle cellule HC11 è importante. Anche una corretta estrazione delle cellule EpH4 dalla matrice è fondamentale per la quantificazione delle proteine perché eventuali residui influenzeranno la determinazione delle proteine. Questa tecnica può essere utilizzata per indagare altri trasduttori di segnale che possono comportarsi in modo simile.Se ci sono mutazioni del conducente in un cancro, la loro completa inibizione non sarà necessaria poiché bassi livelli rimanenti indurrebbero effettivamente la differenziazione.

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HC11 differenziazione lattogenica può essere caratterizzata dalla formazione di strutture a cupola denominata mammospheres. Le strutture possono essere elencati mediante microscopia a contrasto di fase per aiutare a quantificare la differenziazione lattogenica.

Topo cellule epiteliali mammarie forma Mammospheres durante la differenziazione lattogenica

Un semplice metodo è descritto per analizzare gli effetti di fibroblasti su tessuti associati cellule epiteliali. La combinazione di questo metodo e tridimensionale coltura tissutale può facilitare l'analisi di cellule dopo l'isolamento da 3D. La tecnica è applicabile a celle di varia potenziale maligno, consentendo studio sistematico di effetti di tumore-associato stroma sulle cellule tumorali.

Isolamento di cellule epiteliali mammarie da tridimensionale Mixed-cell Spheroid Co-cultura

Un metodo per elaborare materiale mammaria umana scarto chirurgica viene descritto. Tessuti trattati, in forma di organoidi, possono essere congelati indefinitamente o posto in coltura per crescita a lungo termine. Questo metodo consente esame sperimentale di biologia umana normale delle cellule epiteliali, e gli effetti delle perturbazioni esogene.

Elaborazione di mastoplastica riduttiva e tessuti umani mastectomia per coltura cellulare

Time-lapse imaging viene utilizzato per valutare il comportamento di primarie preneoplastiche cellule epiteliali mammarie derivate da modelli murini geneticamente modificati di rischio di cancro al seno per determinare se ci sono correlazioni tra i parametri specifici di comportamento e distinte lesioni genetiche.

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Negli ultimi anni la formazione di cellule germinali utilizzando metodi in coltura in vitro è stata dimostrata utilizzando diversi tipi di cellule staminali somatiche. Questo articolo presenta visivamente la differenziazione delle cellule staminali derivate topo neonato per primi cellule ovocita-like.

Differenziazione del neonato mouse pelle cellule staminali derivate in cellule germinali-simili<em&gt; In vitro</em

Il protocollo immunofluorescenza indiretta descritto in questo articolo consente il rilevamento e la localizzazione delle proteine ​​nella ghiandola mammaria del mouse. Un metodo completo è dato per la preparazione di campioni della ghiandola mammaria, per eseguire immunoistochimica, per l'immagine delle sezioni di tessuto al microscopio a fluorescenza, e di ricostruire le immagini.

Immunofluorescenza indiretta su sezioni congelate di mouse ghiandola mammaria

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Isolare le cellule staminali del follicolo pilifero e epidermico cheratinociti da pelle dorsale del mouse

Questo protocollo descrive metodi per purificare, quantificare e caratterizzare vescicole extracellulari (EVs) / esosomi da cellule epiteliali mammarie non aderenti / mesenchimali e per usarle per trasferire la capacità di formazione delle ghiandole mammarie alle cellule epiteliali mammarie luminali. EVs / esosomi derivati ​​da cellule epiteliali mammarie simili a stelo possono trasferire questa proprietà cellulare alle cellule che ingeriscono gli EV / esosomi.

Trasferimento di abilità di formazione del ghiandale mammario tra le cellule epiteliali basali del mammifero e le cellule luminescenti mammarie attraverso le vescicole / esosomi extracellulari

Gli organoid della prostata del topo rappresentano un contesto promettente per valutare i meccanismi che regolano la differenziazione. Questo documento descrive un approccio migliorato per stabilire gli organoidi della prostata e introduce metodi per (1) raccogliere il lisato proteico dagli organoidi e (2) fissare e macchiare gli organoidi per la microscopia confocale a cavalcatura completa.

Valutazione della capacità di differenziazione delle cellule epiteliali della prostata del topo utilizzando la cultura organoide

Questo protocollo sperimentale descrive l'isolamento dei BCSC da campioni di cellule e tessuti di cancro al seno, nonché i saggi in vitro e in vivo che possono essere utilizzati per valutare il fenotipo e la funzione del BCSC.

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Il presente studio riporta un protocollo più semplice, rapido ed economico per isolare e far crescere in modo efficiente le cellule epiteliali mammarie umane primarie (HMEC) da piccole quantità di tessuto mammario. Questo protocollo è adatto per la produzione rapida di HMEC primari sia per applicazioni di laboratorio che cliniche.

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Scopri le tecniche di induzione della differenziazione nelle linee cellulari epiteliali mammarie murine HC11 ed EpH4. Questo metodo consente di studiare la relazione tra differenziazione e trasformazione neoplastica per identificare nuove strategie terapeutiche contro il cancro.

Differenziazione delle cellule epiteliali del seno del topo HC11 e EpH4

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